Un modelo murino clínicamente relevante de fibrosis peritoneal por dializado y catéteres

Resumen

Los pacientes con fibrosis peritoneal grave tienen una alta morbilidad y mortalidad. El mecanismo de la fibrosis peritoneal no está claro. En este estudio, describimos un modelo murino experimental simple de fibrosis peritoneal inducida por la inyección de líquido de diálisis peritoneal.

Resumen

La fibrosis peritoneal puede ocurrir en pacientes sometidos a diálisis peritoneal (DP), y los pacientes con fibrosis peritoneal grave tienen una alta morbilidad y mortalidad. La peritonitis, el líquido de diálisis peritoneal con alto contenido de glucosa y un largo período de EP precipitan la aparición de la fibrosis peritoneal. Es necesario un estudio de la fibrosis peritoneal en animales debido a las limitaciones de los estudios en humanos e in vitro . Sin embargo, la mayoría de los modelos animales no imitan las condiciones clínicas. Para estudiar la fibrosis peritoneal, desarrollamos un modelo murino clínicamente relevante mediante la implantación de un catéter peritoneal y la inyección de líquido DP con alto contenido de glucosa al 2,5% más 20 mM de metilglioxal (MGO) en la cavidad peritoneal diariamente durante 21 días. El implante del catéter peritoneal evita la lesión peritoneal por agujas e imita a los pacientes clínicos con EP. La tinción con inmunofluorescencia mostró que los miofibroblastos se acumulaban en el peritoneo fibrótico. El grupo experimental presentó menor volumen de ultrafiltración y función de transporte de la membrana peritoneal (prueba de equilibrio peritoneal). En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado del modelo.

Introducción

La diálisis peritoneal (DP) es un tipo de terapia de reemplazo renal que reciben aproximadamente el 11% de los pacientes con enfermedad renal terminal (IRT)¹. Los estudios han reportado que la fibrosis peritoneal se desarrolla en pacientes que reciben PD². La esclerosis peritoneal encapsulante (EPS), una forma grave de fibrosis peritoneal, resulta en una alta morbilidad y mortalidad³. Los factores de riesgo de la fibrosis peritoneal incluyen peritonitis, líquido de diálisis peritoneal con alto contenido de glucosa, un largo período de DP y factores genéticos⁴. El mecanismo de la fibrosis peritoneal implica cambios complejos en el microambiente peritoneal y diafonía entre diferentes tipos de células. Los experimentos in vitro y las observaciones clínicas se limitan a proporcionar información mecanicista sobre la fibrosis peritoneal, y se necesitan modelos animales. Los animales de experimentación, como perros, conejos, cerdos, ratas y ratones, se utilizan generalmente en la investigación de enfermedades humanas⁵, de los cuales los ratones son los más utilizados debido a las ventajas de su pequeño tamaño, bajo costo y facilidad de experimentación. Además, se pueden estudiar células específicas en modelos de enfermedad de ratones utilizando técnicas de rastreo de linaje.

El establecimiento de un modelo animal adecuado sería útil para comprender la fisiopatología de la fibrosis peritoneal. Idealmente, este modelo debería ser barato, fácil de reproducir y proporcionar la base del tratamiento clínico para la fibrosis peritoneal.

Los modelos animales de fibrosis peritoneal disponibles en la actualidad se establecen con la inyección intraperitoneal de líquido DP con alto contenido de glucosa diariamente durante 28 días, gluconato de clorhexidina (CG) tres veces por semana durante 3 semanas, o una dosis única de hipoclorito de sodio^{hipoclorito 6,7,8}. Sin embargo, estos modelos tienen limitaciones. La inyección de líquido DP con alto contenido de glucosa, aunque muy relevante para la práctica clínica, induce solo una fibrosis peritoneal leve y no logra recapitular las condiciones clínicas de la fibrosis peritoneal grave, como el EPS. El CG o el hipoclorito pueden inducir fibrosis peritoneal severa que imita al EPS a través de lesiones químicas⁹. Sin embargo, el CG y el hipoclorito pueden inducir lesión peritoneal y fibrosis a través de diferentes mecanismos del líquido de DP con alto contenido de glucosa.

En este estudio se describe el protocolo para el desarrollo de un modelo murino de fibrosis peritoneal. En este modelo, primero se inserta un catéter de DP y luego se realizan inyecciones diarias de líquido de DP con alto contenido de glucosa más metilglioxal (MGO) durante 21 días. El MGO es un producto tóxico de degradación de la glucosa en el líquido de la EP y promueve la formación de productos finales de glicación avanzada, que inducen inflamación y angiogénesis^10,11. La adición de MGO al líquido de DP con alto contenido de glucosa induce la acumulación de miofibroblastos y promueve la fibrosis peritoneal. Este modelo, por lo tanto, imita las condiciones clínicas.

Protocolo

Los experimentos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina y la Facultad de Salud Pública de la Universidad Nacional de Taiwán. Todos los ratones fueron alojados bajo cuidados estándar.

1. Experimento con animales

1. Utilice ratones machos y hembras C57BL/6 de tipo salvaje (WT) de más de 11 semanas de edad.
2. Prepare los materiales quirúrgicos, incluido un puerto de silicona de 4 franceses, guantes, paños, catéteres, suturas y agujas.
3. Implante el puerto del mouse de la siguiente manera:
   1. Anestesiar a los ratones con ketamina/xilacina (100/10 mg/kg de peso corporal) mediante inyección subcutánea.
      1. Verifique la frecuencia respiratoria y la profundidad de la anestesia de los ratones durante la cirugía para garantizar las condiciones de anestesia.
         NOTA: Si la frecuencia respiratoria de los ratones se vuelve rápida y corta, agregue el 20% de la dosis anterior.
   2. Coloque a los ratones en posición prona durante la anestesia. Afeitar y limpiar un área de 2 cm x 3 cm en la espalda izquierda para la cirugía y desinfectar la piel con povidona yodada.
   3. Realice una incisión de 1,5 cm en la piel de la espalda izquierda.
   4. Diseccionar cuidadosamente entre la piel y el músculo de la espalda izquierda para crear un espacio de 1 cm x 2 cm para implantar el puerto del ratón.
   5. Perfora un pequeño agujero sobre el músculo de la espalda izquierda.
   6. Inserte la parte distal total de 4 franceses del puerto del ratón en la cavidad peritoneal
   7. Sutura (nylon 4-0): la raíz del puerto del ratón al músculo de la espalda.
   8. Coloque la cabeza del puerto del ratón entre la piel y el músculo de la espalda.
   9. Cierre la piel con pinzas reflectantes (7 mm).
      NOTA: Las pinzas reflectantes son mejores que las suturas porque los ratones a menudo muerden la herida.
   10. Inicie el experimento después de 7 días de la implantación del puerto del ratón. Divida aleatoriamente los ratones en grupos experimentales y de control.
   11. Desinfecte la piel en el sitio de acceso con povidona yodada antes de inyectar líquido.
   12. Inyecte el grupo de líquido de DP (PDF) con 2,5% de líquido de DP y 20 mM de MGO en un total de 2 mL intraperitoneal diariamente durante 21 días. Inyecte al grupo de control solución salina normal (NS).

2. Prueba de función peritoneal (prueba de equilibrio peritoneal)

1. Prepare líquido de DP al 2,5% (2 mL) y mida la concentración de glucosa del líquido de DP, definida como la concentración inicial de glucosa (D0).
2. Inyecte el líquido PD en el puerto del mouse.
3. Después de 30 minutos, sacrifique los ratones mediante una sobredosis de isoflurano (100%).
4. Recoja el líquido intraabdominal con una jeringa, luego mida el volumen de líquido, definido como el volumen de ultrafiltración.
5. Mide la concentración de glucosa del líquido intraabdominal, definida como la concentración final de glucosa (D).
6. Calcular el equilibrio peritoneal o la función peritoneal¹².
   NOTA: Prueba de equilibrio peritoneal¹² = Concentración final de glucosa en líquido (D) para la DP / Concentración inicial de glucosa en líquido para la DP (D0). La concentración de glucosa se detecta por el método de la hexoquinasa con un analizador bioquímico¹³.

3. Preparación de tejidos y análisis histológico

1. Recoger los tejidos peritoneales: pared abdominal superior derecha (1 cm x 1 cm) e hígado. Fijar el tejido peritoneal con paraformaldehído al 4% durante 2 h, luego durante la noche en solución de sacarosa al 18%⁷.
2. Preparar secciones congeladas de tejido peritoneal de 4 μm de espesor y realizar el análisis histológico según lo publicado anteriormente⁷.
3. Realizar tinción de inmunofluorescencia.
   1. Utilice anticuerpos primarios contra las siguientes proteínas para el inmunomarcaje: actina de músculo liso α (SMA; 2 h, 1:200) para detectar miofibroblastos, citoqueratina (2 h, 1:200) para la detección de células mesoteliales y 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (5 min, 1:1000) para detectar núcleos celulares.
4. Expresar los datos obtenidos en un formato adecuado.
   NOTA: En este estudio, los datos se expresaron como media ± SEM, los análisis estadísticos se realizaron utilizando un software de análisis estadístico adecuado (Tabla de Materiales) y la significación estadística se evaluó mediante ANOVA de un factor o prueba t.

Resultados

Se examinó la histología del tejido peritoneal, que mostró que la fibrosis peritoneal se indujo con éxito en el grupo de líquido DP más MGO (PDF). La tinción por inmunofluorescencia del peritoneo visceral de la superficie hepática mostró más acumulación de miofibroblastos en el peritoneo lesionado del grupo PDF que en el grupo control (Figura 1). Como se muestra en la Figura 2A, el grupo PDF tuvo un volumen de ultrafi...

Discusión

El peritoneo tiene un peritoneo visceral y parietal, que cubre los órganos abdominales y las paredes abdominales. Está compuesto por una monocapa de células mesoteliales, una capa submesotelial, serosa, fibroblastos, linfocitos y proteínas secretadas¹⁴. La fibrosis peritoneal es la pérdida y denudación de células mesoteliales, engrosamiento submesotelial y acumulación de muchas células inflamatorias, como miofibroblastos y macrófagos

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-wide spectrum Cytokeratin antibody	abcam	ab9377
Beckman Coulter	Beckman Coulter	AU5800	Biochemical analyzer
DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole antibody	Sigma-Aldrich	98718-90-3
Drapes			any
FITC goat anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Secondary Antibody	111-095-144
Gloves			any
GraphPad Prizm	GraphPad Software	GraphPad Software 9.0
Kellys			any
Methylglyoxal (MGO)	Sigma-Aldrich
Mini-UTE Mouse Port	Access Technologies	MMP-4S 061108B	Mouse 4-French silicone port
Monoclonal anti-actin, α-smooth muscle-Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Needles			any
Reflex clips 7 mm			any
Suture 4-0 Nylon			any