투석액과 카테터에 의한 복막 섬유증의 임상적으로 관련된 쥐 모델

요약

중증 복막 섬유증이 있는 환자는 이환율과 사망률이 높습니다. 복막 섬유증의 기전은 불분명하다. 이 연구에서는 복막 투석액 주입에 의해 유발된 복막 섬유증의 간단한 실험적 쥐 모델을 설명합니다.

초록

복막 섬유증은 복막 투석(PD)을 받는 환자에서 발생할 수 있으며, 중증 복막 섬유증 환자는 이환율과 사망률이 높습니다. 복막염, 고포도당 복막투석액, 장기간의 파킨슨병은 복막 섬유증의 발병을 촉진합니다. 복막 섬유증에 대한 동물 연구는 인간 및 체외 연구의 한계로 인해 필요합니다. 그러나 대부분의 동물 모델은 임상 상태를 모방하지 않습니다. 복막 섬유증을 연구하기 위해 복막 카테터를 이식하고 2.5% 고포도당 PD 수액과 20mM 메틸글리옥살(MGO)을 21일 동안 매일 복강에 주입하여 임상적으로 관련된 쥐 모델을 개발했습니다. 복막 카테터를 이식하면 바늘에 의한 복막 손상을 방지하고 임상 PD 환자를 모방합니다. 면역형광 염색은 근섬유아세포가 섬유성 복막에 축적되는 것을 보여주었습니다. 실험군은 한외여과량과 복막막 수송 기능이 더 낮았습니다(복막 평형 시험). 이 문서에서는 모델의 자세한 프로토콜을 제공합니다.

서문

복막 투석(PD)은 말기 신장 질환(ESRD) 환자의 약 11%가 받는 신장 대체 요법의 한 종류이다¹. 연구에 따르면 복막 섬유증은 PD²를 투여받은 환자에서 발생한다고 보고되었습니다. 심각한 형태의 복막 섬유증인 복막 경화증(EPS)은 높은 이환율과 사망률을 초래한다³. 복막 섬유증의 위험 요인으로는 복막염, 고포도당 복막 투석액, 장기간의 파킨슨병, 유전적 요인^{등이 있다 4}. 복막 섬유증의 메커니즘은 복막 미세환경의 복잡한 변화와 서로 다른 세포 유형 간의 혼선을 포함합니다. 체외 실험 및 임상 관찰은 복막 섬유증에 대한 기계론적 통찰력을 제공하는 데 국한되며 동물 모델이 필요합니다. 인간질병연구에는 개, 토끼, 돼지, 쥐, 생쥐 등의 실험동물이 주로^{사용되며5,} 그 중 생쥐는 크기가 작고, 비용이 저렴하며, 실험이 용이하다는 장점으로 인해 가장 일반적으로 사용된다. 또한, 계통 추적 기술을 사용하여 마우스의 질병 모델에서 특정 세포를 연구할 수 있습니다.

적절한 동물 모델을 확립하는 것은 복막 섬유증의 병태생리학을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이상적으로, 이 모델은 저렴하고, 재현이 쉬우며, 복막 섬유증에 대한 임상 치료의 기초를 제공해야 합니다.

현재 사용 가능한 복막 섬유증의 동물 모델은 28일 동안 매일 고포도당 PD 수액을 복강내 주사하고, 3주 동안 매주 3회 클로르헥시딘 글루코네이트(CG)를 주사하거나 차아염소산나트륨 차아염소산염 ^6,7,8을 1회 투여하여 확립되었습니다. 그러나 이러한 모델에는 한계가 있습니다. 고포도당 PD 수액의 주사는 임상 실습과 매우 관련이 있지만 경미한 복막 섬유증만 유발하고 EPS와 같은 심각한 복막 섬유증의 임상 상태를 재현하지 못합니다. CG 또는 차아염소산염은 화학적 손상을 통해 EPS를 모방한 심각한 복막 섬유증을 유발할 수 있다⁹. 그러나 CG와 차아염소산염은 고포도당 PD액과는 다른 메커니즘을 통해 복막 손상 및 섬유화를 유발할 수 있습니다.

이 연구는 복막 섬유증의 쥐 모델을 개발하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 모델에서는 PD 카테터를 먼저 삽입한 다음 21일 동안 고혈당 PD 수액과 메틸글리옥살(MGO)을 매일 주사합니다. MGO는 PD 유체의 독성 포도당 분해 산물이며 염증과 혈관 신생을 유도하는 고급 당화 최종 산물의 형성을 촉진합니다^10,11. 고포도당 PD 액체에 MGO를 추가하면 근섬유아세포의 축적을 유도하고 복막 섬유증을 촉진합니다. 따라서 이 모델은 임상 상태를 모방합니다.

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프로토콜

이 실험은 국립 대만 대학교 의과 대학 및 공중 보건 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 따라 승인 및 수행되었습니다. 모든 마우스는 표준 보살핌 하에 수용되었습니다.

1. 동물 실험

1. 생후 11주 이상의 수컷 및 암컷 C57BL/6 야생형(WT) 마우스를 사용하십시오.
2. 마우스 4-프렌치 실리콘 포트, 장갑, 커튼, 카테터, 봉합사 및 바늘을 포함한 수술 재료를 준비합니다.
3. 다음과 같이 마우스 포트를 이식합니다.
   1. 피하 주사를 통해 케타민/자일라진(체중 100/10mg/kg)으로 마우스를 마취합니다.
      1. 마취 상태를 확인하기 위해 수술 중 마우스의 호흡 속도와 마취 깊이를 확인하십시오.
         참고: 마우스의 호흡수가 빠르고 짧아지면 이전 용량의 20%를 추가하십시오.
   2. 마취 중에 마우스를 엎드린 자세로 놓습니다. 수술을 위해 왼쪽 등에서 2cm x 3cm 크기의 부위를 면도하고 청소하고 포비돈 요오드로 피부를 소독합니다.
   3. 왼쪽 등 피부를 1.5cm 절개합니다.
   4. 왼쪽 등의 피부와 근육 사이를 조심스럽게 절개하여 1cmx 2cm의 공간을 만들어 마우스 포트를 이식합니다.
   5. 왼쪽 등 근육에 작은 구멍을 뚫습니다.
   6. 마우스 포트의 총 4-프렌치 원위 부분을 복막강에 삽입합니다.
   7. 봉합사(4-0 나일론) 마우스 포트의 뿌리를 등 근육에 연결합니다.
   8. 마우스 포트의 머리를 피부와 등 근육 사이에 놓습니다.
   9. 반사 클립(7mm)으로 피부를 닫습니다.
      참고: 반사 클립은 생쥐가 상처를 무는 경우가 많기 때문에 봉합사보다 낫습니다.
   10. 마우스 포트 이식 7일 후 실험을 시작합니다. 마우스를 무작위로 실험 그룹과 통제 그룹으로 나눕니다.
   11. 액체를 주입하기 전에 포비돈 요오드로 접근 부위의 피부를 소독하십시오.
   12. PD 플루이드(PDF) 그룹에 2.5% PD 플루이드와 20mM MGO를 총 2mL씩 21일 동안 매일 복강내 주사합니다. 대조군에 생리식염수(NS)를 주입합니다.

2. 복막기능검사(복막평형검사)

1. 2.5% PD 수액(2mL)을 준비하고 초기 포도당 농도(D0)로 정의된 PD 수액의 포도당 농도를 측정합니다.
2. PD 유체를 마우스 포트에 주입합니다.
3. 30분 후, 이소플루란(100%) 과다 투여를 통해 마우스를 희생합니다.
4. 주사기로 복강 내 액체를 채취한 다음 한외여과 부피로 정의된 유체 부피를 측정합니다.
5. 최종 포도당 농도(D)로 정의되는 복강 내 액체의 포도당 농도를 측정합니다.
6. 복막 평형 또는 복막 기능^{계산 12}.
   알림: 복막 평형 테스트¹² = 최종 PD 유체 포도당 농도(D)/초기 PD 유체 포도당 농도(D0). 포도당 농도는 생화학 분석기¹³을 사용한 hexokinase 방법에 의해 검출됩니다.

3. 조직 준비 및 조직학적 분석

1. 복막 조직을 수집합니다 : 오른쪽 상복부 벽 (1cm x 1cm)과 간. 복막 조직을 4% 파라포름알데히드로 2시간 동안 고정한 다음 18% 자당 용액⁷에서 하룻밤 동안 고정합니다.
2. 복막 조직의 4μm 두께의 동결 절편을 준비하고 이전에 발표된 대로 조직학적 분석을 수행합니다⁷.
3. 면역형광 염색을 수행합니다.
   1. 면역 표지를 위해 다음 단백질에 대한 1차 항체를 사용합니다: 근섬유아세포 검출을 위한 α-평활근 액틴(SMA, 2시간, 1:200), 중피 세포 검출을 위한 사이토케라틴(2시간, 1:200), 세포핵 검출을 위한 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)(5분, 1:1000).
4. 얻은 데이터를 적절한 형식으로 표현합니다.
   참고: 이 연구에서 데이터는 평균 ± SEM으로 표현되었습니다. 통계 분석은 적절한 통계 분석 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 수행되었으며 통계적 유의성은 일원 분산 분석 또는 t-검정으로 평가되었습니다.

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결과

복막 조직의 조직학을 검사한 결과, PD 유체와 MGO(PDF) 그룹에서 복막 섬유화가 성공적으로 유도된 것으로 나타났습니다. 간 표면의 내장 복막의 면역형광 염색은 대조군보다 PDF군의 손상된 복막에서 더 많은 근섬유세포 축적을 보여주었습니다(그림 1). 그림 2A에서 볼 수 있듯이 PDF 그룹은 대조군보다 한외여과 부피가 낮았습니?...

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토론

복막에는 내장 및 두정엽 복막이 있어 복부 장기와 복벽을 덮고 있습니다. 그것은 중피 세포의 단층, 중피 하 층, 혈청 세포, 섬유 아세포, 림프구 및 분비 단백질로 구성됩니다¹⁴. 복막 섬유증은 중피 세포의 손실 및 탈락, 중피하 비후화, 근섬유아세포 및 대식세포와 같은 많은 염증 세포의 축적입니다 ^4,14.

...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-wide spectrum Cytokeratin antibody	abcam	ab9377
Beckman Coulter	Beckman Coulter	AU5800	Biochemical analyzer
DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole antibody	Sigma-Aldrich	98718-90-3
Drapes			any
FITC goat anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Secondary Antibody	111-095-144
Gloves			any
GraphPad Prizm	GraphPad Software	GraphPad Software 9.0
Kellys			any
Methylglyoxal (MGO)	Sigma-Aldrich
Mini-UTE Mouse Port	Access Technologies	MMP-4S 061108B	Mouse 4-French silicone port
Monoclonal anti-actin, α-smooth muscle-Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Needles			any
Reflex clips 7 mm			any
Suture 4-0 Nylon			any