Um modelo murino clinicamente relevante de fibrose peritoneal por dialisado e cateteres

Resumo

Pacientes com fibrose peritoneal grave apresentam alta morbidade e mortalidade. O mecanismo da fibrose peritoneal não é claro. Neste estudo, descrevemos um modelo murino experimental simples de fibrose peritoneal induzida pela injeção de fluido de diálise peritoneal.

Resumo

A fibrose peritoneal pode ocorrer em pacientes submetidos à diálise peritoneal (DP), e pacientes com fibrose peritoneal grave apresentam alta morbidade e mortalidade. Peritonite, fluido de diálise peritoneal com alto teor de glicose e um longo período de DP precipitam o início da fibrose peritoneal. Um estudo animal da fibrose peritoneal é necessário devido às limitações dos estudos em humanos e in vitro . No entanto, a maioria dos modelos animais não mimetiza condições clínicas. Para estudar a fibrose peritoneal, desenvolvemos um modelo murino clinicamente relevante implantando um cateter peritoneal e injetando 2,5% de fluido de DP com alto teor de glicose mais 20 mM de metilglioxal (MGO) na cavidade peritoneal diariamente por 21 dias. O implante do cateter peritoneal evita lesões peritoneais por agulhas e mimetiza pacientes clínicos com DP. A coloração por imunofluorescência mostrou que os miofibroblastos se acumularam no peritônio fibrótico. O grupo experimental apresentou menor volume de ultrafiltração e função de transporte da membrana peritoneal (teste de equilíbrio peritoneal). Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado do modelo.

Introdução

A diálise peritoneal (DP) é um tipo de terapia renal substitutiva recebida por cerca de 11% dos pacientes com doença renal terminal (DRT)¹. Estudos relataram que a fibrose peritoneal se desenvolve em pacientes que recebem DP². A esclerose peritoneal encapsulante (EEF), uma forma grave de fibrose peritoneal, resulta em alta morbidade e mortalidade³. Os fatores de risco da fibrose peritoneal incluem peritonite, líquido de diálise peritoneal com alto teor de glicose, longo período de DP e fatores genéticos⁴. O mecanismo da fibrose peritoneal envolve mudanças complexas no microambiente peritoneal e crosstalk entre diferentes tipos de células. Experimentos in vitro e observações clínicas são limitados a fornecer insights mecanicistas sobre fibrose peritoneal, e modelos animais são necessários. Animais experimentais como cães, coelhos, porcos, ratos e camundongos são geralmente usados em pesquisas de doenças humanas⁵, dos quais os camundongos são os mais comumente usados devido às vantagens de seu pequeno tamanho, baixo custo e facilidade de experimentação. Além disso, células específicas podem ser estudadas em modelos de doenças de camundongos usando técnicas de rastreamento de linhagem.

Estabelecer um modelo animal adequado seria útil para entender a fisiopatologia da fibrose peritoneal. Idealmente, esse modelo deve ser barato, de fácil reprodução e fornecer a base do tratamento clínico para fibrose peritoneal.

Os modelos animais de fibrose peritoneal atualmente disponíveis são estabelecidos com a injeção intraperitoneal de fluido de DP com alto teor de glicose diariamente por 28 dias, gluconato de clorexidina (CG) três vezes por semana por 3 semanas ou uma dose única de hipoclorito de sódio^{hipoclorito 6,7,8}. No entanto, esses modelos têm limitações. A injeção de fluido de DP com alto teor de glicose, embora altamente relevante para a prática clínica, induz apenas fibrose peritoneal leve e não recapitula as condições clínicas de fibrose peritoneal grave, como o EPS. CG ou hipoclorito podem induzir fibrose peritoneal grave mimetizando EPS por meio de lesão química⁹. No entanto, o CG e o hipoclorito podem induzir lesão peritoneal e fibrose por diferentes mecanismos do fluido de DP com alto teor de glicose.

Este estudo descreve o protocolo para o desenvolvimento de um modelo murino de fibrose peritoneal. Nesse modelo, um cateter de DP é inserido primeiro e, em seguida, injeções diárias de fluido de DP com alto teor de glicose mais metilglioxal (MGO) são realizadas por 21 dias. O MGO é um produto tóxico de degradação da glicose no fluido da DP e promove a formação de produtos finais de glicação avançada, que induzem inflamação e angiogênese^10,11. A adição de MGO ao fluido de DP com alto teor de glicose induz o acúmulo de miofibroblastos e promove fibrose peritoneal. Esse modelo, portanto, mimetiza condições clínicas.

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Protocolo

Os experimentos foram aprovados e conduzidos de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Taiwan e da Faculdade de Saúde Pública (IACUC). Todos os ratos foram alojados sob cuidados padrão.

1. Experiência animal

1. Use camundongos C57BL / 6 machos e fêmeas do tipo selvagem (WT) com mais de 11 semanas de idade.
2. Prepare os materiais cirúrgicos, incluindo uma porta de silicone 4-french de camundongo, luvas, cortinas, cateteres, suturas e agulhas.
3. Implante a porta do mouse da seguinte maneira:
   1. Anestesiar os camundongos com cetamina / xilazina (100/10 mg / kg de peso corporal) por meio de injeção subcutânea.
      1. Verifique a frequência respiratória e a profundidade da anestesia dos camundongos durante a cirurgia para garantir as condições de anestesia.
         NOTA: Se a frequência respiratória dos camundongos se tornar rápida e curta, adicione 20% da dose anterior.
   2. Coloque os camundongos em decúbito ventral durante a anestesia. Faça a barba e limpe uma área de 2 cm x 3 cm de tamanho nas costas esquerdas para cirurgia e desinfete a pele com iodopovidona.
   3. Faça uma incisão de 1,5 cm na pele do dorso esquerdo.
   4. Disseque cuidadosamente entre a pele e o músculo nas costas esquerdas para criar um espaço de 1 cmx 2 cm para implantar a porta do mouse.
   5. Perfure um pequeno orifício sobre o músculo das costas esquerdas.
   6. Insira a parte distal total de 4 franceses da porta do mouse na cavidade peritoneal
   7. Sutura (nylon 4-0) a raiz da porta do mouse para o músculo das costas.
   8. Coloque a cabeça da porta do mouse entre a pele e o músculo das costas.
   9. Feche a pele com clipes reflexos (7 mm).
      NOTA: Os clipes reflexos são melhores do que as suturas porque os ratos costumam morder a ferida.
   10. Inicie o experimento após 7 dias da implantação da porta do camundongo. Divida aleatoriamente os camundongos em grupos experimentais e de controle.
   11. Desinfete a pele no local de acesso com iodopovidona antes de injetar fluido.
   12. Injete o grupo de fluido de DP (PDF) com 2,5% de fluido de DP e 20 mM de MGO em um total de 2 mL intraperitonealmente diariamente por 21 dias. Injete o grupo controle com solução salina normal (NS).

2. Teste de função peritoneal (teste de equilíbrio peritoneal)

1. Prepare o fluido de DP a 2,5% (2 mL) e meça a concentração de glicose do fluido de DP, definida como concentração inicial de glicose (D0).
2. Injete o fluido PD na porta do mouse.
3. Após 30 minutos, sacrifique os camundongos por meio de overdose de isoflurano (100%).
4. Colete o líquido intra-abdominal com uma seringa e, em seguida, meça o volume do fluido, definido como o volume de ultrafiltração.
5. Meça a concentração de glicose do líquido intra-abdominal, definida como a concentração final de glicose (D).
6. Calcule o equilíbrio peritoneal ou a função peritoneal¹².
   NOTA: Teste de equilíbrio peritoneal¹² = Concentração final de glicose fluida PD (D)/ Concentração inicial de glicose fluida PD (D0). A concentração de glicose é detectada pelo método da hexoquinase com um analisador bioquímico¹³.

3. Preparo de tecidos e análise histológica

1. Colete os tecidos peritoneais: parede abdominal superior direita (1 cm x 1 cm) e fígado. Fixar o tecido peritoneal com paraformaldeído a 4% por 2 h e, durante a noite, em solução de sacarose a 18%⁷.
2. Prepare cortes congelados de 4 μm de espessura de tecido peritoneal e faça a análise histológica conforme publicado anteriormente⁷.
3. Realize a coloração por imunofluorescência.
   1. Use anticorpos primários contra as seguintes proteínas para imunomarcação: actina de músculo liso α (SMA; 2 h, 1:200) para detecção de miofibroblastos, citoqueratina (2 h, 1:200) para detecção de células mesoteliais e 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (5 min, 1:1000) para detecção de núcleos celulares.
4. Exprimir os dados obtidos num formato adequado.
   NOTA: Neste estudo, os dados foram expressos como média ± EPM. As análises estatísticas foram realizadas usando software de análise estatística apropriado (Tabela de Materiais), e a significância estatística foi avaliada por ANOVA de uma via ou teste t.

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Resultados

A histologia do tecido peritoneal foi examinada, o que mostrou que a fibrose peritoneal foi induzida com sucesso no grupo PD fluido mais MGO (PDF). A coloração por imunofluorescência do peritônio visceral da superfície hepática mostrou maior acúmulo de miofibroblastos no peritônio lesado do grupo PDF do que no grupo controle (Figura 1). Conforme mostrado na Figura 2A, o grupo PDF apresentou um volume de ultrafiltração ...

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Discussão

O peritônio tem um peritônio visceral e parietal, cobrindo os órgãos abdominais e as paredes abdominais. É composto por uma monocamada de células mesoteliais, uma camada submesotelial, serosa, fibroblastos, linfócitos e proteínas secretadas¹⁴. A fibrose peritoneal é a perda e desnudamento de células mesoteliais, espessamento submesotelial e acúmulo de muitas células inflamatórias, como miofibroblastos e macrófagos ^4,14

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-wide spectrum Cytokeratin antibody	abcam	ab9377
Beckman Coulter	Beckman Coulter	AU5800	Biochemical analyzer
DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole antibody	Sigma-Aldrich	98718-90-3
Drapes			any
FITC goat anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Secondary Antibody	111-095-144
Gloves			any
GraphPad Prizm	GraphPad Software	GraphPad Software 9.0
Kellys			any
Methylglyoxal (MGO)	Sigma-Aldrich
Mini-UTE Mouse Port	Access Technologies	MMP-4S 061108B	Mouse 4-French silicone port
Monoclonal anti-actin, α-smooth muscle-Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Needles			any
Reflex clips 7 mm			any
Suture 4-0 Nylon			any