Un modello murino clinicamente rilevante di fibrosi peritoneale mediante dialisato e cateteri

Riepilogo

I pazienti con grave fibrosi peritoneale hanno un'elevata morbilità e mortalità. Il meccanismo della fibrosi peritoneale non è chiaro. In questo studio, descriviamo un semplice modello murino sperimentale di fibrosi peritoneale indotta dall'iniezione di liquido di dialisi peritoneale.

Abstract

La fibrosi peritoneale può verificarsi in pazienti sottoposti a dialisi peritoneale (PD) e i pazienti con grave fibrosi peritoneale hanno un'elevata morbilità e mortalità. La peritonite, il liquido per dialisi peritoneale ad alto contenuto di glucosio e un lungo periodo di PD accelerano l'insorgenza della fibrosi peritoneale. Uno studio su animali della fibrosi peritoneale è necessario a causa dei limiti degli studi sull'uomo e in vitro . Tuttavia, la maggior parte dei modelli animali non imita le condizioni cliniche. Per studiare la fibrosi peritoneale, abbiamo sviluppato un modello murino clinicamente rilevante impiantando un catetere peritoneale e iniettando il 2,5% di liquido PD ad alto contenuto di glucosio più 20 mM di metilgliossale (MGO) nella cavità peritoneale ogni giorno per 21 giorni. L'impianto del catetere peritoneale evita la lesione peritoneale da aghi e imita i pazienti con PD clinica. La colorazione in immunofluorescenza ha mostrato che i miofibroblasti si accumulavano nel peritoneo fibrotico. Il gruppo sperimentale aveva un volume di ultrafiltrazione inferiore e una funzione di trasporto della membrana peritoneale (test di equilibrio peritoneale). In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato del modello.

Introduzione

La dialisi peritoneale (PD) è un tipo di terapia sostitutiva renale ricevuta da circa l'11% dei pazienti con malattia renale allo stadio terminale (ESRD)¹. Gli studi hanno riportato che la fibrosi peritoneale si sviluppa nei pazienti che ricevono PD². La sclerosi peritoneale incapsulante (EPS), una forma grave di fibrosi peritoneale, provoca un'elevata morbilità e mortalità³. I fattori di rischio della fibrosi peritoneale includono peritonite, liquido di dialisi peritoneale ad alto contenuto di glucosio, un lungo periodo di PD e fattori genetici⁴. Il meccanismo della fibrosi peritoneale coinvolge cambiamenti complessi nel microambiente peritoneale e la diafonia tra diversi tipi di cellule. Gli esperimenti in vitro e le osservazioni cliniche si limitano a fornire intuizioni meccanicistiche sulla fibrosi peritoneale e sono necessari modelli animali. Animali da esperimento come cani, conigli, maiali, ratti e topi sono solitamente utilizzati nella ricerca sulle malattie umane⁵, di cui i topi sono i più comunemente usati a causa dei vantaggi delle loro piccole dimensioni, del basso costo e della facilità di sperimentazione. Inoltre, cellule specifiche possono essere studiate in modelli di malattia di topi utilizzando tecniche di tracciamento del lignaggio.

Stabilire un modello animale adatto sarebbe utile per comprendere la fisiopatologia della fibrosi peritoneale. Idealmente, questo modello dovrebbe essere economico, essere facile da riprodurre e fornire la base del trattamento clinico per la fibrosi peritoneale.

I modelli animali attualmente disponibili di fibrosi peritoneale sono stabiliti con l'iniezione intra-peritoneale di liquido PD ad alto contenuto di glucosio al giorno per 28 giorni, clorexidina gluconato (CG) tre volte alla settimana per 3 settimane o una singola dose di ipoclorito di sodio ipoclorito ^6,7,8. Tuttavia, questi modelli hanno dei limiti. L'iniezione di liquido PD ad alto contenuto di glucosio, sebbene altamente rilevante per la pratica clinica, induce solo una lieve fibrosi peritoneale e non riesce a ricapitolare le condizioni cliniche della fibrosi peritoneale grave, come l'EPS. Il CG o l'ipoclorito possono indurre una grave fibrosi peritoneale che imita l'EPS attraverso lesioni chimiche⁹. Tuttavia, il CG e l'ipoclorito possono indurre lesioni peritoneali e fibrosi attraverso meccanismi diversi dal liquido PD ad alto contenuto di glucosio.

Questo studio descrive il protocollo per lo sviluppo di un modello murino di fibrosi peritoneale. In questo modello, viene inserito prima un catetere PD, quindi vengono eseguite iniezioni giornaliere di liquido PD ad alto contenuto di glucosio più metilgliossale (MGO) per 21 giorni. L'MGO è un prodotto tossico di degradazione del glucosio nel liquido PD e promuove la formazione di prodotti finali di glicazione avanzata, che inducono infiammazione e angiogenesi ^10,11. L'aggiunta di MGO al liquido PD ad alto contenuto di glucosio induce l'accumulo di miofibroblasti e favorisce la fibrosi peritoneale. Questo modello, quindi, imita le condizioni cliniche.

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Protocollo

Gli esperimenti sono stati approvati e condotti secondo il National Taiwan University College of Medicine e il College of Public Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutti i topi sono stati alloggiati sotto le cure standard.

1. Esperimento sugli animali

1. Utilizzare topi maschi e femmine C57BL/6 wild type (WT) di età superiore alle 11 settimane.
2. Preparare il materiale chirurgico, tra cui una porta in silicone per topi a 4 francesi, guanti, teli, cateteri, suture e aghi.
3. Impiantare la porta del mouse come segue:
   1. Anestetizzare i topi con ketamina/xilazina (100/10 mg/kg di peso corporeo) tramite iniezione sottocutanea.
      1. Controllare la frequenza respiratoria e la profondità dell'anestesia dei topi durante l'intervento chirurgico per garantire le condizioni di anestesia.
         NOTA: Se la frequenza respiratoria dei topi diventa rapida e breve, aggiungere il 20% della dose precedente.
   2. Posizionare i topi in posizione prona durante l'anestesia. Radere e pulire un'area di 2 cm x 3 cm sulla schiena sinistra per l'intervento chirurgico e disinfettare la pelle con iodio povidone.
   3. Praticare un'incisione di 1,5 cm nella pelle sul dorso sinistro.
   4. Sezionare con cura tra la pelle e il muscolo sulla schiena sinistra per creare uno spazio di 1 cm x 2 cm per impiantare la porta del topo.
   5. Praticare un piccolo foro sul muscolo posteriore sinistro.
   6. Inserire la parte distale totale a 4 francesi della porta del mouse nella cavità peritoneale
   7. Sutura (nylon 4-0) la radice della porta del mouse al muscolo posteriore.
   8. Metti la testa della porta del mouse tra la pelle e il muscolo della schiena.
   9. Chiudere la pelle con clip riflettenti (7 mm).
      NOTA: Le clip riflesse sono migliori delle suture perché i topi spesso mordono la ferita.
   10. Iniziare l'esperimento dopo 7 giorni dall'impianto della porta del topo. Dividi casualmente i topi in gruppi sperimentali e di controllo.
   11. Disinfettare la pelle nel sito di accesso con iodio povidone prima di iniettare il liquido.
   12. Iniettare il gruppo di liquido PD (PDF) con 2,5% di liquido PD e 20 mM di MGO in un totale di 2 mL per via intraperitoneale al giorno per 21 giorni. Iniettare il gruppo di controllo con soluzione fisiologica normale (NS).

2. Test di funzionalità peritoneale (test di equilibrio peritoneale)

1. Preparare il liquido PD al 2,5% (2 mL) e misurare la concentrazione di glucosio del fluido PD, definita come concentrazione iniziale di glucosio (D0).
2. Iniettare il fluido PD nella porta del mouse.
3. Dopo 30 minuti, sacrificare i topi tramite sovradosaggio di isoflurano (100%).
4. Raccogliere il liquido intra-addominale con una siringa, quindi misurare il volume del fluido, definito come volume di ultrafiltrazione.
5. Misurare la concentrazione di glucosio nel liquido intra-addominale, definita come la concentrazione finale di glucosio (D).
6. Calcolare l'equilibrio peritoneale o la funzione peritoneale¹².
   NOTA: Test di equilibrio peritoneale¹² = Concentrazione finale di glucosio nel fluido PD (D)/ Concentrazione iniziale di glucosio nel fluido PD (D0). La concentrazione di glucosio viene rilevata con il metodo dell'esochinasi con un analizzatore biochimico¹³.

3. Preparazione dei tessuti e analisi istologica

1. Raccogliere i tessuti peritoneali: parete addominale superiore destra (1 cm x 1 cm) e fegato. Fissare il tessuto peritoneale con paraformaldeide al 4% per 2 ore, quindi per una notte in soluzione di saccarosio al 18%⁷.
2. Preparare sezioni congelate di tessuto peritoneale spesse 4 μm ed eseguire l'analisi istologica come precedentemente pubblicato⁷.
3. Eseguire la colorazione in immunofluorescenza.
   1. Utilizzare anticorpi primari contro le seguenti proteine per l'immunomarcatura: actina muscolare liscia α (SMA; 2 ore, 1:200) per rilevare i miofibroblasti, citocheratina (2 ore, 1:200) per rilevare le cellule mesoteliali e 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (5 min, 1:1000) per rilevare i nuclei cellulari.
4. Esprimere i dati ottenuti in un formato appropriato.
   NOTA: In questo studio, i dati sono stati espressi come media ± SEM. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un software di analisi statistica appropriato (Table of Materials) e la significatività statistica è stata valutata mediante ANOVA unidirezionale o t-test.

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Risultati

È stata esaminata l'istologia del tessuto peritoneale, che ha dimostrato che la fibrosi peritoneale è stata indotta con successo nel gruppo liquido PD più MGO (PDF). La colorazione in immunofluorescenza del peritoneo viscerale della superficie epatica ha mostrato un maggiore accumulo di miofibroblasti nel peritoneo danneggiato del gruppo PDF rispetto al gruppo di controllo (Figura 1). Come mostrato nella Figura 2A, il gruppo ...

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Discussione

Il peritoneo ha un peritoneo viscerale e parietale, che copre gli organi addominali e le pareti addominali. È composto da un monostrato di cellule mesoteliali, uno strato sottomesoteliale, sierosa, fibroblasti, linfociti e proteine secrete¹⁴. La fibrosi peritoneale è la perdita e la denudazione delle cellule mesoteliali, l'ispessimento sottomesoteliale e l'accumulo di molte cellule infiammatorie, come i miofibroblasti e i macrofagi ^4...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-wide spectrum Cytokeratin antibody	abcam	ab9377
Beckman Coulter	Beckman Coulter	AU5800	Biochemical analyzer
DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole antibody	Sigma-Aldrich	98718-90-3
Drapes			any
FITC goat anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Secondary Antibody	111-095-144
Gloves			any
GraphPad Prizm	GraphPad Software	GraphPad Software 9.0
Kellys			any
Methylglyoxal (MGO)	Sigma-Aldrich
Mini-UTE Mouse Port	Access Technologies	MMP-4S 061108B	Mouse 4-French silicone port
Monoclonal anti-actin, α-smooth muscle-Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Needles			any
Reflex clips 7 mm			any
Suture 4-0 Nylon			any