JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Şiddetli peritoneal fibrozisli hastalar yüksek morbidite ve mortaliteye sahiptir. Peritoneal fibrozisin mekanizması belirsizdir. Bu çalışmada, periton diyaliz sıvısının enjeksiyonu ile indüklenen peritoneal fibrozisin basit bir deneysel murin modelini tanımladık.

Özet

Periton fibrozisi, periton diyalizi (PH) uygulanan hastalarda ortaya çıkabilir ve ciddi periton fibrozisi olan hastalar yüksek morbidite ve mortaliteye sahiptir. Peritonit, yüksek glukozlu periton diyaliz sıvısı ve uzun süreli PH, peritoneal fibrozun başlangıcını hızlandırır. İnsan ve in vitro çalışmaların sınırlamaları nedeniyle peritoneal fibrozun bir hayvan çalışmasına ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, çoğu hayvan modeli klinik koşulları taklit etmez. Peritoneal fibrozu incelemek için, bir peritoneal kateter implante ederek ve 21 gün boyunca günlük olarak periton boşluğuna %2,5 yüksek glukozlu PD sıvısı artı 20 mM metilglioksal (MGO) enjekte ederek klinik olarak anlamlı bir murin modeli geliştirdik. Peritoneal kateterin implantasyonu, iğnelerle periton yaralanmasını önler ve klinik PD hastalarını taklit eder. İmmünofloresan boyama, fibrotik peritonda miyofibroblastların biriktiğini gösterdi. Deney grubu daha düşük ultrafiltrasyon hacmine ve peritoneal membran taşıma fonksiyonuna sahipti (peritoneal denge testi). Bu yazıda, modelin ayrıntılı bir protokolünü sunuyoruz.

Giriş

Periton diyalizi (PD), son dönem böbrek yetmezliği (SDBY) hastalarının yaklaşık %11'i tarafından alınan bir tür böbrek replasman tedavisidir1. Yapılan çalışmalarda PD2 alan hastalarda peritoneal fibrozis geliştiği bildirilmiştir. Peritoneal fibrozisin ciddi bir formu olan enkapsüle peritoneal skleroz (EPS) yüksek morbidite ve mortalite ile sonuçlanır3. Periton fibrozisinin risk faktörleri arasında peritonit, yüksek glukozlu periton diyaliz sıvısı, uzun süreli PH ve genetik faktörler yer alır4. Peritoneal fibrozis mekanizması, peritoneal mikroçevredeki karmaşık değişiklikleri ve farklı hücre tipleri arasındaki karışmayı içerir. İn vitro deneyler ve klinik gözlemler, peritoneal fibrozis hakkında mekanik bilgiler sağlamakla sınırlıdır ve hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Köpekler, tavşanlar, domuzlar, sıçanlar ve fareler gibi deney hayvanları genellikle insan hastalıkları araştırmalarındakullanılır 5 ve bunların fareleri, küçük boyutları, düşük maliyetleri ve deney kolaylığı avantajları nedeniyle en yaygın olarak kullanılanlardır. Ayrıca, soy izleme teknikleri kullanılarak farelerin hastalık modellerinde spesifik hücreler incelenebilir.

Uygun bir hayvan modeli oluşturmak, peritoneal fibrozisin patofizyolojisini anlamada yardımcı olacaktır. İdeal olarak, bu model ucuz olmalı, çoğaltılması kolay olmalı ve peritoneal fibroz için klinik tedavinin temelini oluşturmalıdır.

Şu anda mevcut olan peritoneal fibrozisin hayvan modelleri, 28 gün boyunca günlük olarak yüksek glikozlu PD sıvısının, 3 hafta boyunca haftada üç kez klorheksidin glukonatın (CG) veya tek bir doz sodyum hipoklorithipoklorit 6,7,8'in intraperitoneal enjeksiyonu ile oluşturulmuştur. Ancak, bu modellerin sınırlamaları vardır. Yüksek glukoz PD sıvısının enjeksiyonu, klinik uygulama ile son derece ilgili olmasına rağmen, sadece hafif peritoneal fibrozu indükler ve EPS gibi ciddi peritoneal fibrozun klinik koşullarını özetlemekte başarısız olur. CG veya hipoklorit, kimyasal yaralanma yoluyla EPS'yi taklit eden ciddi peritoneal fibrozu indükleyebilir9. Bununla birlikte, CG ve hipoklorit, yüksek glukoz PD sıvısından farklı mekanizmalar yoluyla peritoneal yaralanma ve fibrozisa neden olabilir.

Bu çalışma, peritoneal fibrozisin bir murin modelini geliştirmek için protokolü açıklamaktadır. Bu modelde, önce bir PD kateteri yerleştirilir ve daha sonra 21 gün boyunca günlük yüksek glikozlu PD sıvısı artı metilglioksal (MGO) enjeksiyonları gerçekleştirilir. MGO, PD sıvısında toksik bir glikoz bozunma ürünüdür ve inflamasyonu ve anjiyogenezi indükleyen ileri glikasyon son ürünlerinin oluşumunu teşvik eder10,11. Yüksek glukozlu PD sıvısına MGO ilavesi, miyofibroblastların birikmesini indükler ve peritoneal fibrozu teşvik eder. Bu model bu nedenle klinik koşulları taklit eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Deneyler, Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Halk Sağlığı Koleji Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (IACUC) göre onaylandı ve yürütüldü. Tüm fareler standart bakım altında barındırıldı.

1. Hayvan deneyi

  1. 11 haftalıktan büyük erkek ve dişi C57BL/6 vahşi tip (WT) fareler kullanın.
  2. Fare 4 fransız silikon portu, eldivenler, örtüler, kateterler, dikişler ve iğneler dahil olmak üzere cerrahi malzemeleri hazırlayın.
  3. Fare bağlantı noktasını aşağıdaki gibi implante edin:
    1. Fareleri deri altı enjeksiyon yoluyla ketamin / ksilazin (100/10 mg / kg vücut ağırlığı) ile uyuşturun.
      1. Anestezi koşullarından emin olmak için ameliyat sırasında farelerin solunum hızını ve anestezi derinliğini kontrol edin.
        NOT: Farelerin solunum hızı hızlı ve kısalırsa, önceki dozun% 20'sini ekleyin.
    2. Anestezi sırasında fareleri yüzüstü pozisyona getirin. Ameliyat için sol sırtta 2 cm x 3 cm büyüklüğünde bir alanı tıraş edin ve temizleyin ve cildi povidon-iyot ile dezenfekte edin.
    3. Sol sırttaki deride 1,5 cm'lik bir kesi yapın.
    4. Fare portunu implante etmek için 1 cmx 2 cm'lik bir boşluk oluşturmak için sol sırttaki deri ve kas arasında dikkatlice inceleyin.
    5. Sol sırt kasının üzerine küçük bir delik açın.
    6. Fare portunun toplam 4 fransız distal kısmını periton boşluğuna yerleştirin
    7. Sütür (4-0 naylon) farenin kökü sırt kasına kadar uzanır.
    8. Fare portunun başını cilt ve sırt kası arasına koyun.
    9. Cildi refleks klipslerle (7 mm) kapatın.
      NOT: Refleks klipsler dikişlerden daha iyidir çünkü fareler genellikle yarayı ısırır.
    10. Fare portu implantasyonundan 7 gün sonra deneyi başlatın. Fareleri rastgele deney ve kontrol gruplarına ayırın.
    11. Sıvı enjekte etmeden önce erişim bölgesindeki cildi povidon-iyot ile dezenfekte edin.
    12. PD sıvısı (PDF) grubuna 21 gün boyunca günde toplam 2 mL intraperitoneal olarak% 2.5 PD sıvısı ve 20 mM MGO enjekte edin. Kontrol grubuna normal salin (NS) enjekte edin.

2. Periton fonksiyon testi (periton dengeleme testi)

  1. % 2.5 PD sıvısı (2 mL) hazırlayın ve başlangıç glikoz konsantrasyonu (D0) olarak tanımlanan PD sıvısının glikoz konsantrasyonunu ölçün.
  2. PD sıvısını fare bağlantı noktasına enjekte edin.
  3. 30 dakika sonra, fareleri izofluran (% 100) doz aşımı ile feda edin.
  4. Karın içi sıvıyı bir şırınga ile toplayın, ardından ultrafiltrasyon hacmi olarak tanımlanan sıvı hacmini ölçün.
  5. Son glikoz konsantrasyonu (D) olarak tanımlanan karın içi sıvının glikoz konsantrasyonunu ölçün.
  6. Periton dengesini veya periton fonksiyonunu hesaplayın12.
    NOT: Periton dengeleme testi12 = Nihai PD sıvı glikoz konsantrasyonu (D)/ İlk PD sıvı glikoz konsantrasyonu (D0). Glikoz konsantrasyonu, bir biyokimyasal analizör13 ile hekzokinaz yöntemi ile tespit edilir.

3. Doku hazırlığı ve histolojik analiz

  1. Periton dokularını toplayın: sağ üst karın duvarı (1 cm x 1 cm) ve karaciğer. Periton dokusunu 2 saat% 4 paraformaldehit ile sabitleyin, daha sonra% 18 sükroz çözeltisi7 içinde gece boyunca sabitleyin.
  2. Periton dokusunun 4 μm kalınlığında donmuş kesitlerini hazırlayın ve daha önce yayınlandığı gibi histolojik analiz yapın7.
  3. İmmünofloresan boyama yapın.
    1. İmmünolojik etiketleme için aşağıdaki proteinlere karşı birincil antikorlar kullanın: miyofibroblastları tespit etmek için α-düz kas aktini (SMA; 2 saat, 1:200), mezotelyal hücrelerin tespiti için sitokeratin (2 saat, 1:200) ve hücre çekirdeklerini tespit etmek için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (5 dakika, 1:1000).
  4. Elde edilen verileri uygun bir formatta ifade eder.
    NOT: Bu çalışmada veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analizler uygun istatistiksel analiz yazılımları (Table of Materials) kullanılarak yapılmış ve istatistiksel anlamlılık tek yönlü varyans analizi veya t-testi ile değerlendirilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Periton dokusunun histolojisi incelendi ve peritoneal fibrozisin PD sıvısı artı MGO (PDF) grubunda başarılı bir şekilde indüklendiğini gösterdi. Karaciğer yüzeyinin viseral peritonunun immünofloresan boyanması, PDF grubunun yaralı peritonunda kontrol grubuna göre daha fazla miyofibroblast birikimi gösterdi (Şekil 1). Şekil 2A'da gösterildiği gibi, PDF grubu kontrol grubundan daha düşük bir ultrafiltrasyo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Periton, abdominal organları ve karın duvarlarını kaplayan viseral ve parietal bir peritona sahiptir. Tek katmanlı mezotelyal hücreler, bir submezotelyal katman, seroza, fibroblastlar, lenfositler ve salgılanan proteinlerdenoluşur 14. Peritoneal fibrozis, mezotelyal hücrelerin kaybı ve denüdasyonu, submezotelyal kalınlaşma ve miyofibroblastlar ve makrofajlar gibi birçok inflamatuar hücrenin birikmesidir 4,14

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Tayvan Üniversite Hastanesi (NTUH) 111-UN0026 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-wide spectrum Cytokeratin antibodyabcamab9377
Beckman CoulterBeckman CoulterAU5800Biochemical analyzer
DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole antibodySigma-Aldrich98718-90-3
Drapesany
FITC goat anti-rabbitJackson ImmunoResearch Secondary Antibody111-095-144
Glovesany
GraphPad PrizmGraphPad SoftwareGraphPad Software 9.0
Kellysany
Methylglyoxal (MGO)Sigma-Aldrich
Mini-UTE Mouse PortAccess TechnologiesMMP-4S 061108BMouse 4-French silicone port
Monoclonal anti-actin, α-smooth muscle-Cy3 antibodySigma-AldrichC6198
Needlesany
Reflex clips 7 mmany
Suture 4-0 Nylonany

Referanslar

  1. Jain, A. K., Blake, P., Cordy, P., Garg, A. X. Global trends in rates of peritoneal dialysis. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 533-544 (2012).
  2. Zhou, Q., Bajo, M. A., Del Peso, G., Yu, X., Selgas, R. Preventing peritoneal membrane fibrosis in peritoneal dialysis patients. Kidney International. 90 (3), 515-524 (2016).
  3. Brown, M. C., Simpson, K., Kerssens, J. J., Mactier, R. A. Scottish Renal Registry. Encapsulating peritoneal sclerosis in the new millennium: A national cohort study. ClinicalJournal of the American Society of Nephrology. 4 (7), 1222-1229 (2009).
  4. Aroeira, L. S., et al. Epithelial to mesenchymal transition and peritoneal membrane failure in peritoneal dialysis patients: Pathologic significance and potential therapeutic interventions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2004-2013 (2007).
  5. Yang, B., et al. Experimental models in peritoneal dialysis (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (3), 240(2021).
  6. Pawlaczyk, K., et al. Animal models of peritoneal dialysis: Thirty Years of our own experience. BioMed Research International. 2015, 261813(2015).
  7. Chen, Y. T., et al. Lineage tracing reveals distinctive fates for mesothelial cells and submesothelial fibroblasts during peritoneal injury. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (12), 2847-2858 (2014).
  8. Yokoi, H., et al. Pleiotrophin triggers inflammation and increased peritoneal permeability leading to peritoneal fibrosis. Kidney International. 81 (2), 160-169 (2012).
  9. Hoff, C. M. Experimental animal models of encapsulating peritoneal sclerosis. Peritoneal Dialysis International. 25, Suppl 4 57-66 (2005).
  10. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (2), 437-447 (2009).
  11. Nagai, T., et al. Linagliptin ameliorates methylglyoxal-induced peritoneal fibrosis in mice. PLoS One. 11 (8), 0160993(2016).
  12. Kakuta, T., et al. Pyridoxamine improves functional, structural, and biochemical alterations of peritoneal membranes in uremic peritoneal dialysis rats. Kidney International. 68 (3), 1326-1336 (2005).
  13. Barthelmai, W., Czok, R. Enzymatic determinations of glucose in the blood, cerebrospinal fluid and urine. Klinische Wochenschrift. 40, 585-589 (1962).
  14. Williams, J. D., et al. Morphologic changes in the peritoneal membrane of patients with renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (2), 470-479 (2002).
  15. Hurst, S. M., et al. Il-6 and its soluble receptor orchestrate a temporal switch in the pattern of leukocyte recruitment seen during acute inflammation. Immunity. 14 (6), 705-714 (2001).
  16. Pawlaczyk, K., et al. Vascular endothelial growth factor in dialysate in relation to intensity of peritoneal inflammation. The International Journal of Artificial Organs. 31 (6), 535-544 (2008).
  17. Loureiro, J., et al. Blocking TGF-beta1 protects the peritoneal membrane from dialysate-induced damage. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (9), 1682-1695 (2011).
  18. Margetts, P. J., et al. Transforming growth factor beta-induced peritoneal fibrosis is mouse strain dependent. Nephrology, Dialysis Transplantation. 28 (8), 2015-2027 (2013).
  19. Huang, J. W., et al. Tamoxifen downregulates connective tissue growth factor to ameliorate peritoneal fibrosis. Blood Purification. 31 (4), 252-258 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Peritoneal FibrozisMurin ModelPeriton DiyaliziY ksek Glukoz Diyaliz S v sMetilglioksalHayvan al masmm nofloresan BoyamaMiyofibroblastlarUltrafiltrasyon HacmiPeriton Membran Ta ma FonksiyonuPeriton Denge TestiKlinik Anlaml l k

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır