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摘要

该协议描述了通过依次添加Janus碱基纳米管（JBNts），基质素-3和转化生长因子β-1（TGF-β1）来逐层组装Janus碱基纳米基（JBNm）支架。JBNm 是制造和表征的;此外，它显示出优异的生物活性，促进细胞功能，如粘附、增殖和分化。

摘要

已经开发了各种生物材料支架来引导细胞粘附和增殖，以期促进 体外 和 体内 使用的特定功能。将生长因子添加到这些生物材料支架中通常是为了提供最佳的细胞培养环境，介导细胞分化及其后续功能。然而，传统生物材料支架中的生长因子通常设计为在植入时释放，这可能导致对周围组织或细胞的意外副作用。在这里，受DNA启发的Janus碱基纳米基质（JBNm）成功地实现了高度本地化的微环境，具有逐层结构，用于自我可持续的软骨组织构建。JBNms由Janus基纳米管（JBNts），基质素-3和通过生物亲和力 转化 生长因子β-1（TGF-β1）自组装而成。JBNm以1:4:10的TGF-β1:matrilin-3:JBNt比例组装，因为这是可以正确组装到逐层结构中的确定比例。首先，将TGF-β1溶液加入到基质素-3溶液中。然后，将该混合物移液数次以确保在加入JBNt溶液之前具有足够的均匀性。这形成了逐层JBNm，在再次移液几次后。通过多种实验表征了JBNm结构、单独JBNts、单独使用基质素-3和单独表征TGF-β1。利用紫外-可见吸收光谱研究了JBNm的形成，并用透射电子显微镜（TEM）观察了JBNm的结构。由于创新的逐层JBNm支架是在分子尺度上形成的，可以观察到荧光染料标记的JBNm。TGF-β1被限制在可注射的JBNm的内层内，可以阻止生长因子向周围区域释放，促进局部软骨形成，促进抗肥大的微环境。

引言

组织工程中的支架在为细胞附着和随后的组织发育提供结构支持方面起着至关重要的作用1。通常，没有任何支架的常规组织构建体依赖于细胞培养环境和添加的生长因子来介导细胞分化。此外，这种将生物活性分子添加到支架中通常是指导细胞分化和功能的首选方法2，3。一些支架可以独立地模仿天然组织的生化微环境，而另一些支架可以通过生长因子直接影响细胞功能。然而，研究人员在选择可能对细胞粘附、生长和分化产生积极影响的支架时经常遇到挑战，同时在很长一段时间内提供最佳的结构支持和稳定性4，5.生物活性分子通常松散地结合在支架上，导致这些蛋白质在植入时快速释放，导致它们在不需要的位置释放。这最终导致对非故意靶向的组织或细胞的副作用6，7。

脚手架通常由聚合物材料制成。Janus基础纳米基质（JBNm）是一种仿生支架平台，采用新颖的逐层方法创建，用于自我可持续的软骨组织构建8。这些新型DNA启发的纳米管被命名为Janus碱基纳米管（JBNts），因为它们正确地模仿了细胞外基质（ECM）中胶原蛋白的结构和表面化学。通过添加生物活性分子，如马曲林-3和转化生长因子β-1（TGF-β1），JBNm可以创造一个最佳的微环境，然后可以刺激所需的细胞和组织功能9。

JBNts是源自核碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶合成版本的新型纳米管。JBNts通过自组装10形成;六个合成核碱基键合形成一个环，这些环经历π π堆积相互作用，形成长度为200-300μm的纳米管11。这些纳米管在结构上类似于胶原蛋白;通过模拟天然软骨微环境的一个方面，JBNts已被证明为软骨细胞和人间充质干细胞（hMSCs）提供了有利的附着位点11，12，13，14。由于纳米管经过自组装并且不需要任何类型的引发剂（例如紫外线），因此它们作为难以到达的缺陷区域的可注射支架显示出令人兴奋的潜力15。

基质蛋白-3是一种在软骨中发现的结构细胞外基质蛋白。这种蛋白质在软骨生成和适当的软骨功能中起重要作用16，17。最近，它已被纳入生物材料支架，促进软骨形成而不肥大9，18，19。通过将这种蛋白质包含在JBNm中，软骨细胞被吸引到含有与其天然微环境相似成分的支架上。此外，已经表明基曲林-3是软骨细胞20内适当的TGF-β1信号传导所必需的。生长因子作为信号分子发挥作用，导致某种细胞或组织的特定生长。因此，为了实现最佳的软骨再生，基质素-3和TGF-β1是JBNm中必不可少的成分。将TGF-β1添加到逐层支架中可以进一步促进组织结构中的软骨再生。TGF-β1是一种生长因子，用于促进骨软骨缺陷的愈合过程，促进软骨细胞和hMSC增殖和分化21，22。因此，TGF-β1在软骨再生JBNm（J/T/M JBNm）23中起关键作用，促进适当的生长，特别是当它位于JBNm层内时。

如前所述，生长因子通常组装在支架的外部，没有特定的掺入方法。在这里，凭借精确设计的生物材料的纳米结构，JBNm被开发用于特定靶向目标细胞和组织。JBNm由粘附在内层JBNt表面上的TGF-β1和粘附在外层24，25的JBNt表面上的基质素-3组成。TGF-β1 掺入逐层结构的内层允许沿 JBNm 纤维的高度局部微环境，从而产生稳态组织结构，蛋白质12 的释放速度要慢得多。JBNm的可注射性使其成为未来各种生物材料应用的理想软骨组织结构26。

研究方案

1. JBNts的合成

  1. 利用先前发表的方法制备JBNt单体，涉及多种化合物的合成12。
  2. 使用反相柱用高效液相色谱（HPLC）合成粗JBNt单体后纯化粗单体。使用溶剂A:100%水，溶剂B:100%乙腈和溶剂C:HCl水溶液，pH = 1。使用3毫升/分钟的流速。在7.2分钟收集HPLC中获得的最大峰。

2. JBNt/matn1/TGF-β1的制造（视频1）

注意: 视频 1 显示 JBNm 是在生理环境（水溶液、无紫外线、无化学添加剂和无加热）中形成的可注射固体，这也是生物启发的。

  1. 加入 8 μL 悬浮在 H 2 O 中的 1 mg/mL TGF-β1 至 32μL 悬浮在 H2O 中的 1 mg/mL 马嗔素-3 移液器，以确保这些蛋白质的适当混合。
  2. 将 80 μL 悬浮在 H2O 中的 1 mg/mL JBNts 加入 TGF-β1/马嗔啉-3 溶液中。反复移液以确保正确混合。添加JBNts后可以立即观察到白色絮凝物的存在，表明JBNm的形成（视频1）。

3. 观察紫外可见（UV-Vis）吸收的标本

注意:研究了紫外-可见吸收光谱以表征JBNm的组装。该测量结果针对四类进行了分析:单独的JBNts，单独的matrilin-3，单独的TGF-β1和由所有三个部分组成的完整的逐层JBNm。所有初始浓度悬浮在H2O中。

  1. 对于 JBNt 组，将 5 μL 的 1 mg/mL JBNt 加入 50 μL 的 H2O 中，制成 90.9 μg/mL 溶液。
  2. 对于马曲林-3 组，将 40 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 15 μL H2O 中，制成 7.3 μg/mL 溶液。
  3. 对于 TGF-β1 组，将 10 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 加入 45 μL 的 H2O 中，制成 1.8 μg/mL 溶液。
  4. 对于 JBNm 组，将 40 μL 的 10 μg/mL 马嗔啉-3 添加到 10 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 中。搅拌以确保正确混合，然后将 5 μL 1 mg/mL JBNts 加入溶液中，反复移液以混合样品。
  5. 使用分光光度计，测量每组的吸收光谱。

4. 试样的Zeta电位测量

注意:分析zeta电位以更好地预测JBNm如何与 体内 组织相互作用。测量三组:单独使用马嗔啉-3，含TGF-β1的马嗔啉-3和全层JBNm。

  1. 对于马曲林-3 组，将 160 μL 10 mg/mL 马嗔啉-3 加入 640 μL H2O 中，制成 800 μL 溶液。
  2. 对于马嗔啉-3/TGF-β1 化合物，将 160 μL 的 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 40 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 中。反复移液以确保适当的均匀性。然后，将其添加到 600 μL H2O 中，得到 800 μL 溶液。
  3. 对于 JBNm 组，将 160 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 40 μL 10 μg/mL TGF-β1 中。多次移液以混合蛋白质。然后，向溶液和移液器中加入 20 μL 1 mg/mL JBNt 以确保均匀性。最后，将 JBNm 溶液加入 580 μL H2O 中，以产生 800 μL 溶液。
  4. 测量三组的 zeta 电位值。

5. 透射电子显微镜（TEM）用JBNt/基质啉-3纳米基质的制备

注意:执行TEM表征是为了表征JBNts和JBNm的形态。

  1. 根据已发布的协议和制造商的协议，将两个网格插入等离子清洁器，以便在 JBNts 和 JBNm 进行负染色之前正确清洁网格12。
  2. 通过将 10 μL 1 mg/mL JBNt 与 40 μL 蒸馏水混合，制备 200 μg/mL JBNt 溶液。
  3. 将 30 μL 100 μg/mL 马腈林-3 与 20 μL 100 μg/mL TGF-β1 混合，并移液数次。向基质素-3/TGF-β1 混合物中加入 10 μL 1 mg/mL JBNts，以制备 JBNm 样品。再次，反复移液。
  4. 在单独的网格上加入 3 μL JBNt 溶液 （200 μg/mL） 和 3 μL JBNm 溶液，静置 2 分钟。
  5. 用 100 μL 乙酸铀酰溶液 （0.5%） 冲洗每个网格。使用滤纸去除多余的溶液，让网格风干。
  6. 操作透射电子显微镜以正确观察和表征样品，如之前发表的11，12所示。

6. 荧光标记蛋白的吸收光谱测量

注意:JBNm的结构是通过吸收光谱分析观察JBNm的结构来验证的。

  1. 按照制造商的说明使用蛋白质标记试剂盒标记TGF-β1。将 20 μL 标记的 TGF-β1 的 20 μg/mL 加入 25 μL H2O 中，制成 8.9 μg/mL 测试溶液。
  2. 使用单独的标记试剂盒标记基质素-3。将 20 μL 标记的 80 μg/mL 标记的马曲林-3 加入 25 μL H2O 中，制成 36 μg/mL 测试溶液。
    注意:TGF-β1的荧光染料标记导致最终浓度为20μg/ mL，而matrilin-3的标记导致最终浓度为80μg/ mL。
  3. 将 20 μL 标记的 80 μg/mL 马嗔啉-3 与 20 μL 标记的 TGF-β1 的 20 μg/mL 和 5 μL H2O 混合，得到标记的 TGF-β1/马嗔啉-3 化合物。将混合物移液几次以混合。
  4. 将 5 μL 的 1 mg/mL JBNt 加入 40 μL 的 H2O 中，得到 111 μg/mL 的溶液。
  5. 将 20 μL 标记的 TGF-β1 的 20 μg/mL 加入 20 μL 标记的 80 μg/mL 的马曲林-3 中，并移液数次。向标记的TGF-β1 /马曲林-3溶液中加入5 μL 1 mg/mL JBNts，并重复移液以适当混合化合物。
    注意:标记TGF-β1和标记的matrilin-3样品的JBNt的最终浓度分别为111μg/ mL，8.9μg/ mL和36μg/ mL。
  6. 将每个样品组（即标记的TGF-β1（步骤6.1），标记的基兔素-3（步骤6.2），标记的TGF-β1 / matrilin-3（步骤6.3），JBNts（步骤6.4），JBNm（步骤6.5））转移到自己的黑色384孔板孔中。
  7. 将黑色 384 孔板装入多模式酶标仪中，并按照制造商的方案在 488 nm 和 555 nm 的激发波长下进行测量。

7. 体外 生物学功能测定

  1. 预涂盖玻璃室的电池附着力测试
    1. 准备两个带有五组样品的腔室盖玻片，因为每种细胞类型使用一个盖玻片。
    2. 将 1.25 μL 的 1 mg/mL JBNts 加入 198.75 μL 蒸馏水中，得到 6.25 μg/mL 的溶液。
    3. 将 10 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入到 190 μL 蒸馏水中，得到 0.5 μg/mL 溶液。
    4. 将 2.5 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 加入到 197.5 μg/mL 蒸馏水中，得到 0.125 μg/mL 溶液。
    5. 对于 JBNm 组，将 10 μL 的 10 μg/mL 马曲林-3 加入 2.5 μL 的 10 μg/mLTGF-β1 中并重复移液。向混合物溶液和移液器中加入 1.25 μL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts。最后，加入 186.25 μL 蒸馏水，得到 200 μL JBNm 溶液。
      1. 对于对照组，使用 200 μL 蒸馏水。
    6. 将每个样品组添加到他们自己的1.5号腔室盖玻片孔中。将盖玻片放入-80°C冰箱中1小时，然后用冻干仪器冷冻干燥。
    7. 将人间充质干细胞（hMSCs）和人软骨细胞（每孔10，000个细胞）接种到制备的腔室盖玻片的每个孔中。
    8. 将两个盖玻片在37°C培养箱中孵育4小时。然后，吸出细胞培养基并用PBS冲洗两次。
    9. 用4%多聚甲醛固定细胞5分钟，然后取出并用PBS冲洗样品。再次冲洗样品以完全去除4%的多聚甲醛。
    10. 用 100 μL 的 0.1% Triton-X 孵育细胞 10 分钟，并用 PBS 洗涤。向每个孔中加入 100 μL 0.165 μM 罗丹明-鬼笔环肽。等待30分钟，然后再次用PBS洗涤。
    11. 向每个孔中加入 0.1 μg/mL DAPI 以染色细胞核。等待5分钟，然后用PBS冲洗孔两次。
    12. 使用光谱共聚焦显微镜观察细胞形态并捕获荧光图像。
    13. 此外，使用图像处理软件分析细胞数量和形态。打开软件并加载图像。添加比例尺并校准软件。计算每个样品在给定区域中的细胞数。然后，使用测量工具收集每个样品的细胞形态数据。
  2. 细胞增殖
    1. 准备三个未经处理的96孔板，每个板添加五组样品。
      1. 对于 JBNt 组，将 3.75 μL 1 mg/mL JBNts 加入 596.25 μL 蒸馏水中，得到浓度为 6.25 μg/mL 的 600 μL JBNt 溶液。
      2. 对于 TGF-β1 组，将 7.5 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 加入到 592.5 μL 蒸馏水中，得到 0.125 μg/mL 的测试溶液。
      3. 对于马兔林-3 组，将 30 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 570 μL 蒸馏水中，得到 0.5 μg/mL 测试溶液。
      4. 对于 JBNm 组，将 7.5 μL 10 μg/mL TGF-β1 与 30 μL 10 μg/mL 马曲林-3 混合并移液数次，然后向溶液中加入 3.75 μL 1 mg/mL JBNts。
      5. 用 558.75 μL 蒸馏水稀释 JBNm 溶液，以获得 JBNt、TGF-β1 和马先啉-3 样品的最终浓度分别为 6.25 μg/mL、0.125 μg/mL 和 0.5 μg/mL。
      6. 对于对照组，使用 600 μL 蒸馏水。
    2. 将每个样品组分成六个孔（每孔 100 μL 样品）。
    3. 将含有所有样品的三个板放入-80°C冰箱中1小时，然后用冻干仪器冷冻干燥。
    4. 将hMSCs接种到这些平板上，每个平板接受含有5，000个细胞的100μL细胞悬液（每孔）。将三个板在37°C下在5%CO2下孵育1天，3天或5天。
    5. 向每个孔中加入10μLCCK-8溶液，并在37°C下再孵育2小时。
    6. 使用多模式酶标仪在450nm处测量每个孔的吸收值。
    7. 将已知的hMSCs梯度接种到96孔板上并孵育4小时。使用 CCK-8 测定法测量已知数量细胞的吸收值并生成标准曲线。
    8. 使用吸收标准曲线计算细胞增殖。
  3. 稳定性试验
    注意:使用人TGF-β1靶向ELISA试剂盒来确定琼脂糖水凝胶中JBNm中TGF-β1的释放百分比。
    1. 通过将400mg琼脂糖粉末加入20mL PBS中并加热至100°C以完全溶解琼脂糖粉末来制备2%琼脂糖。
    2. 在冷却的2%琼脂糖水凝胶内制备JBNm。
      1. 混合 10 μL 10 μg/mL TGF-β1、40 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3、5 μL 1 mg/mL JBNts 和 195 μL PBS。将此溶液与 250 μL 2% 琼脂糖混合，制成 JBNm 水凝胶。
    3. 加入 500 μL PBS，将其用作释放溶液，并确保每 3 天更换一次。保留每个释放的溶液，让样品静置 15 天。
    4. 按照制造商的说明，利用 ELISA 试剂盒测试每个捕获的释放溶液。
      注意:通过从100%的理论负载值中减去PBS中释放的TGF-β1量，可以确定TGF-β1的剩余量。
  4. 用PCR26进行细胞分化分析。
    1. 制备七组样品，每组样品含有 20 μL 细胞悬液（4 x 104 个细胞）、30 μL 特定溶液（或 PBS，取决于样品组）和 50 μL 2 wt % 琼脂糖。
      1. 对于 TGF-β1 组，将 5 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 加入到 25 μL PBS 中，得到 1.6 μg/mL 溶液。
      2. 对于马嗔啉-3 组，将 20 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 10 μL PBS 中，得到 6.7 μg/mL 溶液。
      3. 对于 JBNt 组，将 2.5 μL 的 1 mg/mL JBNt 添加到 27.5 μL PBS 中，得到 83.3 μg/mL 的溶液。
      4. 对于 J/T/M JBNm 组，将 10 μL 的 10 μg/mL 马曲林-3 加入 5 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 中，上下移液以混合溶液。然后，加入 2.5 μL 的 1 mg/mL JBNts 并再次移液。最后，用 2.5 μL PBS 稀释。
      5. 对于每个对照组，使用 30 μL PBS 作为样品。
    2. 向每个孔中加入 0.5 mL 细胞培养基，确保每 3 天更换一次。
      1. 对于阳性对照组，使用含有添加TGF-β1的市售hMSC致软骨培养基。这个额外的TGF-β1等于TGF-β1和J/T/M JBNm组中的量。
      2. 对于其中一个阴性对照组，使用不含TGF-β1的商用hMSC软骨培养基。对于另一个阴性对照组，使用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM细胞培养基。
      3. 对于其他每组，使用不含TGF-β1的市售hMSC软骨细胞培养基。
    3. 培养样品15天。
    4. 提取样品的RNA并进行PCR以研究样品的分化，如前所述26。
  5. X型胶原表达测定的免疫染色
    1. 以与PCR方法部分的细胞分化相同的方式制备七个琼脂糖样品（步骤7.4）。
    2. 培养样品15天。
    3. 用4%甲醛固定样品1天，在30%蔗糖溶液中浸泡过夜，然后用液氮在-80°C冷冻过夜。使用最佳切割温度化合物试剂（OCT），水溶性乙二醇和树脂的混合物，在-10°C下固定样品。
    4. 操作低温恒温器切片机以获得每个样品的 20 μm 厚的冷冻切片。
    5. 根据制造商的方案，用1:800稀释度的抗胶原蛋白X抗体和用PBS稀释的荧光标记二抗对每个切片进行染色。
    6. 用共聚焦显微镜观察每个切片，在目镜上使用488 nm的激发和40倍的放大倍率。

结果

按照实验方案，成功合成了JBNts，并用紫外-可见吸收和透射电镜进行了表征。JBNm 是一种可注射的固体支架，经过快速仿生过程。在生理环境中将JBNts加入TGF-β1/matrilin-3溶液的混合物中后，形成固体白色网状支架，表明JBNm组装成功，如图 1所示。这在表征方法中得到了证明。

在生理条件下，基曲林-3由于其等电点27 而带负电（

讨论

本研究的目标是开发一种仿生支架平台JBNm，以克服依赖细胞培养环境介导细胞分化的传统组织结构的局限性。JBNm 是一种逐层结构支架，用于自我可持续的软骨组织结构。创新设计基于新型DNA启发的纳米材料JBNts。JBNm由JBNts30，TGF-β1和matrilin-3组成，通过一种新的逐层技术组装，其中支架的自组装在分子水平上得到控制。通过zeta电位测量、紫外-可见吸收、TEM和荧光光谱分析对JBNm?...

披露声明

陈宇鹏博士是Eascra Biotech， Inc.和NanoDe Therapeutics， Inc.的联合创始人。

致谢

这项工作得到了NIH资助7R01AR072027和7R03AR069383，NSF职业奖1905785，NSF 2025362和康涅狄格大学的支持。这项工作也得到了NIH拨款S10OD016435的部分支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
10 % Normal Goat SerumThermo Fisher50062ZAgent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plateCorning07-200-74024-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated PlateThermo Fisher262260384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglassThermo Fisher155409PK8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottomCorning07-200-9196-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treatedThermo Fisher26089596-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose GelSigma-AldrichA9539Hydrogel used for cell culture.
Agarose GelSigma AldrichA9539Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling KitThermo FisherA30006 (488) and A30007 (555)Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X AntibodyThermo Fisher41-9771-82Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR MachineBio-RadEquipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell LineCells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8Milipore Sigma96992Cell proliferation assay.
Cell ProfilerBroad InstituteSoftware used to analyze cell images.
Cryostat MicrotomeEquipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPIInvitrogenD1306Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettesFISHER Scientific14-955-128Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture MediumThermo Fisher10566032Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine SerumGIBCOA4766801Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting MediumThermo Fisher00-4958-02Solution used to mount slides for immunostaining.
FormaldehydeCompound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary AntibodyThermo FisherA16110Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem CellsLONZAPT-2501Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic MediumLONZAPT-3003Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJNational Institutes of HealthImage analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step KitBioRad1725150Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic MicroscopeTecnaiEquipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLABMathWorksStatistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop SpectrophotometerThermo FisherEquipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal MicroscopeNikonA1R HD25Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber CoverglassThermo Fisher152250Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound ReagentCompound used to embed cells prior to microtoming.
ParaformaldehydeThermo ScientificAAJ19943K2Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma CleanerHarrick PlasmaCleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycinGIBCO15-140-148Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher10010023Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidinInvitrogenR415F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini KitQIAGEN74904Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose SolutionSolution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA KitInvitrogenBMS249-4Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1PEPROTECH100-21CGrowth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-XInvitrogenHFH10Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol ReagentThermo Fisher15596026Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalEquipment used to measure zeta-potential values of a sample.

参考文献

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

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