JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לחולים עם פיברוזיס צפקי חמור יש תחלואה ותמותה גבוהים. המנגנון של פיברוזיס פריטונאלי אינו ברור. במחקר זה, אנו מתארים מודל עכברי ניסיוני פשוט של פיברוזיס פריטונאלי המושרה על ידי הזרקת נוזל דיאליזה פריטונאלי.

Abstract

פיברוזיס פריטונאלי יכול להופיע בחולים העוברים דיאליזה פריטונאלית (PD), ולחולים עם פיברוזיס פריטונאלי חמור יש תחלואה ותמותה גבוהים. דלקת הצפק, נוזל דיאליזה פריטונאלי עתיר גלוקוז ותקופה ארוכה של מחלת פרקינסון מזרזים את הופעת פיברוזיס הצפק. יש צורך במחקר בבעלי חיים של פיברוזיס פריטונאלי בשל המגבלות של מחקרים בבני אדם ובמחקרי מבחנה . עם זאת, רוב המודלים של בעלי חיים אינם מחקים מצבים קליניים. כדי לחקור פיברוזיס פריטונאלי, פיתחנו מודל עכברי רלוונטי מבחינה קלינית על ידי השתלת קטטר פריטונאלי והזרקת 2.5% נוזל PD עתיר גלוקוז בתוספת 20 מ"מ מתילגליוקסל (MGO) לחלל הצפק מדי יום למשך 21 יום. השתלת צנתר הצפק מונעת פגיעה צפקית על ידי מחטים ומחקה חולי פרקינסון קליניים. צביעה אימונופלואורסצנטית הראתה כי מיופיברובלסטים הצטברו בצפק הפיברוטי. לקבוצת הניסוי היה נפח אולטרה-סינון נמוך יותר ותפקוד הובלת קרום הצפק (מבחן שיווי משקל צפק). במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של המודל.

Introduction

דיאליזה פריטונאלית (PD) היא סוג אחד של טיפול בתחליפי כליה המקבלים כ-11% מחולי מחלת כליות סופנית (ESRD)1. מחקרים דיווחו כי פיברוזיס צפקי מתפתח בחולים עם PD2. עטיפת טרשת הצפק (EPS), צורה חמורה של פיברוזיס צפק, גורמת לתחלואה ותמותה גבוהים3. גורמי הסיכון לפיברוזיס פריטונאלי כוללים דלקת הצפק, נוזל דיאליזה פריטונאלי עם גלוקוז גבוה, תקופה ארוכה של מחלת פרקינסון וגורמים גנטיים4. המנגנון של פיברוזיס פריטונאלי כרוך בשינויים מורכבים במיקרו-סביבה הצפק ודיבור צולב בין סוגי תאים שונים. ניסויים במבחנה ותצפיות קליניות מוגבלים לספק תובנות מכניסטיות לגבי פיברוזיס צפק, ויש צורך במודלים של בעלי חיים. חיות ניסוי כגון כלבים, ארנבות, חזירים, חולדות ועכברים משמשות בדרך כלל במחקר מחלות אנושיות5, כאשר עכברים הם הנפוצים ביותר בשל היתרונות של גודלם הקטן, עלותם הנמוכה וקלות הניסויים. יתר על כן, ניתן לחקור תאים ספציפיים במודלים של מחלות של עכברים באמצעות טכניקות מעקב אחר שושלת.

הקמת מודל מתאים לבעלי חיים תועיל בהבנת הפתופיזיולוגיה של פיברוזיס צפקית. באופן אידיאלי, מודל זה צריך להיות זול, קל לשחזור ולספק את הבסיס לטיפול קליני בפיברוזיס צפק.

מודלים בבעלי חיים הזמינים כיום של פיברוזיס צפקי מבוססים על הזרקה תוך-צפקית של נוזל פרקינסון עתיר גלוקוז מדי יום למשך 28 ימים, כלורהקסידין גלוקונאט (CG) שלוש פעמים בשבוע למשך 3 שבועות, או מנה אחת של נתרן היפוכלוריט היפוכלוריט 6,7,8. עם זאת, למודלים אלה יש מגבלות. הזרקת נוזל פרקינסון עתיר גלוקוז, למרות שהיא רלוונטית מאוד לפרקטיקה הקלינית, גורמת לפיברוזיס פריטונאלי קל בלבד ואינה מצליחה לסכם את התנאים הקליניים של פיברוזיס צפקי חמור, כגון EPS. CG או היפוכלוריט יכולים לגרום לפיברוזיס פריטונאלי חמור המחקה EPS באמצעות פגיעה כימית9. עם זאת, CG והיפוכלוריט עלולים לגרום לפגיעה צפקית ופיברוזיס באמצעות מנגנונים שונים מנוזל PD עתיר גלוקוז.

מחקר זה מתאר את הפרוטוקול לפיתוח מודל עכברי של פיברוזיס צפק. במודל זה מוחדר תחילה קטטר למחלת פרקינסון, ולאחר מכן מבוצעות הזרקות יומיות של נוזל פרקינסון עתיר גלוקוז בתוספת מתילגליוקסל (MGO) למשך 21 יום. MGO הוא מוצר רעיל לפירוק גלוקוז בנוזל פרקינסון, והוא מקדם היווצרות של תוצרי גליקציה מתקדמים, הגורמים לדלקת ואנגיוגנזה10,11. תוספת של MGO לנוזל PD בעל גלוקוז גבוה גורמת להצטברות של מיופיברובלסטים ומקדמת פיברוזיס צפקית. מודל זה, אם כן, מחקה מצבים קליניים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הניסויים אושרו ונערכו על פי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טייוואן הלאומית והמכללה לבריאות הציבור (IACUC). כל העכברים שוכנו תחת טיפול סטנדרטי.

1. ניסויים בבעלי חיים

  1. השתמש בעכברים זכרים ונקבות C57BL/6 מסוג בר (WT) מעל גיל 11 שבועות.
  2. הכן את חומרי הניתוח, כולל יציאת סיליקון 4-צרפתית לעכבר, כפפות, וילונות, קטטרים, תפרים ומחטים.
  3. השתל את יציאת העכבר באופן הבא:
    1. להרדים את העכברים עם קטמין/קסילזין (100/10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) באמצעות הזרקה תת עורית.
      1. בדוק את קצב הנשימה ועומק ההרדמה של העכברים במהלך הניתוח כדי להבטיח את תנאי ההרדמה.
        הערה: אם קצב הנשימה של העכברים הופך מהיר וקצר, הוסף 20% מהמינון הקודם.
    2. הנח את העכברים במצב נוטה במהלך ההרדמה. לגלח ולנקות אזור בגודל 2 ס"מ על 3 ס"מ בגב שמאל לניתוח ולחטא את העור עם פובידון-יוד.
    3. בצע חתך של 1.5 ס"מ בעור בגב שמאל.
    4. נתח בזהירות בין העור לשריר בגב שמאל כדי ליצור מרווח של 1 ס"מ על 2 ס"מ להשתלת יציאת העכבר.
    5. חורר חור קטן מעל שריר המגן השמאלי.
    6. הכנס את החלק הדיסטלי הכולל של יציאת העכבר לחלל הצפק
    7. תפר (4-0 ניילון) את שורש יציאת העכבר לשריר האחורי.
    8. הנח את ראש יציאת העכבר בין העור לשריר הגב.
    9. סגור את העור בעזרת קליפס רפלקס (7 מ"מ).
      הערה: קליפס רפלקס עדיף על תפרים מכיוון שעכברים נושכים לעתים קרובות את הפצע.
    10. התחל את הניסוי לאחר 7 ימים של השתלת יציאת עכבר. חלקו באופן אקראי את העכברים לקבוצות ניסוי וביקורת.
    11. יש לחטא את העור באתר הגישה עם פובידון-יוד לפני הזרקת נוזל.
    12. יש להזריק לקבוצת PD (PDF) 2.5% נוזל PD ו-20 מ"מ MGO בסך הכל 2 מ"ל תוך צפקי מדי יום למשך 21 יום. הזריק לקבוצת הביקורת מי מלח רגילים (NS).

2. בדיקת תפקוד הצפק (בדיקת שיווי משקל צפק)

  1. יש להכין 2.5% נוזל פרקינסון (2 מ"ל) ולמדוד את ריכוז הגלוקוז בנוזל פרקינסון, המוגדר כריכוז גלוקוז ראשוני (D0).
  2. הזרקו את נוזל ה-PD ליציאת העכבר.
  3. לאחר 30 דקות, הקריבו את העכברים באמצעות מנת יתר של איזופלורן (100%).
  4. אוספים את הנוזל התוך בטני בעזרת מזרק, ואז מודדים את נפח הנוזל, המוגדר כנפח האולטרה-סינון.
  5. מדוד את ריכוז הגלוקוז בנוזל התוך בטני, המוגדר כריכוז הגלוקוז הסופי (D).
  6. חשב את שיווי המשקל הצפק או פונקציית הצפק12.
    הערה: בדיקת שיווי משקל פריטונאלי12 = ריכוז הגלוקוז הסופי בנוזל PD (D) / ריכוז הגלוקוז הראשוני בנוזל PD (D0). ריכוז הגלוקוז מזוהה בשיטת הקסוקינאז עם מנתח ביוכימי13.

3. הכנת רקמות וניתוח היסטולוגי

  1. אוספים את רקמות הצפק: דופן הבטן העליונה הימנית (1 ס"מ על 1 ס"מ) והכבד. תקן את רקמת הצפק עם 4% פרפורמלדהיד למשך שעתיים, ולאחר מכן למשך הלילה בתמיסת סוכרוז 18%7.
  2. הכן חלקים קפואים בעובי 4 מיקרומטר של רקמת הצפק ובצע ניתוח היסטולוגי כפי שפורסם בעבר7.
  3. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית.
    1. השתמש בנוגדנים ראשוניים כנגד החלבונים הבאים לתיוג חיסוני: אקטין שריר חלק α (SMA; 2 שעות, 1:200) לזיהוי מיופיברובלסטים, ציטוקרטין (2 שעות, 1:200) לזיהוי תאים מזותליים, ו-4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (5 דקות, 1:1000) לזיהוי גרעיני תאים.
  4. בטא את הנתונים שהתקבלו בפורמט מתאים.
    הערה: במחקר זה, הנתונים בוטאו כממוצע ± SEM. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית מתאימה (טבלת חומרים), והמובהקות הסטטיסטית הוערכה על ידי ANOVA חד כיווני או מבחן t.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

נבדקה ההיסטולוגיה של רקמת הצפק, שהראתה כי פיברוזיס פריטונאלי הושרה בהצלחה בקבוצת נוזל פרקינסון פלוס MGO (PDF). צביעה אימונופלואורסצנטית של הצפק הקרביים של פני הכבד הראתה יותר הצטברות מיופיברובלסטים בצפק הפגוע של קבוצת ה-PDF מאשר בקבוצת הביקורת (איור 1). כפי שמ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לצפק יש צפק קרביים ופריאטלי, המכסה את איברי הבטן ודפנות הבטן. הוא מורכב משכבה חד-שכבתית של תאים מזותליים, שכבה תת-מזותלית, סרוזה, פיברובלסטים, לימפוציטים וחלבונים מופרשים14. פיברוזיס פריטונאלי הוא אובדן והידלדלות של תאים מזותליים, עיבוי תת-מזותליאלי והצטברות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי בית החולים האוניברסיטאי הלאומי של טייוואן (NTUH) 111-UN0026.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-wide spectrum Cytokeratin antibodyabcamab9377
Beckman CoulterBeckman CoulterAU5800Biochemical analyzer
DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole antibodySigma-Aldrich98718-90-3
Drapesany
FITC goat anti-rabbitJackson ImmunoResearch Secondary Antibody111-095-144
Glovesany
GraphPad PrizmGraphPad SoftwareGraphPad Software 9.0
Kellysany
Methylglyoxal (MGO)Sigma-Aldrich
Mini-UTE Mouse PortAccess TechnologiesMMP-4S 061108BMouse 4-French silicone port
Monoclonal anti-actin, α-smooth muscle-Cy3 antibodySigma-AldrichC6198
Needlesany
Reflex clips 7 mmany
Suture 4-0 Nylonany

References

  1. Jain, A. K., Blake, P., Cordy, P., Garg, A. X. Global trends in rates of peritoneal dialysis. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 533-544 (2012).
  2. Zhou, Q., Bajo, M. A., Del Peso, G., Yu, X., Selgas, R. Preventing peritoneal membrane fibrosis in peritoneal dialysis patients. Kidney International. 90 (3), 515-524 (2016).
  3. Brown, M. C., Simpson, K., Kerssens, J. J., Mactier, R. A. Scottish Renal Registry. Encapsulating peritoneal sclerosis in the new millennium: A national cohort study. ClinicalJournal of the American Society of Nephrology. 4 (7), 1222-1229 (2009).
  4. Aroeira, L. S., et al. Epithelial to mesenchymal transition and peritoneal membrane failure in peritoneal dialysis patients: Pathologic significance and potential therapeutic interventions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2004-2013 (2007).
  5. Yang, B., et al. Experimental models in peritoneal dialysis (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (3), 240(2021).
  6. Pawlaczyk, K., et al. Animal models of peritoneal dialysis: Thirty Years of our own experience. BioMed Research International. 2015, 261813(2015).
  7. Chen, Y. T., et al. Lineage tracing reveals distinctive fates for mesothelial cells and submesothelial fibroblasts during peritoneal injury. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (12), 2847-2858 (2014).
  8. Yokoi, H., et al. Pleiotrophin triggers inflammation and increased peritoneal permeability leading to peritoneal fibrosis. Kidney International. 81 (2), 160-169 (2012).
  9. Hoff, C. M. Experimental animal models of encapsulating peritoneal sclerosis. Peritoneal Dialysis International. 25, Suppl 4 57-66 (2005).
  10. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (2), 437-447 (2009).
  11. Nagai, T., et al. Linagliptin ameliorates methylglyoxal-induced peritoneal fibrosis in mice. PLoS One. 11 (8), 0160993(2016).
  12. Kakuta, T., et al. Pyridoxamine improves functional, structural, and biochemical alterations of peritoneal membranes in uremic peritoneal dialysis rats. Kidney International. 68 (3), 1326-1336 (2005).
  13. Barthelmai, W., Czok, R. Enzymatic determinations of glucose in the blood, cerebrospinal fluid and urine. Klinische Wochenschrift. 40, 585-589 (1962).
  14. Williams, J. D., et al. Morphologic changes in the peritoneal membrane of patients with renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (2), 470-479 (2002).
  15. Hurst, S. M., et al. Il-6 and its soluble receptor orchestrate a temporal switch in the pattern of leukocyte recruitment seen during acute inflammation. Immunity. 14 (6), 705-714 (2001).
  16. Pawlaczyk, K., et al. Vascular endothelial growth factor in dialysate in relation to intensity of peritoneal inflammation. The International Journal of Artificial Organs. 31 (6), 535-544 (2008).
  17. Loureiro, J., et al. Blocking TGF-beta1 protects the peritoneal membrane from dialysate-induced damage. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (9), 1682-1695 (2011).
  18. Margetts, P. J., et al. Transforming growth factor beta-induced peritoneal fibrosis is mouse strain dependent. Nephrology, Dialysis Transplantation. 28 (8), 2015-2027 (2013).
  19. Huang, J. W., et al. Tamoxifen downregulates connective tissue growth factor to ameliorate peritoneal fibrosis. Blood Purification. 31 (4), 252-258 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved