Fabricação e Caracterização de Nano-Matriz de Base Janus Camada por Camada para Promover a Regeneração da Cartilagem

Resumo

Este protocolo descreve a montagem de um andaime de nanomatriz de base Janus (JBNm) camada por camada, adicionando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e Fator de Crescimento Transformador Beta-1 (TGF-β1) sequencialmente. O JBNm foi fabricado e caracterizado; além disso, apresentou excelente bioatividade, estimulando funções celulares como adesão, proliferação e diferenciação.

Resumo

Vários andaimes de biomateriais foram desenvolvidos para orientar a adesão e proliferação celular, na esperança de promover funções específicas para usos in vitro e in vivo. A adição de fatores de crescimento a esses andaimes de biomateriais é geralmente feita para fornecer um ambiente ideal de cultura celular, mediando a diferenciação celular e suas funções subsequentes. No entanto, os fatores de crescimento em um andaime de biomaterial convencional são tipicamente projetados para serem liberados após a implantação, o que pode resultar em efeitos colaterais não intencionais no tecido ou nas células circundantes. Aqui, a nanomatriz de base Janus inspirada no DNA (JBNm) alcançou com sucesso um microambiente altamente localizado com uma estrutura camada por camada para construções de tecido cartilaginoso autossustentáveis. Os JBNms são auto-montados a partir de nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e fator de crescimento transformador beta-1 (TGF-β1) via bioafinidade. O JBNm foi montado na proporção TGF-β1:matrilina-3:JBNt de 1:4:10, pois esta foi a razão determinada na qual a montagem adequada na estrutura camada por camada poderia ocorrer. Primeiramente, a solução de TGF-β1 foi adicionada à solução de matrilina-3. Em seguida, esta mistura foi pipetada várias vezes para garantir homogeneidade suficiente antes da adição da solução JBNt. Isso formou o JBNm camada por camada, depois de pipetar várias vezes novamente. Uma variedade de experimentos foi realizada para caracterizar a estrutura JBNm camada por camada, JBNts sozinho, matrilina-3 sozinho e TGF-β1 sozinho. A formação do JBNm foi estudada com espectros de absorção UV-Vis, e a estrutura do JBNm foi observada com microscopia eletrônica de transmissão (MET). À medida que o inovador andaime JBNm camada por camada é formado em escala molecular, o JBNm marcado com corante fluorescente pôde ser observado. O TGF-β1 é confinado dentro da camada interna do JBNm injetável, o que pode impedir a liberação de fatores de crescimento para áreas circundantes, promover condrogênese localizada e promover um microambiente anti-hipertrófico.

Introdução

Os andaimes na engenharia de tecidos desempenham um papel vital no fornecimento de suporte estrutural para a fixação celular e subsequente desenvolvimento tecidual¹. Normalmente, as construções de tecidos convencionais sem qualquer andaime dependem do ambiente de cultura celular e adicionam fatores de crescimento para mediar a diferenciação celular. Além disso, essa adição de moléculas bioativas em andaimes é frequentemente a abordagem preferida para orientar a diferenciação e a função celular ^2,3. Alguns andaimes podem imitar o microambiente bioquímico dos tecidos nativos de forma independente, enquanto outros podem influenciar diretamente as funções celulares através de fatores de crescimento. No entanto, os pesquisadores frequentemente encontram desafios na seleção de andaimes que poderiam afetar positivamente a adesão, o crescimento e a diferenciação celular, ao mesmo tempo em que fornecem suporte estrutural e estabilidade ideais por um longo período ^4,5. As moléculas bioativas são muitas vezes frouxamente ligadas ao andaime, levando à rápida liberação dessas proteínas após a implantação, resultando em sua liberação em locais indesejados. Isso culmina em efeitos colaterais em tecidos ou células que não foram intencionalmente direcionados ^6,7.

Os andaimes são tipicamente feitos de materiais poliméricos. A nanomatriz de base Janus (JBNm) é uma plataforma de andaime biomimético criada com um novo método camada por camada para construção de tecido cartilaginoso autossustentável⁸. Esses novos nanotubos inspirados em DNA foram nomeados nanotubos de base Janus (JBNts), pois imitam adequadamente a estrutura e a química da superfície do colágeno encontrada na matriz extracelular (ECM). Com a adição de moléculas bioativas, como a matrilina-3 e o Fator Transformador de Crescimento Beta-1 (TGF-β1), o JBNm pode criar um microambiente ideal que pode, então, estimular a funcionalidade celular e tecidual desejada⁹.

JBNts são novos nanotubos derivados de versões sintéticas da nucleobase adenina e timina. Os JBNts são formados através da auto-montagem¹⁰; seis nucleobases sintéticas se ligam para formar um anel, e esses anéis sofrem interações de empilhamento π-π para criar um nanotubo de 200-300 μm de comprimento¹¹. Estes nanotubos são estruturalmente semelhantes às proteínas de colagénio; ao imitar um aspecto do microambiente da cartilagem nativa, os JBNts demonstraram fornecer um local de fixação favorável para condrócitos e células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs)^11,12,13,14. Como os nanotubos são submetidos à automontagem e não requerem nenhum tipo de iniciador (como a luz UV), eles mostram um potencial excitante como um andaime injetável para áreas de defeitos de difícil acesso¹⁵.

A matrilina-3 é uma proteína da matriz extracelular estrutural encontrada na cartilagem. Essa proteína desempenha um papel significativo na condrogênese e na função adequada da cartilagem^16,17. Recentemente, tem sido incluída em andaimes de biomateriais, incentivando a condrogênese sem hipertrofia 9,18,19. Ao incluir esta proteína no JBNm, as células da cartilagem são atraídas por um andaime que contém componentes semelhantes ao do seu microambiente nativo. Além disso, foi demonstrado que a matrilina-3 é necessária para a sinalização adequada do TGF-β1 dentro dos condrócitos²⁰. Os fatores de crescimento funcionam como moléculas de sinalização, causando o crescimento específico de uma determinada célula ou tecido. Assim, para alcançar a regeneração ideal da cartilagem, a matrilina-3 e o TGF-β1 são componentes essenciais dentro do JBNm. A adição de TGF-β1 no andaime camada por camada pode promover ainda mais a regeneração da cartilagem em uma construção de tecido. O TGF-β1 é um fator de crescimento empregado para incentivar o processo de cicatrização de defeitos osteocondrais, incentivando a proliferação e diferenciação de condrócitos e hMSC^21,22. Assim, o TGF-β1 desempenha um papel fundamental na regeneração da cartilagem JBNm (J/T/M JBNm)²³, incentivando o crescimento adequado, especialmente quando está localizado dentro das camadas JBNm.

Como mencionado anteriormente, os fatores de crescimento são tipicamente montados do lado de fora dos andaimes sem métodos específicos de incorporação. Aqui, com a nanoarquitetura precisamente projetada dos biomateriais, o JBNm foi desenvolvido para o direcionamento específico de células e tecidos pretendidos. O JBNm é composto por TGF-β1 aderido em superfícies JBNt na camada interna e matrilina-3 aderido em superfícies JBNt na camada externa^24,25. A incorporação do TGF-β1 na camada interna da estrutura camada por camada permite um microambiente altamente localizado ao longo das fibras JBNm, criando uma construção tecidual homeostática com uma liberação muito mais lenta da proteína¹². A injetabilidade do JBNm o torna uma construção de tecido cartilaginoso ideal para várias aplicações futuras de biomateriais²⁶.

Protocolo

1. Síntese dos JBNts

1. Preparar o monômero JBNt utilizando métodos previamente publicados, envolvendo a síntese de uma variedade de compostos¹².
2. Purificar o monómero bruto JBNt depois de ter sido sintetizado com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando uma coluna de fase reversa. Use o solvente A: 100% água, o solvente B: 100% acetonitrila e o solvente C: solução de água HCl com pH = 1. Use uma taxa de fluxo de 3 mL/min. Coletar o maior pico obtido na HPLC aos 7,2 min.

2. Fabricação para JBNt/Matn1/TGF-β1 (Vídeo 1)

NOTA: O vídeo 1 mostra que o JBNm é um sólido injetável formado em um ambiente fisiológico (solução de água, sem luz UV, sem aditivos químicos e sem aquecimento), que também é biologicamente inspirado.

1. Adicionar 8 μL de TGF-β1 de 1 mg/mL suspenso em H 2 O a 32 μL de 1 mg/mL de matrilina-3 suspenso em H₂O. Pipeta para garantir amistura adequada dessas proteínas.
2. Adicionar 80 μL de JBNts de 1 mg/mL suspensos em H₂O à solução de TGF-β1/matrilina-3. Pipeta repetidamente para garantir a mistura adequada. A presença de floculos brancos pode ser observada imediatamente após a adição de JBNts, indicando a formação do JBNm (Vídeo 1).

3. Observação de espécimes com absorção ultravioleta-visível (UV-Vis)

NOTA: Os espectros de absorção UV-Vis foram estudados para caracterizar a montagem do JBNm. Essa medida foi analisada para quatro categorias: JBNts isoladamente, matrilina-3 isoladamente, TGF-β1 isoladamente e JBNm completa camada por camada, composta por todas as três partes. Todas as concentrações iniciais são suspensas em H₂O.

1. Para o grupo JBNt, adicione 5 μL de 1 mg/mL JBNts a 50 μL de H₂O para fazer uma solução de 90,9 μg/mL.
2. Para o grupo matrilina-3, adicione 40 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 15 μL de H₂O para fazer uma solução de 7,3 μg/mL.
3. Para o grupo TGF-β1, adicione 10 μL de 10 μg/mL de TGF-β1 a 45 μL de H₂O para fazer uma solução de 1,8 μg/mL.
4. Para o grupo JBNm, adicione 40 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 10 μL de 10 μg/mL ^TGF-β1. Agitar para garantir a mistura adequada e, em seguida, adicionar 5 μL de 1 mg/ml JBNts à solução, pipetando repetidamente para misturar a amostra.
5. Usando um espectrofotômetro, meça o espectro de absorção de cada grupo.

4. Medição do potencial Zeta de espécimes

NOTA: O potencial zeta foi analisado para melhor predizer como o JBNm interagiria com o tecido in vivo. Foram mensurados três grupos: matrilina-3 isoladamente, matrilina-3 com TGF-β1 e JBNm camada por camada completa.

1. Para o grupo matrilina-3, adicione 160 μL de 10 mg/mL de matrilina-3 a 640 μL de H₂O para fazer uma solução de 800 μL.
2. Para o composto matrilina-3/TGF-β1, adicione 160 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 40 μL de 10 μg/mL de TGF-β1. Pipetar repetidamente para garantir a homogeneidade adequada. Em seguida, adicione-o a 600 μL de H₂O resultando em uma solução de 800 μL.
3. Para o grupo JBNm, adicione 160 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 40 μL de 10 μg/mL de TGF-β1. Pipeta várias vezes para misturar as proteínas. Em seguida, adicionar 20 μL de 1 mg/mL JBNts à solução e pipeta para garantir a homogeneidade. Finalmente, adicione a solução JBNm a 580 μL de H₂O para produzir uma solução de 800 μL.
4. Meça os valores de zeta-potencial para os três grupos.

5. Preparação da nano-matriz JBNt/matrilina-3 para microscopia eletrônica de transmissão (MET)

NOTA: A caracterização do MET é realizada para caracterizar a morfologia do JBNts e JBNm.

1. Inserir duas grades em um limpador de plasma para limpar adequadamente as grades antes da coloração negativa do JBNts e JBNm de acordo com os protocolos publicados e protocolos do fabricante¹².
2. Criar uma solução JBNt de 200 μg/mL misturando 10 μL de 1 mg/mL de JBNts com 40 μL de água destilada.
3. Misture 30 μL de 100 μg/mL de matrilina-3 com 20 μL de 100 μg/mL de TGF-β1 e pipeta várias vezes. Adicionar 10 μL de JBNts de 1 mg/mL à mistura de matrilina-3/TGF-β1 para preparar a amostra JBNm. Mais uma vez, pipeta repetidamente.
4. Adicionar 3 μL da solução JBNt (200 μg/mL) e 3 μL da solução JBNm em grades separadas e deixá-las por 2 min.
5. Enxaguar cada grelha com 100 μL de solução de acetato de uranilo (0,5%). Use papéis de filtro para remover o excesso de solução e permitir que as grades sequem ao ar.
6. Operar um microscópio eletrônico de transmissão para observar e caracterizar adequadamente as amostras, conforme publicado anteriormente^11,12.

6. Medição dos espectros de absorção de proteínas marcadas com fluorescência

NOTA: A estrutura do JBNm é verificada pela observação das estruturas do JBNm com análise espectral de absorção.

1. Rotule o TGF-β1 usando um kit de rotulagem de proteínas seguindo as instruções do fabricante. Adicionar 20 μL de 20 μg/mL marcado com TGF-β1 a 25 μL de H₂O para fazer uma solução de teste de 8,9 μg/mL.
2. Rotule a matrilina-3 usando um kit de rotulagem separado. Adicionar 20 μL de 80 μg/mL de matrilina-3 marcada a 25 μL de H₂O para fazer uma solução de teste de 36 μg/mL.
   NOTA: A marcação do corante fluorescente do TGF-β1 resultou em uma concentração final de 20 μg/mL, enquanto a marcação da matrilina-3 resultou em uma concentração final de 80 μg/mL.
3. Misture 20 μL de 80 μg/mL de matrilina-3 marcada com 20 μL de 20 μg/mL de TGF-β1 e 5 μL de H₂O, resultando em um composto de TGF-β1/matrilina-3 marcado. Pipetar a mistura várias vezes para misturar.
4. Adicionar 5 μL de 1 mg/mL JBNts a 40 μL de H₂O, resultando em uma solução de 111 μg/mL.
5. Adicione 20 μL de 20 μg/mL marcados com TGF-β1 a 20 μL de 80 μg/mL de matrilina-3 marcados várias vezes. Adicionar 5 μL de JBNts de 1 mg/ml à solução de TGF-β1/matrilina-3 marcada e pipetar repetidamente para misturar adequadamente o composto.
   NOTA: As concentrações finais das amostras JBNt, TGF-β1 e matrilina-3 marcadas foram de 111 μg/mL, 8,9 μg/mL e 36 μg/mL, respectivamente.
6. Transfira cada grupo de amostra (isto é, TGF-β1 (etapa 6.1), matrilina-3 (etapa 6.2), TGF-β1/matrilina-3 (etapa 6.3), JBNts (etapa 6.4), JBNm (etapa 6.5)) para seu próprio poço de uma placa preta de 384 poços.
7. Carregue a placa preta de 384 poços em um leitor de microplacas multimodo e faça medições em comprimentos de onda de excitação de 488 nm e 555 nm, seguindo o protocolo do fabricante.

7. Ensaio da função biológica in vitro

1. Ensaio de adesão celular em câmaras de vidro de cobertura pré-revestidas
   1. Prepare duas cobertas com câmara com cinco grupos de amostras, pois uma tampa é usada para cada tipo de célula.
   2. Adicionar 1,25 μL de 1 mg/mL de JBNts a 198,75 μL de água destilada, resultando em uma solução de 6,25 μg/mL.
   3. Adicione 10 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 190 μL de água destilada, resultando em uma solução de 0,5 μg/mL.
   4. Adicionar 2,5 μL de 10 μg/mL de TGF-β1 a 197,5 μg/mL de água destilada, resultando em uma solução de 0,125 μg/mL.
   5. Para o grupo JBNm, adicione 10 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 2,5 μL de 10 μg/mLTGF-β1 e pipeta repetidamente. Adicionar 1,25 μL de JBNts com uma concentração de 1 mg/ml à solução de mistura e à pipeta. Finalmente, adicione 186,25 μL de água destilada para resultar em uma solução JBNm de 200 μL.
      1. Para o grupo controle, use 200 μL de água destilada.
   6. Adicione cada grupo de amostras em seu próprio poço de uma tampa com câmara nº 1.5. Coloque o vidro de cobertura num congelador a -80 °C durante 1 h e, em seguida, liofilizador com um instrumento liofilizador.
   7. Semeia células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) e células condrócitos humanas (10.000 células por poço) em cada poço dos óculos de cobertura com câmara preparados.
   8. Incubar os dois copos de cobertura durante 4 h numa incubadora a 37 °C. Em seguida, aspirar o meio de cultura celular e enxaguar duas vezes com PBS.
   9. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 5 minutos e, em seguida, remova e enxágue as amostras com PBS. Lave a amostra uma segunda vez para remover completamente o paraformaldeído a 4%.
   10. Incubar células com 100 μL de Triton-X a 0,1% por 10 min e lavar com PBS. Adicionar 100 μL de 0,165 μM de rodamina-faloidina a cada alvéolo. Aguarde 30 minutos e depois lave com PBS novamente.
   11. Adicione 0,1 μg/mL de DAPI a cada poço para manchar os núcleos. Aguarde 5 minutos e lave os poços com PBS duas vezes.
   12. Use um microscópio confocal espectral para observar a morfologia celular e capturar imagens fluorescentes.
   13. Além disso, analise o número de células e a morfologia usando um software de processamento de imagens. Abra o software e carregue as imagens. Adicione uma barra de escala e calibre o software. Conte o número de células em uma determinada área para cada amostra. Em seguida, use a ferramenta de medição para coletar dados sobre a morfologia celular para cada amostra.
2. Proliferação celular
   1. Prepare três placas de 96 poços não tratadas, adicionando cinco grupos de amostras a cada uma.
      1. Para o grupo JBNt, adicionar 3,75 μL de 1 mg/mL JBNts a 596,25 μL de água destilada, resultando em uma solução JBNt de 600 μL com concentração de 6,25 μg/mL.
      2. Para o grupo TGF-β1, adicionar 7,5 μL de 10 μg/mL de TGF-β1 a 592,5 μL de água destilada, resultando em uma solução de teste de 0,125 μg/mL.
      3. Para o grupo matrilina-3, adicionar 30 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 570 μL de água destilada, resultando em uma solução de teste de 0,5 μg/mL.
      4. Para o grupo JBNm, misture 7,5 μL de TGF-β1 de 10 μg/mL com 30 μL de matrilina-3 de 10 μg/mL e pipeta várias vezes, seguido da adição de 3,75 μL de JBNts de 1 mg/mL à solução.
      5. Diluir a solução de JBNm com 558,75 μL de água destilada para obter as concentrações finais de 6,25 μg/mL, 0,125 μg/mL e 0,5 μg/mL, respectivamente, para as amostras JBNt, TGF-β1 e matrilina-3.
      6. Para o grupo controle, use 600 μL de água destilada.
   2. Divida cada grupo de amostras em seis poços (100 μL de amostra por poço).
   3. Colocar as três placas contendo todas as amostras num congelador de -80 °C durante 1 h e, em seguida, liofilizar com um instrumento liofilizador.
   4. Semear hMSCs nessas placas, cada uma recebendo uma suspensão celular de 100 μL (por poço) contendo 5.000 células. Incubar as três placas a 37 °C durante 1 dia, 3 dias ou 5 dias a 5% de CO₂.
   5. Adicionar 10 μL de solução de CCK-8 a cada poço com as células e incubar a 37 °C por mais 2 h.
   6. Meça os valores de absorção de cada poço com leitores de microplacas multimodo a 450 nm.
   7. Semeia um gradiente conhecido de hMSCs em uma placa de 96 poços e incube por 4 h. Use o ensaio CCK-8 para medir os valores de absorção do número conhecido de células e gerar uma curva padrão.
   8. Calcule a proliferação celular usando a curva padrão de absorção.
3. Teste de estabilidade
   NOTA: Um kit ELISA direcionado ao TGF-β1 humano foi usado para determinar a liberação percentual de TGF-β1 do JBNm em um hidrogel de agarose.
   1. Preparar 2% de agarose adicionando 400 mg de agarose em pó a 20 ml de PBS e aquecendo-a até 100 °C para dissolver completamente o pó de agarose.
   2. Prepare o JBNm dentro do hidrogel de agarose a 2% refrigerado.
      1. Combinar 10 μL de 10 μg/mL de TGF-β1, 40 μL de 10 μg/mL de matrilina-3, 5 μL de 1 mg/mL JBNts e 195 μL de PBS. Misture esta solução com 250 μL de agarose a 2%, criando o hidrogel JBNm.
   3. Adicione 500 μL de PBS, usando-o como uma solução de liberação, e certifique-se de alterá-lo a cada 3 dias. Mantenha todas as soluções liberadas e deixe a amostra descansar por 15 dias.
   4. Utilize um kit ELISA para testar cada uma das soluções de liberação capturadas, seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: Subtraindo a quantidade de TGF-β1 liberada no PBS do valor teórico de carga de 100%, a quantidade restante de TGF-β1 pode ser determinada.
4. Análise de diferenciação celular com PCR²⁶.
   1. Preparar sete grupos de amostras com cada amostra contendo 20 μL de suspensão celular (4 x 10⁴ células), 30 μL da solução específica (ou PBS, dependendo do grupo amostral) e 50 μL de acarose a 2 % em peso.
      1. Para o grupo TGF-β1, adicionar 5 μL de 10 μg/mL de TGF-β1 a 25 μL de PBS, resultando em uma solução de 1,6 μg/mL.
      2. Para o grupo matrilina-3, adicione 20 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 10 μL de PBS, resultando em uma solução de 6,7 μg/mL.
      3. Para o grupo JBNt, adicionar 2,5 μL de 1 mg/mL JBNts a 27,5 μL de PBS, resultando em uma solução de 83,3 μg/mL.
      4. Para o grupo JBNm J/T/M, adicionar 10 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 5 μL de TGF-β1 de 10 μg/mL e pipeta para cima e para baixo para misturar a solução. Em seguida, adicione 2,5 μL de 1 mg/mL de JBNts e pipeta novamente. Finalmente, diluir com 2,5 μL de PBS.
      5. Para cada grupo controle, use 30 μL de PBS como amostra.
   2. Adicione 0,5 mL de meio de cultura celular a cada poço, certificando-se de substituí-lo a cada 3 dias.
      1. Para o grupo controle positivo, use um meio condrogênico hMSC comercialmente disponível contendo TGF-β1 adicionado. Este TGF-β1 adicional é igual à quantidade nos grupos TGF-β1 e J/T/M JBNm.
      2. Para um dos grupos de controle negativos, use um meio condrogênico comercial de hMSC que não contenha TGF-β1. Para o outro grupo controle negativo, use um meio de cultura de células DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
      3. Para cada outro grupo, use um meio comercial de cultura de células condrogênicas hMSC sem TGF-β1.
   3. Cultive as amostras por 15 dias.
   4. Extrair o RNA das amostras e realizar a PCR para estudar a diferenciação das amostras conforme descrito anteriormente²⁶.
5. Imunocoloração para ensaio de expressão de colágeno tipo X
   1. Preparar sete amostras à base de agarose da mesma forma que a diferenciação celular com a secção do método de PCR (passo 7.4).
   2. Cultive as amostras por 15 dias.
   3. Fixar as amostras com formaldeído a 4% durante 1 dia, mergulhar em solução de sacarose a 30% durante a noite e, em seguida, congelar durante a noite a -80 °C com azoto líquido. Fixar as amostras utilizando o reagente composto de temperatura de corte ideal (OCT), uma mistura de glicóis e resinas solúveis em água, a -10 °C.
   4. Operar um micrótomo criostato para obter seções congeladas de 20 μm de espessura de cada amostra.
   5. Coloração de cada secção com um anticorpo Anti-Colagénio X com diluição 1:800 e um anticorpo secundário de marcação fluorescente diluído com PBS, de acordo com os protocolos do fabricante.
   6. Observe cada seção com um microscópio confocal, usando uma excitação de 488 nm e uma ampliação de 40x na ocular.

Resultados

Seguindo o protocolo, os JBNts foram sintetizados com sucesso e caracterizados com absorção de UV-Vis e MET. O JBNm é um andaime sólido injetável que passa por um rápido processo biomimético. Após a adição de JBNts a uma mistura de solução de TGF-β1/matrilina-3 em ambiente fisiológico, formou-se um andaime sólido de malha branca, indicando a montagem bem-sucedida do JBNm, como pode ser observado na Figura 1. Isso foi demonstrado nos métodos de caracterização.

Discussão

O objetivo deste estudo é desenvolver uma plataforma de andaimes biomiméticos, o JBNm, para superar as limitações dos construtos teciduais convencionais que dependem de ambientes de cultura celular para mediar a diferenciação celular. O JBNm é um andaime de estrutura camada por camada para uma construção de tecido cartilaginoso autossustentável. O design inovador é baseado em novos nanomateriais inspirados no DNA, os JBNts. O JBNm, composto por JBNts³⁰, TGF-β1 e matrilina-3, é montado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.