Fabrication et caractérisation de nano-matrice Janus Base couche par couche pour favoriser la régénération du cartilage

Résumé

Ce protocole décrit l’assemblage d’un échafaudage de nanomatrice de base Janus (JBNm) couche par couche en ajoutant des nanotubes de base Janus (JBNts), de la matriline-3 et du facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) séquentiellement. Le JBNm a été fabriqué et caractérisé; De plus, il a montré une excellente bioactivité, encourageant les fonctions cellulaires telles que l’adhésion, la prolifération et la différenciation.

Résumé

Divers échafaudages de biomatériaux ont été développés pour guider l’adhésion cellulaire et la prolifération dans l’espoir de promouvoir des fonctions spécifiques pour des utilisations in vitro et in vivo . L’ajout de facteurs de croissance dans ces échafaudages de biomatériaux est généralement effectué pour fournir un environnement de culture cellulaire optimal, médiant la différenciation cellulaire et ses fonctions ultérieures. Cependant, les facteurs de croissance d’un échafaudage de biomatériau conventionnel sont généralement conçus pour être libérés lors de l’implantation, ce qui pourrait entraîner des effets secondaires involontaires sur les tissus ou les cellules environnantes. Ici, la nano-matrice de base Janus (JBNm) inspirée de l’ADN a réussi à obtenir un microenvironnement hautement localisé avec une structure couche par couche pour des constructions de tissus cartilagineux autosuffisantes. Les JBNms sont auto-assemblés à partir de nanotubes de base Janus (JBNts), de matriline-3 et de facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1) via la bioaffinité. Le JBNm a été assemblé à un rapport TGF-β1:matriline-3:JBNt de 1:4:10, car c’est le rapport déterminé auquel l’assemblage approprié dans la structure couche par couche pourrait se produire. Tout d’abord, la solution TGF-β1 a été ajoutée à la solution matriline-3. Ensuite, ce mélange a été pipeté plusieurs fois pour assurer une homogénéité suffisante avant l’ajout de la solution JBNt. Cela a formé le JBNm couche par couche, après avoir pipeté plusieurs fois à nouveau. Diverses expériences ont été réalisées pour caractériser la structure JBNm couche par couche, JBNts seuls, matriline-3 seul et TGF-β1 seul. La formation de JBNm a été étudiée avec des spectres d’absorption UV-Vis, et la structure du JBNm a été observée avec la microscopie électronique à transmission (TEM). Comme l’échafaudage innovant JBNm couche par couche est formé à l’échelle moléculaire, le colorant fluorescent marqué JBNm a pu être observé. Le TGF-β1 est confiné dans la couche interne du JBNm injectable, ce qui peut empêcher la libération de facteurs de croissance dans les zones environnantes, favoriser la chondrogenèse localisée et promouvoir un microenvironnement antihypertrophique.

Introduction

Les échafaudages en ingénierie tissulaire jouent un rôle essentiel dans la fourniture d’un soutien structurel pour la fixation cellulaire et le développement ultérieur^{des tissus 1}. En règle générale, les constructions tissulaires conventionnelles sans aucun échafaudage reposent sur l’environnement de culture cellulaire et ont ajouté des facteurs de croissance pour arbitrer la différenciation cellulaire. De plus, cet ajout de molécules bioactives dans les échafaudages est souvent l’approche privilégiée pour guider la différenciation et la fonction^{cellulaires 2,3}. Certains échafaudages peuvent imiter le microenvironnement biochimique des tissus natifs indépendamment, tandis que d’autres peuvent influencer directement les fonctions cellulaires via des facteurs de croissance. Cependant, les chercheurs rencontrent souvent des difficultés dans la sélection d’échafaudages qui pourraient affecter positivement l’adhésion, la croissance et la différenciation cellulaires, tout en fournissant un soutien structurel optimal et une stabilité sur une longue période ^4,5. Les molécules bioactives sont souvent faiblement liées à l’échafaudage, ce qui entraîne une libération rapide de ces protéines lors de l’implantation, ce qui entraîne leur libération dans des endroits indésirables. Cela aboutit à des effets secondaires sur des tissus ou des cellules qui n’ont pas été intentionnellement ciblés ^6,7.

Les échafaudages sont généralement faits de matériaux polymères. La nano-matrice de base Janus (JBNm) est une plate-forme d’échafaudage biomimétique créée avec une nouvelle méthode couche par couche pour la construction autonome de tissus cartilagineux⁸. Ces nouveaux nanotubes inspirés de l’ADN ont été nommés nanotubes de base Janus (JBNts), car ils imitent correctement la structure et la chimie de surface du collagène trouvé dans la matrice extracellulaire (ECM). Avec l’ajout de molécules bioactives, telles que la matriline-3 et le facteur de croissance transformant bêta-1 (TGF-β1), le JBNm peut créer un microenvironnement optimal qui peut ensuite stimuler la fonctionnalité cellulaire et tissulaire souhaitée⁹.

Les JBNt sont de nouveaux nanotubes dérivés de versions synthétiques de la nucléobase adénine et thymine. Les JBNts sont formés par auto-assemblage¹⁰; Six nucléobases synthétiques se lient pour former un anneau, et ces anneaux subissent des interactions d’empilement π-π pour créer un nanotube de 200 à 300 μm de longueur¹¹. Ces nanotubes sont structurellement similaires aux protéines de collagène; En imitant un aspect du microenvironnement cartilagineux natif, il a été démontré que les JBNt fournissent un site de fixation favorable pour les chondrocytes et les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh)^11,12,13,14. Parce que les nanotubes subissent un auto-assemblage et ne nécessitent aucune sorte d’initiateur (comme la lumière UV), ils montrent un potentiel passionnant en tant qu’échafaudage injectable pour les zones de défauts difficiles à atteindre¹⁵.

La matriline-3 est une protéine structurelle de la matrice extracellulaire présente dans le cartilage. Cette protéine joue un rôle important dans la chondrogenèse et le bon fonctionnement du cartilage^16,17. Récemment, il a été inclus dans des échafaudages de biomatériaux, encourageant la chondrogenèse sans hypertrophie 9,18,19. En incluant cette protéine dans le JBNm, les cellules cartilagineuses sont attirées par un échafaudage qui contient des composants similaires à ceux de son microenvironnement natif. De plus, il a été démontré que la matriline-3 est nécessaire pour une signalisation correcte du TGF-β1 dans les chondrocytes²⁰. Les facteurs de croissance fonctionnent comme des molécules de signalisation, provoquant la croissance spécifique d’une certaine cellule ou tissu. Ainsi, pour obtenir une régénération optimale du cartilage, la matriline-3 et le TGF-β1 sont des composants essentiels du JBNm. L’ajout de TGF-β1 dans l’échafaudage couche par couche peut favoriser davantage la régénération du cartilage dans une construction tissulaire. Le TGF-β1 est un facteur de croissance utilisé pour favoriser le processus de guérison des défauts ostéochondrals, favorisant la prolifération et la différenciation des chondrocytes et des hMSC^21,22. Ainsi, le TGF-β1 joue un rôle clé dans la régénération du cartilage JBNm (J/T/M JBNm)²³, favorisant une bonne croissance surtout lorsqu’il est localisé dans les couches JBNm.

Comme mentionné précédemment, les facteurs de croissance sont généralement assemblés à l’extérieur des échafaudages sans méthodes spécifiques d’incorporation. Ici, avec la nano-architecture précisément conçue des biomatériaux, le JBNm a été développé pour un ciblage spécifique des cellules et des tissus prévus. Le JBNm est composé de TGF-β1 collé sur les surfaces JBNt dans la couche interne et de matriline-3 adhérée sur les surfaces JBNt dans la couche externe^24,25. L’incorporation de TGF-β1 dans la couche interne de la structure couche par couche permet un microenvironnement très localisé le long des fibres JBNm, créant une construction tissulaire homéostatique avec une libération beaucoup plus lente de la protéine¹². L’injectabilité du JBNm en fait une construction de tissu cartilagineux idéale pour diverses applications futures de biomatériaux²⁶.

Protocole

1. Synthèse des JBNts

1. Préparer le monomère JBNt en utilisant des méthodes précédemment publiées, impliquant la synthèse d’une variété de composés¹².
2. Purifier le monomère JBNt brut après sa synthèse par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide d’une colonne en phase inverse. Utilisez le solvant A : 100 % d’eau, le solvant B : 100 % d’acétonitrile et le solvant C : solution aqueuse HCl avec pH = 1. Utilisez un débit de 3 mL/min. Collecter le plus grand pic obtenu en CLHP à 7,2 min.

2. Fabrication pour JBNt/Matn1/TGF-β1 (Vidéo 1)

REMARQUE: La vidéo 1 montre que le JBNm est un solide injectable formé dans un environnement physiologique (solution d’eau, pas de lumière UV, pas d’additifs chimiques et pas de chauffage), qui est également d’inspiration biologique.

1. Ajouter 8 μL de TGF-β1 à 1 mg/mL de TGF-β1 en suspension dans H2O à₃₂μL de 1 mg/mL de matriline-3 en suspension dans_H2O. Pipette pour assurer un bon mélange de ces protéines.
2. Ajouter 80 μL de 1 mg/mL de JBNts en suspension dans_H2Oà la solution TGF-β1/matriline-3. Pipeter à plusieurs reprises pour assurer un bon mélange. La présence de floccules blancs peut être observée immédiatement après l’ajout de JBNts, indiquant la formation du JBNm (Vidéo 1).

3. Observation d’échantillons à absorption ultraviolet-visible (UV-Vis)

NOTE: Les spectres d’absorption UV-Vis ont été étudiés pour caractériser l’assemblage du JBNm. Cette mesure a été analysée pour quatre catégories: JBNts seul, matriline-3 seul, TGF-β1 seul et JBNm couche par couche, composé des trois parties. Toutes les concentrations initiales sont en suspension dans_H2O.

1. Pour le groupe JBNt, ajouter 5 μL de 1 mg/mL de JBNts à 50 μL de_H2Opour obtenir une solution de 90,9 μg/mL.
2. Pour le groupe matriline-3, ajouter 40 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 15 μL de_H2Opour obtenir une solution de 7,3 μg/mL.
3. Pour le groupe TGF-β1, ajouter 10 μL de TGF-β1 à 45 μL de_H2Opour obtenir une solution de 1,8 μg/mL.
4. Pour le groupe JBNm, ajouter 40 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de 10 μg/mL ^{de T}gf-β1. Agiter pour assurer un mélange approprié, puis ajouter 5 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution, en pipetant plusieurs fois pour mélanger l’échantillon.
5. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer le spectre d’absorption de chaque groupe.

4. Mesure du potentiel zêta des échantillons

NOTE: Le potentiel zêta a été analysé pour mieux prédire comment le JBNm interagirait avec les tissus in vivo . Trois groupes ont été mesurés : la matriline-3 seule, la matriline-3 avec TGF-β1, et le JBNm couche par couche complète.

1. Pour le groupe matriline-3, ajouter 160 μL de matriline-3 à 10 mg/mL de matriline-3 à 640 μL de_H2Opour obtenir une solution de 800 μL.
2. Pour le composé matriline-3/TGF-β1, ajouter 160 μL de 10 μg/mL de matriline-3 à 40 μL de 10 μg/mL de TGF-β1. Pipeter à plusieurs reprises pour assurer une homogénéité adéquate. Ensuite, ajoutez-le à 600 μL de_H2O, ce qui donne une solution de 800 μL.
3. Pour le groupe JBNm, ajouter 160 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de TGF-β1 à 40 μL de TGF-β1 à 10 μg/mL. Pipette plusieurs fois pour mélanger les protéines. Ensuite, ajouter 20 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution et à la pipette pour assurer l’homogénéité. Enfin, ajoutez la solution JBNm à 580 μL de_H2Opour obtenir une solution de 800 μL.
4. Mesurez les valeurs de potentiel zêta pour les trois groupes.

5. Préparation de la nano-matrice JBNt/matrilin-3 pour la microscopie électronique à transmission (MET)

NOTE: La caractérisation TEM est effectuée pour caractériser la morphologie des JBNts et JBNm.

1. Insérez deux grilles dans un nettoyeur plasma pour nettoyer correctement les grilles avant la coloration négative des JBNts et JBNm selon les protocoles publiés et les protocoles du fabricant¹².
2. Créer une solution de 200 μg/mL de JBNt en mélangeant 10 μL de JBNts à 1 mg/mL avec 40 μL d’eau distillée.
3. Mélanger 30 μL de matriline-3 à 100 μg/mL avec 20 μL de TGF-β1 à 100 μg/mL et à la pipette plusieurs fois. Ajouter 10 μL de 1 mg/mL de JBNts au mélange matriline-3/TGF-β1 pour préparer l’échantillon de JBNm. Encore une fois, pipette à plusieurs reprises.
4. Ajouter 3 μL de la solution JBNt (200 μg/mL) et 3 μL de la solution JBNm sur des grilles séparées, et laisser agir 2 min.
5. Rincer chaque grille avec 100 μL de solution d’acétate d’uranyle (0,5%). Utilisez des papiers filtres pour éliminer l’excès de solution et permettre aux grilles de sécher à l’air.
6. Utiliser un microscope électronique à transmission pour observer et caractériser correctement les échantillons, comme publié précédemment^11,12.

6. Mesure des spectres d’absorption des protéines marquées par fluorescence

NOTE: La structure de JBNm est vérifiée en observant les structures du JBNm avec une analyse spectrale d’absorption.

1. Étiquetez le TGF-β1 à l’aide d’un kit de marquage des protéines en suivant les instructions du fabricant. Ajouter 20 μL de TGF-β1 marqué à 25 μL de_H2Opour obtenir une solution d’essai de 8,9 μg/mL.
2. Étiquetez la matriline-3 à l’aide d’un kit d’étiquetage séparé. Ajouter 20 μL de matriline-3 marquée à 80 μg/mL de_H2Opour obtenir une solution d’essai de 36 μg/mL.
   REMARQUE : Le marquage par colorant fluorescent du TGF-β1 a donné une concentration finale de 20 μg/mL, tandis que le marquage de la matriline-3 a donné une concentration finale de 80 μg/mL.
3. Mélanger 20 μL de 80 μg/mL de matriline-3 marquée avec 20 μL de TGF-β1 marqué à 20 μg/mL et 5 μL de_H2O, ce qui donne un composé TGF-β1/matriline-3 marqué. Pipeter le mélange plusieurs fois pour mélanger.
4. Ajouter 5 μL de 1 mg/mL de JBNts à 40 μL de_H2O, ce qui donne une solution de 111 μg/mL.
5. Ajouter 20 μL de TGF-β1 marqué à 20 μL de matriline-3 marqué 80 μg/mL et pipette plusieurs fois. Ajouter 5 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution marquée de TGF-β1/matriline-3 et pipeter à plusieurs reprises pour bien mélanger le composé.
   REMARQUE : Les concentrations finales des échantillons de JBNt, de TGF-β1 marqué et de matriline-3 marquée étaient de 111 μg/mL, 8,9 μg/mL et 36 μg/mL, respectivement.
6. Transférer chaque groupe d’échantillons (c.-à-d. TGF-β1 marqué (étape 6.1), matriline-3 marqué (étape 6.2), marqué TGF-β1/matrilin-3 (étape 6.3), JBNts (étape 6.4), JBNm (étape 6.5)) dans leur propre puits d’une plaque noire de 384 puits.
7. Chargez la plaque noire à 384 puits dans un lecteur de microplaques multimode et prenez des mesures aux longueurs d’onde d’excitation de 488 nm et 555 nm en suivant le protocole du fabricant.

7. Essai de la fonction biologique in vitro

1. Test d’adhérence cellulaire sur chambres de verre de couverture pré-revêtues
   1. Préparez deux verres de couverture chambrés avec cinq groupes d’échantillons, car un verre de couverture est utilisé pour chaque type de cellule.
   2. Ajouter 1,25 μL de 1 mg/mL de JBNts à 198,75 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 6,25 μg/mL.
   3. Ajouter 10 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 190 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 0,5 μg/mL.
   4. Ajouter 2,5 μL de TGF-β1 à 197,5 μg/mL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 0,125 μg/mL.
   5. Pour le groupe JBNm, ajouter 10 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 2,5 μL de 10 μg/mLTGF-β1 et pipeter à plusieurs reprises. Ajouter 1,25 μL de JBNts à une concentration de 1 mg/mL à la solution de mélange et à la pipette. Enfin, ajoutez 186,25 μL d’eau distillée pour obtenir une solution de 200 μL de JBNm.
      1. Pour le groupe témoin, utiliser 200 μL d’eau distillée.
   6. Ajouter chaque groupe d’échantillons dans son propre puits d’un verre à couvercle chambré no 1.5. Placez le verre de couverture dans un congélateur à -80 °C pendant 1 h, puis lyophilisez-le avec un instrument lyophiliseur.
   7. Ensemencer des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) et des cellules chondrocytaires humaines (10 000 cellules par puits) dans chaque puits des verres de couverture chambrés préparés.
   8. Incuber les deux verres de couverture pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C. Ensuite, aspirez le milieu de culture cellulaire et rincez deux fois avec du PBS.
   9. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 5 min, puis prélever et rincer les échantillons avec du PBS. Rincer l’échantillon une deuxième fois pour éliminer complètement le paraformaldéhyde à 4%.
   10. Incuber les cellules avec 100 μL de Triton-X à 0,1% pendant 10 min et laver avec du PBS. Ajouter 100 μL de rhodamine-phalloïdine 0,165 μM à chaque puits. Attendez 30 minutes, puis lavez à nouveau avec PBS.
   11. Ajouter 0,1 μg/mL de DAPI à chaque puits pour colorer les noyaux. Attendez 5 minutes et rincez les puits avec du PBS deux fois.
   12. Utilisez un microscope confocal spectral pour observer la morphologie cellulaire et capturer des images fluorescentes.
   13. De plus, analysez le nombre de cellules et la morphologie à l’aide d’un logiciel de traitement d’images. Ouvrez le logiciel et chargez les images. Ajoutez une barre d’échelle et calibrez le logiciel. Comptez le nombre de cellules dans une zone donnée pour chaque échantillon. Ensuite, utilisez l’outil de mesure pour collecter des données sur la morphologie cellulaire de chaque échantillon.
2. Prolifération cellulaire
   1. Préparer trois plaques non traitées de 96 puits, en ajoutant cinq groupes d’échantillons à chacune.
      1. Pour le groupe JBNt, ajouter 3,75 μL de 1 mg/mL de JBNts à 596,25 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution de 600 μL de JBNt à une concentration de 6,25 μg/mL.
      2. Pour le groupe TGF-β1, ajouter 7,5 μL de TGF-β1 à 592,5 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution d’essai de 0,125 μg/mL.
      3. Pour le groupe matriline-3, ajouter 30 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de matriline-3 à 570 μL d’eau distillée, ce qui donne une solution d’essai de 0,5 μg/mL.
      4. Pour le groupe JBNm, mélanger 7,5 μL de TGF-β1 à 10 μg/mL avec 30 μL de matriline-3 à 10 μg/mL et une pipette plusieurs fois, puis ajouter 3,75 μL de JBNts à 1 mg/mL à la solution.
      5. Diluer la solution de JBNm avec 558,75 μL d’eau distillée pour obtenir les concentrations finales de 6,25 μg/mL, 0,125 μg/mL et 0,5 μg/mL, respectivement, pour les échantillons de JBNt, TGF-β1 et matrilin-3.
      6. Pour le groupe témoin, utiliser 600 μL d’eau distillée.
   2. Diviser chaque groupe d’échantillons en six puits (échantillon de 100 μL par puits).
   3. Placer les trois plaques contenant tous les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant 1 h, puis lyophiliser avec un instrument lyophilisant.
   4. Ensemencer les CSMh sur ces plaques, chacune recevant une suspension cellulaire de 100 μL (par puits) contenant 5 000 cellules. Incuber les trois plaques à 37 °C pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours à 5% CO₂.
   5. Ajouter 10 μL de solution CCK-8 à chaque puits avec les cellules et incuber à 37 °C pendant 2 h supplémentaires.
   6. Mesurez les valeurs d’absorption de chaque puits avec des lecteurs de microplaques multimodes à 450 nm.
   7. Ensemencer un gradient connu de CSMh sur une plaque de 96 puits et incuber pendant 4 h. Utilisez le test CCK-8 pour mesurer les valeurs d’absorption du nombre connu de cellules et générer une courbe standard.
   8. Calculer la prolifération cellulaire à l’aide de la courbe standard d’absorption.
3. Essai de stabilité
   REMARQUE : Une trousse ELISA humaine ciblant le TGF-β1 a été utilisée pour déterminer le pourcentage de libération de TGF-β1 du JBNm dans un hydrogel d’agarose.
   1. Préparer l’agarose à 2 % en ajoutant 400 mg de poudre d’agarose à 20 mL de PBS et en la chauffant jusqu’à 100 °C pour dissoudre complètement la poudre d’agarose.
   2. Préparez le JBNm à l’intérieur de l’hydrogel d’agarose à 2% refroidi.
      1. Combiner 10 μL de 10 μg/mL de TGF-β1, 40 μL de 10 μg/mL de matriline-3, 5 μL de 1 mg/mL de JBNts et 195 μL de PBS. Mélanger cette solution avec 250 μL d’agarose à 2%, créant l’hydrogel JBNm.
   3. Ajoutez 500 μL de PBS, en l’utilisant comme solution de libération, et assurez-vous de le changer tous les 3 jours. Conservez chaque solution libérée et laissez reposer l’échantillon pendant 15 jours.
   4. Utilisez un kit ELISA pour tester chacune des solutions de libération capturées, en suivant les instructions du fabricant.
      NOTA: En soustrayant la quantité de TGF-β1 rejetée dans le PBS de la valeur de charge théorique de 100%, la quantité restante de TGF-β1 peut être déterminée.
4. Analyse de différenciation cellulaire avec PCR²⁶.
   1. Préparer sept groupes d’échantillons avec chaque échantillon contenant 20 μL de suspension cellulaire (4 x 10⁴ cellules), 30 μL de la solution spécifique (ou PBS, selon le groupe d’échantillon) et 50 μL de 2 % en poids d’agarose.
      1. Pour le groupe TGF-β1, ajouter 5 μL de TGF-β1 à 25 μL de PBS, ce qui donne une solution de 1,6 μg/mL.
      2. Pour le groupe matriline-3, ajouter 20 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de PBS, ce qui donne une solution de 6,7 μg/mL.
      3. Pour le groupe JBNt, ajouter 2,5 μL de 1 mg/mL de JBNts à 27,5 μL de PBS, ce qui donne une solution de 83,3 μg/mL.
      4. Pour le groupe J/T/M JBNm, ajouter 10 μL de matriline-3 à 10 μg/mL de TGF-β1 à 5 μL de TGF-β1 à 10 μg/mL et pipeter de haut en bas pour mélanger la solution. Ensuite, ajoutez 2,5 μL de 1 mg/mL de JBNts et pipette à nouveau. Enfin, diluer avec 2,5 μL de PBS.
      5. Pour chaque groupe témoin, utiliser 30 μL de PBS comme échantillon.
   2. Ajouter 0,5 mL de milieu de culture cellulaire à chaque puits, en veillant à le remplacer tous les 3 jours.
      1. Pour le groupe témoin positif, utiliser un milieu chondrogène hMSC disponible dans le commerce contenant du TGF-β1 ajouté. Ce TGF-β1 supplémentaire est égal à la quantité dans les groupes TGF-β1 et J/T/M JBNm.
      2. Pour l’un des groupes témoins négatifs, utiliser un milieu chondrogène hMSC commercial qui ne contient pas de TGF-β1. Pour l’autre groupe témoin négatif, utiliser un milieu de culture cellulaire DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
      3. Pour tous les autres groupes, utiliser un milieu de culture cellulaire chondrogène hMSC commercial sans TGF-β1.
   3. Culture des échantillons pendant 15 jours.
   4. Extraire l’ARN des échantillons et effectuer une PCR pour étudier la différenciation des échantillons comme décrit précédemment²⁶.
5. Immunomarquage pour le dosage d’expression du collagène de type X
   1. Préparer sept échantillons à base d’agarose de la même manière que la différenciation cellulaire avec la section de la méthode PCR (étape 7.4).
   2. Culture des échantillons pendant 15 jours.
   3. Fixez les échantillons avec 4% de formaldéhyde pendant 1 jour, faites tremper dans une solution de saccharose à 30% pendant une nuit, puis congelez toute la nuit à -80 °C avec de l’azote liquide. Fixez les échantillons à l’aide du réactif composé (OCT) à température de coupe optimale, un mélange de glycols et de résines solubles dans l’eau, à -10 °C.
   4. Utiliser un microtome cryostat pour obtenir des sections congelées de 20 μm d’épaisseur de chaque échantillon.
   5. Colorer chaque section avec un anticorps anti-collagène X avec une dilution de 1:800 et un anticorps secondaire de marquage fluorescent dilué avec du PBS, selon les protocoles du fabricant.
   6. Observez chaque section avec un microscope confocal, en utilisant une excitation de 488 nm et un grossissement de 40x sur l’oculaire.

Résultats

Conformément au protocole, les JBNt ont été synthétisés avec succès et caractérisés par absorption UV-Vis et MET. Le JBNm est un échafaudage solide injectable qui subit un processus biomimétique rapide. Après l’ajout de JBNts à un mélange de solution de TGF-β1/matriline-3 dans un environnement physiologique, un échafaudage solide à mailles blanches a été formé indiquant l’assemblage réussi de JBNm, comme le montre la figure 1. Cela a été démontré dans les méthode...

Discussion

L’objectif de cette étude est de développer une plateforme d’échafaudage biomimétique, le JBNm, pour surmonter les limites des constructions tissulaires conventionnelles qui reposent sur des environnements de culture cellulaire pour arbitrer la différenciation cellulaire. Le JBNm est un échafaudage de structure couche par couche pour une construction de tissu cartilagineux autonome. La conception innovante est basée sur de nouveaux nanomatériaux inspirés de l’ADN, les JBNts. Le JBNm, composé de JBNts

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.