透析液とカテーテルによる腹膜線維症の臨床的に関連性のあるマウスモデル

要約

重度の腹膜線維症の患者は、高い罹患率と死亡率を持っています。腹膜線維症のメカニズムは不明です。本研究では、腹膜透析液の注入によって誘発される腹膜線維症の簡単な実験マウスモデルについて述べる。

要約

腹膜線維症は、腹膜透析(PD)を受けている患者に発生する可能性があり、重度の腹膜線維症の患者は高い罹患率と死亡率を示します。腹膜炎、高グルコース腹膜透析液、および長期間のPDは、腹膜線維症の発症を促進します。腹膜線維症の動物実験は、ヒトおよび in vitro 研究の限界のために必要です。しかし、ほとんどの動物モデルは臨床症状を模倣していません。腹膜線維症を研究するために、腹膜カテーテルを埋め込み、2.5% 高グルコース PD 液と 20 mM メチルグリオキサール (MGO) を腹腔に 21 日間毎日注入することにより、臨床的に関連するマウス モデルを開発しました。腹膜カテーテルの埋め込みは、針による腹膜損傷を回避し、臨床PD患者を模倣します。免疫蛍光染色により、筋線維芽細胞が線維性腹膜に蓄積することが示されました。実験群は限外濾過量と腹膜輸送機能(腹膜平衡試験)が低かった。この記事では、モデルの詳細なプロトコルを提供します。

概要

腹膜透析(PD)は、末期腎疾患(ESRD)患者の約11%が受けている腎代替療法の一種です¹。^PD2を投与された患者では腹膜線維症が発症することが研究で報告されています。腹膜線維症の重篤な形態であるカプセル化性腹膜硬化症(EPS)は、高い罹患率と死亡率をもたらします³。腹膜線維症の危険因子には、腹膜炎、高グルコース腹膜透析液、長期のPD、および遺伝的要因が含まれます⁴。腹膜線維症のメカニズムには、腹膜微小環境の複雑な変化と、異なる細胞タイプ間のクロストークが含まれます。 in vitro 実験や臨床観察は、腹膜線維症の機構的な洞察を提供することに限定されており、動物モデルが必要です。ヒトの^{疾患研究5}では、通常、イヌ、ウサギ、ブタ、ラット、マウスなどの実験動物が用いられますが5、その中でもマウスは、小型で低コストで実験が容易であるという利点から、最も多く用いられています。さらに、系統追跡技術を用いて、マウスの疾患モデルにおいて特定の細胞を研究することができます。

適切な動物モデルを確立することは、腹膜線維症の病態生理を理解するのに役立ちます。理想的には、このモデルは安価で、再現が容易で、腹膜線維症の臨床治療の基礎を提供する必要があります。

現在利用可能な腹膜線維症の動物モデルは、高グルコース PD 液を毎日 28 日間、グルコン酸クロルヘキシジン (CG) を週 3 回 3 週間、または次亜塩素酸ナトリウム ^6,7,8 の腹腔内注射で確立されます。ただし、これらのモデルには制限があります。高グルコースPD液の注射は、臨床診療に非常に関連していますが、軽度の腹膜線維症のみを誘発し、EPSなどの重度の腹膜線維症の臨床状態を再現することはできません。CGまたは次亜塩素酸塩は、化学的損傷を通じてEPSを模倣する重度の腹膜線維症を誘発する可能性があります⁹。ただし、CGと次亜塩素酸塩は、高グルコースPD液とは異なるメカニズムを通じて腹膜損傷と線維症を引き起こす可能性があります。

この研究では、腹膜線維症のマウスモデルを開発するためのプロトコルについて説明します。このモデルでは、最初に PD カテーテルを挿入し、次に高グルコース PD 液とメチルグリオキサール (MGO) を毎日 21 日間注射します。MGOは、PD液中の毒性グルコース分解生成物であり、炎症と血管新生を誘発する進行糖化最終生成物の形成を促進します^10,11。高グルコースPD液にMGOを添加すると、筋線維芽細胞の蓄積が誘導され、腹膜線維症が促進されます。したがって、このモデルは臨床状態を模倣しています。

プロトコル

実験は、国立台湾大学医学部および公衆衛生大学動物施設管理委員会(IACUC)に従って承認および実施されました。すべてのマウスを標準治療下で飼育しました。

1. 動物実験

1. 生後11週以上の雄と雌のC57BL/6野生型(WT)マウスを使用してください。
2. マウス4フレンチシリコンポート、手袋、ドレープ、カテーテル、縫合糸、針などの手術材料を準備します。
3. 次のようにマウスポートを埋め込みます。
   1. 皮下注射により、マウスにケタミン/キシラジン (100/10 mg/kg 体重) を麻酔します。
      1. 手術中のマウスの呼吸数と麻酔の深さをチェックして、麻酔の状態を確認してください。
         注:マウスの呼吸数が急速で短くなった場合は、前の用量の20%を追加してください。.
   2. 麻酔中はマウスを腹臥位に置きます。手術のために左背中の2cm×3cmの部分を剃ってきれいにし、ポビドンヨードで皮膚を消毒します。
   3. 左背中の皮膚に1.5cmの切開をします。
   4. 左背中の皮膚と筋肉の間を慎重に解剖し、マウスポートを埋め込むための1cm×2cmのスペースを作ります。
   5. 左背中の筋肉に小さな穴を開けます。
   6. マウスポートの合計4フレンチ遠位部を腹腔に挿入します
   7. 縫合糸(4-0ナイロン)マウスポートの根元から背中の筋肉まで。
   8. マウスポートの頭を皮膚と背筋の間に置きます。
   9. 反射クリップ(7 mm)で皮膚を閉じます。
      注:反射クリップは、マウスが傷口を噛むことが多いため、縫合糸よりも優れています。
   10. マウスポート移植の7日後に実験を開始します。マウスを実験群と対照群にランダムに分けます。
   11. 液剤を注入する前に、アクセス部位の皮膚をポビドンヨードで消毒してください。
   12. PD液(PDF)群に2.5%PD液と20mM MGOを合計2mLで毎日腹腔内に21日間注入します。対照群に生理食塩水(NS)を注入します。

2. 腹膜機能試験(腹膜平衡試験)

1. 2.5% PD液(2 mL)を調製し、PD液のグルコース濃度(初期グルコース濃度(D0)として定義)を測定します。
2. PD液をマウスポートに注入します。
3. 30分後、イソフルラン(100%)の過剰摂取によりマウスを犠牲にします。.
4. シリンジで腹腔内液を採取し、限外ろ過量として定義される体液量を測定します。
5. 腹腔内液のグルコース濃度を測定し、最終グルコース濃度 (D) として定義します。
6. 腹膜平衡または腹膜機能^{を計算します12}。
   注: 腹膜平衡試験¹² = 最終 PD 液糖濃度 (D)/初期 PD 液糖値 (D0)。グルコース濃度は、生化学分析装置¹³を用いてヘキソキナーゼ法により検出される。

3. 組織調製と組織学的解析

1. 腹膜組織を採取します:右上腹部壁(1 cm x 1 cm)と肝臓。腹膜組織を4%パラホルムアルデヒドで2時間固定し、次いで18%ショ糖溶液⁷で一晩固定する。
2. 腹膜組織の4 μmの厚さの凍結切片を調製し、以前に発表された⁷と同様に組織学的分析を行います。
3. 免疫蛍光染色を行います。
   1. 免疫標識には、α-平滑筋アクチン(SMA;2時間、1:200)、中皮細胞の検出にサイトケラチン(2時間、1:200)、細胞核の検出に4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(5分、1:1000)のタンパク質に対する一次抗体を使用します。
4. 取得したデータを適切な形式で表現します。
   この研究では、データはSEM±平均として表され、統計分析は適切な統計分析ソフトウェア(Table of Materials)を使用して実施され、統計的有意性は一元配置ANOVAまたはt検定によって評価されました。

結果

腹膜組織の組織型を調べたところ、PD液とMGO(PDF)群で腹膜線維症が成功裏に誘発されたことが示されました。肝臓表面の内臓腹膜の免疫蛍光染色では、PDF群の損傷した腹膜に、対照群よりも多くの筋線維芽細胞の蓄積が示されました(図1)。図 2A に示すように、PDF 群の限外濾過量は対照群よりも少なかった。...

ディスカッション

腹膜には内臓腹膜と頭頂腹膜があり、腹部の臓器と腹壁を覆っています。これは、中皮細胞の単層、中皮下層、漿体、線維芽細胞、リンパ球、および分泌タンパク質¹⁴で構成されています。腹膜線維症は、中皮細胞の喪失と剥離、中皮下肥厚、および筋線維芽細胞やマクロファージなどの多くの炎症細胞の蓄積です^4,14

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-wide spectrum Cytokeratin antibody	abcam	ab9377
Beckman Coulter	Beckman Coulter	AU5800	Biochemical analyzer
DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole antibody	Sigma-Aldrich	98718-90-3
Drapes			any
FITC goat anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Secondary Antibody	111-095-144
Gloves			any
GraphPad Prizm	GraphPad Software	GraphPad Software 9.0
Kellys			any
Methylglyoxal (MGO)	Sigma-Aldrich
Mini-UTE Mouse Port	Access Technologies	MMP-4S 061108B	Mouse 4-French silicone port
Monoclonal anti-actin, α-smooth muscle-Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Needles			any
Reflex clips 7 mm			any
Suture 4-0 Nylon			any