Fabbricazione e caratterizzazione di nano-matrice di base Janus strato per strato per promuovere la rigenerazione della cartilagine

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'assemblaggio di un'impalcatura a nano-matrice di base Janus (JBNm) strato per strato aggiungendo sequenzialmente nanotubi di base Janus (JBNts), matrilina-3 e fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1). Il JBNm è stato fabbricato e caratterizzato; Inoltre, ha mostrato un'eccellente bioattività, incoraggiando le funzioni cellulari come l'adesione, la proliferazione e la differenziazione.

Abstract

Sono stati sviluppati vari scaffold di biomateriali per guidare l'adesione e la proliferazione cellulare nella speranza di promuovere funzioni specifiche per usi in vitro e in vivo . L'aggiunta di fattori di crescita in questi scaffold di biomateriali viene generalmente effettuata per fornire un ambiente di coltura cellulare ottimale, mediando la differenziazione cellulare e le sue successive funzioni. Tuttavia, i fattori di crescita in uno scaffold di biomateriale convenzionale sono tipicamente progettati per essere rilasciati al momento dell'impianto, il che potrebbe causare effetti collaterali non intenzionali sui tessuti o sulle cellule circostanti. Qui, la nano-matrice di base Janus ispirata al DNA (JBNm) ha ottenuto con successo un microambiente altamente localizzato con una struttura strato per strato per costrutti di tessuto cartilagineo autosostenibili. I JBNm sono auto-assemblati da nanotubi di base Janus (JBNts), matrilina-3 e fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1) tramite bioaffinità. Il JBNm è stato assemblato con un rapporto TGF-β1:matrilin-3:JBNt di 1:4:10, poiché questo è stato il rapporto determinato al quale potrebbe avvenire un corretto assemblaggio nella struttura strato per strato. In primo luogo, la soluzione TGF-β1 è stata aggiunta alla soluzione di matrilina-3. Quindi, questa miscela è stata pipettata più volte per garantire una sufficiente omogeneità prima dell'aggiunta della soluzione JBNt. Questo ha formato il JBNm strato per strato, dopo aver pipettettato più volte di nuovo. Sono stati eseguiti una varietà di esperimenti per caratterizzare la struttura JBNm strato per strato, JBNts da solo, matrilina-3 da solo, e TGF-β1 da solo. La formazione di JBNm è stata studiata con spettri di assorbimento UV-Vis e la struttura del JBNm è stata osservata con microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Poiché l'innovativa impalcatura JBNm strato per strato si forma su scala molecolare, è stato possibile osservare il JBNm marcato con colorante fluorescente. Il TGF-β1 è confinato all'interno dello strato interno del JBNm iniettabile, che può impedire il rilascio di fattori di crescita nelle aree circostanti, promuovere la condrogenesi localizzata e promuovere un microambiente anti-ipertrofico.

Introduzione

Gli scaffold nell'ingegneria tissutale svolgono un ruolo vitale nel fornire supporto strutturale per l'attaccamento cellulare e il successivo sviluppo tissutale¹. Tipicamente, i costrutti tissutali convenzionali senza alcuna impalcatura si basano sull'ambiente di coltura cellulare e sui fattori di crescita aggiunti per mediare la differenziazione cellulare. Inoltre, questa aggiunta di molecole bioattive negli scaffold è spesso l'approccio preferito nel guidare la differenziazione e la funzione cellulare ^2,3. Alcuni scaffold possono imitare il microambiente biochimico dei tessuti nativi in modo indipendente, mentre altri possono influenzare direttamente le funzioni cellulari attraverso fattori di crescita. Tuttavia, i ricercatori incontrano spesso sfide nella selezione di scaffold che potrebbero influenzare positivamente l'adesione, la crescita e la differenziazione cellulare, fornendo al contempo supporto strutturale e stabilità ottimali per un lungo periodo ^4,5. Le molecole bioattive sono spesso legate liberamente allo scaffold portando a un rapido rilascio di queste proteine al momento dell'impianto, con conseguente rilascio in posizioni indesiderate. Ciò culmina in effetti collaterali su tessuti o cellule che non sono stati intenzionalmente mirati ^6,7.

Gli scaffold sono tipicamente realizzati con materiali polimerici. La nano-matrice di base Janus (JBNm) è una piattaforma di scaffold biomimetica creata con un nuovo metodo strato per strato per il costrutto autosostenibile del tessuto cartilagineo⁸. Questi nuovi nanotubi ispirati al DNA sono stati chiamati Janus base nanotubes (JBNts), poiché imitano correttamente la struttura e la chimica superficiale del collagene presente nella matrice extracellulare (ECM). Con l'aggiunta di molecole bioattive, come la matrilina-3 e il fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1), il JBNm può creare un microambiente ottimale che può quindi stimolare la funzionalità cellulare e tissutale desiderata⁹.

I JBNt sono nuovi nanotubi derivati da versioni sintetiche della nucleobase adenina e della timina. I JBNt sono formati attraverso l'auto-assemblaggio¹⁰; Sei nucleobasi sintetiche si legano per formare un anello, e questi anelli subiscono interazioni di impilamento π-π per creare un nanotubo di 200-300 μm di lunghezza¹¹. Questi nanotubi sono strutturalmente simili alle proteine del collagene; imitando un aspetto del microambiente cartilagineo nativo, i JBNt hanno dimostrato di fornire un sito di attacco favorevole per i condrociti e le cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs)^11,12,13,14. Poiché i nanotubi subiscono l'auto-assemblaggio e non richiedono alcun tipo di iniziatore (come la luce UV), mostrano un potenziale entusiasmante come impalcatura iniettabile per aree difettose difficili da raggiungere¹⁵.

La matrilina-3 è una proteina strutturale della matrice extracellulare presente nella cartilagine. Questa proteina svolge un ruolo significativo nella condrogenesi e nella corretta funzione della cartilagine^16,17. Recentemente, è stato incluso negli scaffold di biomateriali, favorendo la condrogenesi senza ipertrofia 9,18,19. Includendo questa proteina nel JBNm, le cellule della cartilagine sono attratte da un'impalcatura che contiene componenti simili a quelli del suo microambiente nativo. Inoltre, è stato dimostrato che la matrilina-3 è necessaria per una corretta segnalazione del TGF-β1 all'interno dei condrociti²⁰. I fattori di crescita funzionano come molecole di segnalazione, causando la crescita specifica di una determinata cellula o tessuto. Pertanto, per ottenere una rigenerazione ottimale della cartilagine, matrilina-3 e TGF-β1 sono componenti essenziali all'interno del JBNm. L'aggiunta di TGF-β1 nello scaffold strato per strato può promuovere ulteriormente la rigenerazione della cartilagine in un costrutto tissutale. Il TGF-β1 è un fattore di crescita impiegato per favorire il processo di guarigione dei difetti osteocondrali, favorendo la proliferazione e la differenziazione dei condrociti e delle hMSC^21,22. Pertanto, TGF-β1 svolge un ruolo chiave nella rigenerazione della cartilagine JBNm (J/T/M JBNm)²³, incoraggiando una corretta crescita soprattutto quando è localizzato all'interno degli strati JBNm.

Come accennato in precedenza, i fattori di crescita sono tipicamente assemblati all'esterno delle impalcature senza metodi specifici di incorporazione. Qui, con la nano-architettura progettata con precisione dei biomateriali, il JBNm è stato sviluppato per il targeting specifico delle cellule e dei tessuti previsti. Il JBNm è composto da TGF-β1 aderito su superfici JBNt nello strato interno e matrilina-3 aderente su superfici JBNt nello strato esterno^24,25. L'incorporazione di TGF-β1 nello strato interno della struttura strato per strato consente un microambiente altamente localizzato lungo le fibre JBNm, creando un costrutto tissutale omeostatico con un rilascio molto più lento della proteina¹². L'iniettabilità del JBNm lo rende un costrutto di tessuto cartilagineo ideale per varie applicazioni future di biomateriali²⁶.

Protocollo

1. Sintesi di JBNts

1. Preparare il monomero JBNt utilizzando metodi precedentemente pubblicati, che coinvolgono la sintesi di una varietà di composti¹².
2. Purificare il monomero JBNt grezzo dopo che è stato sintetizzato con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) utilizzando una colonna di fase inversa. Utilizzare solvente A: 100% acqua, solvente B: 100% acetonitrile e solvente C: soluzione acquosa HCl con pH = 1. Utilizzare una portata di 3 ml/min. Raccogliere il picco più grande ottenuto nell'HPLC a 7,2 min.

2. Fabbricazione per JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

NOTA: Il video 1 mostra che il JBNm è un solido iniettabile formato in un ambiente fisiologico (soluzione acquosa, assenza di luce UV, assenza di additivi chimici e senza riscaldamento), anch'esso di ispirazione biologica.

1. Aggiungere 8 μL di 1 mg/mL di TGF-β1 sospeso in H 2 O a 32 μL di 1 mg/mL di matrilina-3 sospesa in H₂O. Pipetta per garantire una correttamiscelazione di queste proteine.
2. Aggiungere 80 μL di 1 mg/mL di JBNts sospesi in H₂O alla soluzione di TGF-β1/matrilina-3. Pipettare ripetutamente per garantire una corretta miscelazione. La presenza di flocculi bianchi può essere osservata immediatamente dopo l'aggiunta di JBNts, indicando la formazione del JBNm (Video 1).

3. Osservazione di campioni con assorbimento ultravioletto-visibile (UV-Vis)

NOTA: Gli spettri di assorbimento UV-Vis sono stati studiati per caratterizzare l'assemblaggio del JBNm. Questa misurazione è stata analizzata per quattro categorie: JBNts da solo, matrilina-3 da solo, TGF-β1 da solo e l'intero JBNm strato per strato, composto da tutte e tre le parti. Tutte le concentrazioni iniziali sono sospese in H₂O.

1. Per il gruppo JBNt, aggiungere 5 μL di 1 mg/mL di JBNts a 50 μL di H₂O per ottenere una soluzione da 90,9 μg/mL.
2. Per il gruppo matrilina-3, aggiungere 40 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 15 μL di H₂O per ottenere una soluzione da 7,3 μg/ml.
3. Per il gruppo TGF-β1, aggiungere 10 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 a 45 μL di H₂O per ottenere una soluzione da 1,8 μg/ml.
4. Per il gruppo JBNm, aggiungere 40 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 10 μL di 10 μg/mL ^TGF-β1. Agitare per garantire una corretta miscelazione, quindi aggiungere 5 μL di 1 mg/mL di JBNts alla soluzione, pipettando ripetutamente per miscelare il campione.
5. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare lo spettro di assorbimento di ciascun gruppo.

4. Misurazione del potenziale zeta dei campioni

NOTA: Il potenziale zeta è stato analizzato per prevedere meglio come il JBNm interagirebbe con il tessuto in vivo . Sono stati misurati tre gruppi: matrilina-3 da sola, matrilina-3 con TGF-β1 e JBNm strato per strato.

1. Per il gruppo matrilina-3, aggiungere 160 μL di matrilina-3 da 10 mg/ml a 640 μL di H₂O per ottenere una soluzione da 800 μL.
2. Per il composto matrilina-3/TGF-β1, aggiungere 160 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 40 μL di TGF-β1 da 10 μg/mL. Pipettare ripetutamente per garantire la corretta omogeneità. Quindi, aggiungerlo a 600 μL di H₂O ottenendo una soluzione di 800 μL.
3. Per il gruppo JBNm, aggiungere 160 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 40 μL di TGF-β1 da 10 μg/ml. Pipettare più volte per mescolare le proteine. Quindi, aggiungere 20 μL di 1 mg/mL di JBNts alla soluzione e pipettare per garantire l'omogeneità. Infine, aggiungere la soluzione JBNm a 580 μL di H₂O per produrre una soluzione da 800 μL.
4. Misurare i valori del potenziale zeta per i tre gruppi.

5. Preparazione di nano-matrice JBNt/matrilin-3 per microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

NOTA: La caratterizzazione TEM viene eseguita per caratterizzare la morfologia di JBNts e JBNm.

1. Inserire due griglie in un pulitore al plasma per pulire correttamente le griglie prima della colorazione negativa di JBNts e JBNm secondo i protocolli pubblicati e i protocolli del produttore¹².
2. Creare una soluzione di 200 μg/mL di JBNt mescolando 10 μL di 1 mg/mL di JBNt con 40 μL di acqua distillata.
3. Mescolare 30 μL di matrilina-3 da 100 μg/mL con 20 μL di TGF-β1 da 100 μg/mL e pipettare più volte. Aggiungere 10 μL di 1 mg/mL di JBNts alla miscela matrilina-3/TGF-β1 per preparare il campione di JBNm. Ancora una volta, pipetta ripetutamente.
4. Aggiungere 3 μL della soluzione JBNt (200 μg/mL) e 3 μL della soluzione JBNm su griglie separate, e lasciarli per 2 minuti.
5. Risciacquare ogni griglia con 100 μL di soluzione di acetato di uranile (0,5%). Utilizzare carta da filtro per rimuovere la soluzione in eccesso e lasciare asciugare le griglie all'aria.
6. Utilizzare un microscopio elettronico a trasmissione per osservare e caratterizzare correttamente i campioni, come pubblicato in precedenza^11,12.

6. Misurazione degli spettri di assorbimento di proteine marcate con fluorescenza

NOTA: La struttura di JBNm viene verificata osservando le strutture del JBNm con analisi spettrale di assorbimento.

1. Etichettare il TGF-β1 utilizzando un kit di etichettatura proteica seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20 μL di 20 μg/mL marcato TGF-β1 a 25 μL di H₂O per ottenere una soluzione di prova da 8,9 μg/ml.
2. Etichettare la matrilin-3 utilizzando un kit di etichettatura separato. Aggiungere 20 μL di matrilina-3 marcata con 80 μg/mL a 25 μL di H₂O per ottenere una soluzione di prova da 36 μg/ml.
   NOTA: L'etichettatura del colorante fluorescente del TGF-β1 ha portato a una concentrazione finale di 20 μg/ml, mentre l'etichettatura della matrilina-3 ha portato ad una concentrazione finale di 80 μg/ml.
3. Mescolare 20 μL di matrilina-3 marcata con 80 μg/mL con 20 μL di TGF-β1 marcato con 20 μg/mL e 5 μL di H₂O, ottenendo un composto TGF-β1/matrilina-3 marcato. Pipettare la miscela più volte per mescolare.
4. Aggiungere 5 μL di 1 mg/mL di JBNts a 40 μL di H₂O, ottenendo una soluzione da 111 μg/mL.
5. Aggiungere 20 μL di 20 μg/mL marcato TGF-β1 a 20 μL di matrilina-3 marcata con 80 μg/mL e pipettare più volte. Aggiungere 5 μL di 1 mg/mL di JBNts alla soluzione marcata di TGF-β1/matrilina-3 e pipettare ripetutamente per miscelare correttamente il composto.
   NOTA: Le concentrazioni finali del JBNt, marcato TGF-β1, e dei campioni marcati matrilina-3 erano rispettivamente 111 μg / mL, 8,9 μg / ml e 36 μg / ml.
6. Trasferire ogni gruppo di campioni (cioè marcato TGF-β1 (passo 6.1), marcato matrilina-3 (passo 6.2), marcato TGF-β1/matrilina-3 (passo 6.3), JBNts (passo 6.4), JBNm (passo 6.5)) nel proprio pozzetto di una piastra nera da 384 pozzetti.
7. Caricare la piastra nera a 384 pozzetti in un lettore di micropiastre multimodale ed effettuare misurazioni a lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm e 555 nm seguendo il protocollo del produttore.

7. Saggio di funzione biologica in vitro

1. Test di adesione cellulare su camere di vetro di copertura preverniciate
   1. Preparare due coverglass camerati con cinque gruppi di campioni, poiché per ogni tipo di cella viene utilizzato un vetro di copertura.
   2. Aggiungere 1,25 μL di 1 mg/mL di JBNts a 198,75 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione da 6,25 μg/ml.
   3. Aggiungere 10 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 190 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione di 0,5 μg/ml.
   4. Aggiungere 2,5 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 a 197,5 μg/mL di acqua distillata, ottenendo una soluzione da 0,125 μg/ml.
   5. Per il gruppo JBNm, aggiungere 10 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 2,5 μL di 10 μg/mLTGF-β1 e pipettare ripetutamente. Aggiungere 1,25 μL di JBNts con una concentrazione di 1 mg/mL alla soluzione di miscela e alla pipetta. Infine, aggiungere 186,25 μL di acqua distillata per ottenere una soluzione JBNm da 200 μL.
      1. Per il gruppo di controllo, utilizzare 200 μL di acqua distillata.
   6. Aggiungere ogni gruppo di campioni nel proprio pozzetto di un vetro di copertura a camera n. 1,5. Mettere il vetro di copertura in un congelatore a -80 °C per 1 ora, quindi liofilizzarlo con uno strumento liofilizzatore.
   7. Seminare cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) e cellule condrocitarie umane (10.000 cellule per pozzetto) in ciascun pozzetto degli occhiali di copertura camerati preparati.
   8. Incubare i due coverglass per 4 ore in un'incubatrice a 37 °C. Quindi, aspirare il terreno di coltura cellulare e risciacquare due volte con PBS.
   9. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 5 minuti, quindi rimuovere e risciacquare i campioni con PBS. Risciacquare il campione una seconda volta per rimuovere completamente la paraformaldeide al 4%.
   10. Incubare le cellule con 100 μL di Triton-X allo 0,1% per 10 minuti e lavare con PBS. Aggiungere 100 μL di rodamina-falloidina 0,165 μM a ciascun pozzetto. Attendere 30 minuti e quindi lavare nuovamente con PBS.
   11. Aggiungere 0,1 μg/mL DAPI a ciascun pozzetto per colorare i nuclei. Attendere 5 minuti e sciacquare i pozzetti con PBS due volte.
   12. Utilizzare un microscopio confocale spettrale per osservare la morfologia cellulare e catturare immagini fluorescenti.
   13. Inoltre, analizzare il numero di cellule e la morfologia utilizzando il software di elaborazione delle immagini. Apri il software e carica le immagini. Aggiungi una barra della scala e calibra il software. Contare il numero di celle in una determinata area per ogni campione. Quindi, utilizzare lo strumento di misurazione per raccogliere dati sulla morfologia cellulare per ciascun campione.
2. Proliferazione cellulare
   1. Preparare tre piastre da 96 pozzetti non trattate, aggiungendo cinque gruppi di campioni a ciascuna.
      1. Per il gruppo JBNt, aggiungere 3,75 μL di 1 mg/mL di JBNts a 596,25 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione di JBNt da 600 μL con una concentrazione di 6,25 μg/mL.
      2. Per il gruppo TGF-β1, aggiungere 7,5 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 a 592,5 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione di prova di 0,125 μg/ml.
      3. Per il gruppo matrilina-3, aggiungere 30 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 570 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione di prova da 0,5 μg/ml.
      4. Per il gruppo JBNm, miscelare 7,5 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 con 30 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL e pipettare più volte, quindi aggiungere 3,75 μL di 1 mg/mL di JBNts alla soluzione.
      5. Diluire la soluzione di JBNm con 558,75 μL di acqua distillata per ottenere le concentrazioni finali di 6,25 μg/mL, 0,125 μg/mL e 0,5 μg/mL, rispettivamente, per campioni di JBNt, TGF-β1 e matrilina-3.
      6. Per il gruppo di controllo, utilizzare 600 μL di acqua distillata.
   2. Dividere ciascun gruppo di campioni in sei pozzetti (100 μL di campione per pozzetto).
   3. Porre le tre piastre contenenti tutti i campioni in un congelatore a -80 °C per 1 ora e poi liofilizzare con uno strumento liofilizzante.
   4. Seminare hMSC su queste piastre, ciascuna ricevendo una sospensione cellulare di 100 μL (per pozzetto) contenente 5.000 cellule. Incubare le tre piastre a 37 °C per 1 giorno, 3 giorni o 5 giorni al 5% di CO₂.
   5. Aggiungere 10 μL di soluzione di CCK-8 a ciascun pozzetto con le cellule e incubare a 37 °C per altre 2 ore.
   6. Misurare i valori di assorbimento di ciascun pozzetto con lettori di micropiastre multimodali a 450 nm.
   7. Seminare un gradiente noto di hMSC su una piastra a 96 pozzetti e incubare per 4 ore. Utilizzare il test CCK-8 per misurare i valori di assorbimento del numero noto di cellule e generare una curva standard.
   8. Calcolare la proliferazione cellulare utilizzando la curva standard di assorbimento.
3. Test di stabilità
   NOTA: Un kit ELISA mirato al TGF-β1 umano è stato utilizzato per determinare la percentuale di rilascio di TGF-β1 dal JBNm in un idrogel di agarosio.
   1. Preparare il 2% di agarosio aggiungendo 400 mg di polvere di agarosio a 20 ml di PBS e riscaldandolo fino a 100 °C per sciogliere completamente la polvere di agarosio.
   2. Preparare il JBNm all'interno dell'idrogel di agarosio raffreddato al 2%.
      1. Combinare 10 μL di 10 μg/mL di TGF-β1, 40 μL di 10 μg/mL di matrilina-3, 5 μL di 1 mg/mL di JBNts e 195 μL di PBS. Mescolare questa soluzione con 250 μL di agarosio al 2%, creando l'idrogel JBNm.
   3. Aggiungere 500 μL di PBS, utilizzandolo come soluzione di rilascio, e assicurarsi di cambiarlo ogni 3 giorni. Conservare ogni soluzione rilasciata e lasciare riposare il campione per 15 giorni.
   4. Utilizzare un kit ELISA per testare ciascuna delle soluzioni di rilascio acquisite, seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: sottraendo la quantità di TGF-β1 rilasciata nel PBS dal valore di carico teorico del 100%, è possibile determinare la quantità rimanente di TGF-β1.
4. Analisi del differenziamento cellulare con PCR²⁶.
   1. Preparare sette gruppi di campioni con ciascun campione contenente 20 μL di sospensione cellulare (4 x 10⁴ cellule), 30 μL della soluzione specifica (o PBS, a seconda del gruppo del campione) e 50 μL di agarosio al 2% in peso.
      1. Per il gruppo TGF-β1, aggiungere 5 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 a 25 μL di PBS, ottenendo una soluzione da 1,6 μg/mL.
      2. Per il gruppo matrilina-3, aggiungere 20 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 10 μL di PBS, ottenendo una soluzione da 6,7 μg/ml.
      3. Per il gruppo JBNt, aggiungere 2,5 μL di 1 mg/mL di JBNts a 27,5 μL di PBS, ottenendo una soluzione di 83,3 μg/mL.
      4. Per il gruppo J/T/M JBNm, aggiungere 10 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 5 μL di TGF-β1 da 10 μg/mL e pipettare su e giù per miscelare la soluzione. Quindi, aggiungere 2,5 μL di 1 mg/mL di JBNts e pipettare nuovamente. Infine, diluire con 2,5 μL di PBS.
      5. Per ciascun gruppo di controllo, utilizzare 30 μL di PBS come campione.
   2. Aggiungere 0,5 ml di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto, assicurandosi di sostituirlo ogni 3 giorni.
      1. Per il gruppo di controllo positivo, utilizzare un mezzo condrogeno hMSC disponibile in commercio contenente TGF-β1 aggiunto. Questo TGF-β1 aggiuntivo è uguale alla quantità in entrambi i gruppi TGF-β1 e J/T/M JBNm.
      2. Per uno dei gruppi di controllo negativi, utilizzare un mezzo condrogeno hMSC commerciale che non contenga TGF-β1. Per l'altro gruppo di controllo negativo, utilizzare un terreno di coltura cellulare DMEM contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS).
      3. Per ogni altro gruppo, utilizzare un terreno di coltura cellulare condrogena hMSC commerciale senza TGF-β1.
   3. Coltiva i campioni per 15 giorni.
   4. Estrarre l'RNA dei campioni ed eseguire la PCR per studiare la differenziazione dei campioni come descritto in precedenza²⁶.
5. Immunocolorazione per il saggio di espressione del collagene di tipo X
   1. Preparare sette campioni a base di agarosio nello stesso modo della differenziazione cellulare con la sezione del metodo PCR (fase 7.4).
   2. Coltiva i campioni per 15 giorni.
   3. Fissare i campioni con formaldeide al 4% per 1 giorno, immergere in una soluzione di saccarosio al 30% durante la notte e quindi congelare per una notte a -80 °C con azoto liquido. Fissare i campioni utilizzando il reagente composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), una miscela di glicoli e resine solubili in acqua, a -10 °C.
   4. Utilizzare un microtomo di criostato per ottenere sezioni congelate spesse 20 μm di ciascun campione.
   5. Colorare ogni sezione con un anticorpo Anti-Collagen X con diluizione 1:800 e un anticorpo secondario di etichettatura fluorescente diluito con PBS, secondo i protocolli del produttore.
   6. Osservare ogni sezione con un microscopio confocale, utilizzando un'eccitazione di 488 nm e un ingrandimento di 40x sull'oculare.

Risultati

Seguendo il protocollo, i JBNt sono stati sintetizzati con successo e caratterizzati con assorbimento UV-Vis e TEM. Il JBNm è un'impalcatura solida iniettabile che subisce un rapido processo biomimetico. Dopo che i JBNt sono stati aggiunti a una miscela di soluzione di TGF-β1/matrilina-3 in un ambiente fisiologico, si è formata un'impalcatura solida a maglia bianca che indica il successo dell'assemblaggio di JBNm, come si vede nella Figura 1. Ciò è stato dimostrato nei metodi di caratte...

Discussione

L'obiettivo di questo studio è sviluppare una piattaforma di scaffold biomimetico, il JBNm, per superare i limiti dei costrutti tissutali convenzionali che si basano su ambienti di coltura cellulare per mediare la differenziazione cellulare. Il JBNm è un'impalcatura a struttura strato per strato per un costrutto di tessuto cartilagineo autosufficiente. Il design innovativo si basa su nuovi nanomateriali ispirati al DNA, i JBNts. Il JBNm, composto da JBNts³⁰, TGF-β1 e matrilina-3, è assemblato ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.