JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה של פיגומי ננו-מטריצת בסיס יאנוס (JBNm) שכבה אחר שכבה על ידי הוספת ננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3 וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) ברצף. ה-JBNm היה מפוברק ומאופיין; בנוסף, הוא הפגין פעילות ביולוגית מצוינת, ועודד תפקודי תאים כגון הידבקות, שגשוג והתמיינות.

Abstract

פיגומים ביולוגיים שונים פותחו כדי להנחות הידבקות ושגשוג של תאים בתקווה לקדם פונקציות ספציפיות לשימושים במבחנה וב-in vivo . התוספת של גורמי גדילה לתוך פיגומים ביו-חומריים אלה נעשית בדרך כלל כדי לספק סביבת תרבית תאים אופטימלית, המתווכת את התמיינות התא ואת הפונקציות הבאות שלה. עם זאת, גורמי הגדילה בפיגום ביו-חומרי קונבנציונלי מתוכננים בדרך כלל להשתחרר עם ההשתלה, מה שעלול לגרום לתופעות לוואי לא מכוונות על הרקמות או התאים הסובבים אותם. כאן, ננו-מטריצת הבסיס של Janus בהשראת הדנ"א (JBNm) השיגה בהצלחה מיקרו-סביבה מקומית ביותר עם מבנה שכבה אחר שכבה לבניית רקמות סחוס בנות קיימא. JBNms מורכבים בעצמם מננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3, וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) באמצעות ביו-אפיניות. ה-JBNm הורכב ביחס TGF-β1:matrilin-3:JBNt של 1:4:10, שכן זה היה היחס שנקבע שבו הרכבה נכונה למבנה שכבה אחר שכבה יכולה להתרחש. ראשית, הפתרון TGF-β1 נוסף לפתרון matrilin-3. לאחר מכן, תערובת זו היתה pipetted מספר פעמים כדי להבטיח הומוגניות מספקת לפני תוספת של פתרון JBNt. זה יצר את JBNm שכבה אחר שכבה, לאחר פיפטינג מספר פעמים שוב. מגוון ניסויים נערכו כדי לאפיין את מבנה JBNm שכבה אחר שכבה, JBNts לבדו, מטרילין-3 לבדו ו-TGF-β1 לבדו. היווצרות JBNm נחקרה עם ספקטרום קליטת UV-Vis, ומבנה ה- JBNm נצפה במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM). כאשר פיגומי JBNm החדשניים שכבה אחר שכבה נוצרים בקנה מידה מולקולרי, ניתן היה לצפות ב- JBNm המסומן בצבע פלואורסצנטי. ה- TGF-β1 מוגבל בתוך השכבה הפנימית של ה- JBNm הניתן להזרקה, מה שיכול למנוע שחרור של גורמי גדילה לאזורים הסמוכים, לקדם כונדרוגנזה מקומית ולקדם מיקרו-סביבה אנטי-היפרטרופית.

Introduction

פיגומים בהנדסת רקמות ממלאים תפקיד חיוני במתן תמיכה מבנית לחיבור תאים ולהתפתחות רקמות לאחר מכן1. בדרך כלל, מבני רקמה קונבנציונליים ללא פיגומים מסתמכים על סביבת תרבית התאים ומוסיפים גורמי גדילה כדי לתווך התמיינות תאים. יתר על כן, תוספת זו של מולקולות ביו-אקטיביות לפיגומים היא לעתים קרובות הגישה המועדפת בהנחיית התמיינות תאים ותפקודם 2,3. פיגומים מסוימים יכולים לחקות את המיקרו-סביבה הביוכימית של רקמות מקומיות באופן עצמאי, בעוד שאחרים יכולים להשפיע ישירות על תפקודי התאים באמצעות גורמי גדילה. עם זאת, חוקרים נתקלים לעתים קרובות באתגרים בבחירת פיגומים שיכולים להשפיע לטובה על הידבקות התאים, גדילתם והתמיינותם, תוך מתן תמיכה מבנית ויציבות אופטימלית לאורך תקופה ארוכהשל 4,5. המולקולות הביו-אקטיביות קשורות לעתים קרובות באופן רופף לפיגום, מה שמוביל לשחרור מהיר של חלבונים אלה בעת ההשתלה, וכתוצאה מכך לשחרורן במקומות לא רצויים. זה מגיע לשיאו בתופעות לוואי על רקמות או תאים שלא הותקפו בכוונה 6,7.

פיגומים עשויים בדרך כלל מחומרים פולימריים. ננו-מטריצת בסיס יאנוס (JBNm) היא פלטפורמת פיגומים ביומימטיים שנוצרה בשיטה חדשנית שכבה אחר שכבה לבניית רקמת סחוסבת קיימא 8. ננו-צינוריות חדשניות אלה בהשראת דנ"א נקראו ננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מכיוון שהן מחקות כראוי את המבנה ואת הכימיה של פני השטח של קולגן המצוי במטריצה החוץ-תאית (ECM). עם תוספת של מולקולות ביו-אקטיביות, כגון מטרילין-3 וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1), ה-JBNm יכול ליצור מיקרו-סביבה אופטימלית שיכולה לעורר את תפקוד התאים והרקמות הרצויים9.

JBNts הם ננו-צינוריות חדשניות שמקורן בגרסאות סינתטיות של הנוקלאובסיס אדנין והתימין. ה- JBNts נוצרים באמצעות הרכבה עצמית10; שישה נוקלאו בסיסים סינתטיים נקשרים ליצירת טבעת, וטבעות אלה עוברות אינטראקציות ערימה π-π ליצירת ננו-צינורית באורך 200-300 מיקרומטרבאורך 11. ננו-צינוריות אלה דומות מבחינה מבנית לחלבוני קולגן; על ידי חיקוי היבט של מיקרו-סביבה של סחוס מקומי, הוכח כי JBNts מספקים אתר התקשרות חיובי עבור כונדרוציטים ותאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs)11,12,13,14. מכיוון שהננו-צינוריות עוברות הרכבה עצמית ואינן דורשות כל סוג של יוזם (כגון אור UV), הן מראות פוטנציאל מלהיב כפיגום הניתן להזרקה עבור אזורי פגם שקשה להגיע אליהם15.

מטרילין-3 הוא חלבון מטריצה חוץ-תאית מבנית המצוי בסחוס. חלבון זה ממלא תפקיד משמעותי בכונדרוגנזה ובתפקוד סחוס תקין16,17. לאחרונה, הוא נכלל בפיגומים ביו-חומריים, המעודדים כונדרוגנזה ללא היפרטרופיה 9,18,19. על ידי הכללת חלבון זה ב-JBNm, תאי הסחוס נמשכים לפיגום המכיל רכיבים דומים לאלה של המיקרו-סביבה המקורית שלו. בנוסף, הוכח כי מטרילין-3 נחוץ לאיתות תקין של TGF-β1 בתוך כונדרוציטים20. גורמי גדילה מתפקדים כמולקולות איתות, וגורמים לצמיחה ספציפית של תא או רקמה מסוימים. לכן, כדי להשיג התחדשות סחוס אופטימלית, matrilin-3 ו- TGF-β1 הם מרכיבים חיוניים בתוך JBNm. הוספת TGF-β1 לפיגום שכבה אחר שכבה יכולה לקדם עוד יותר את התחדשות הסחוס במבנה הרקמה. TGF-β1 הוא גורם גדילה המשמש לעידוד תהליך הריפוי של פגמים אוסטאוכונדרליים, המעודד התפשטות כונדרוציטים ו-hMSC והתמיינות21,22. לפיכך, TGF-β1 ממלא תפקיד מפתח בהתחדשות הסחוס JBNm (J/T/M JBNm)23, ומעודד צמיחה נכונה במיוחד כאשר הוא מקומי בתוך שכבות JBNm.

כאמור, גורמי גדילה מורכבים בדרך כלל על החלק החיצוני של פיגומים ללא שיטות התאגדות ספציפיות. כאן, עם הננו-ארכיטקטורה המתוכננת במדויק של הביו-חומרים, פותח ה-JBNm למיקוד ספציפי של תאים ורקמות מיועדים. ה-JBNm מורכב מ-TGF-β1 המודבק על משטחי JBNt בשכבה הפנימית ומטרילין-3 המודבק על משטחי JBNt בשכבה החיצונית24,25. השילוב של TGF-β1 בשכבה הפנימית של מבנה שכבה אחר שכבה מאפשר מיקרו-סביבה מקומית מאוד לאורך סיבי JBNm, ויוצר מבנה רקמה הומאוסטטי עם שחרור איטי בהרבה של החלבון12. יכולת ההזרקה של ה-JBNm הופכת אותו למבנה רקמת סחוס אידיאלי עבור יישומים ביו-חומריים עתידיים שונים26.

Protocol

1. סינתזה של JBNts

  1. הכן את מונומר JBNt תוך שימוש בשיטות שפורסמו בעבר, הכוללות סינתזה של מגוון תרכובות12.
  2. נקה מונומר JBNt גולמי לאחר שהוא מסונתז עם כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) באמצעות עמודה בפאזה הפוכה. השתמש בממס A: 100% מים, ממס B: 100% אצטוניטריל, וממס C: תמיסת מים HCl עם pH = 1. השתמש בקצב זרימה של 3 מ"ל/דקה. אסוף את הפסגה הגדולה ביותר שהושגה ב- HPLC ב- 7.2 דקות.

2. ייצור עבור JBNt/Matn1/TGF-β1 (וידאו 1)

הערה: סרטון 1 מראה כי JBNm הוא מוצק הניתן להזרקה שנוצר בסביבה פיזיולוגית (תמיסת מים, ללא אור UV, ללא תוספים כימיים וללא חימום), שגם הוא בהשראה ביולוגית.

  1. יש להוסיף 8 μL של 1 מ"ג/מ"ל TGF-β1 המושהה ב-H 2 O עד 32 μL של 1 מ"ג/מ"ל מטרילין-3 מושהה ב-H2O. Pipette כדי להבטיח ערבוב תקין של חלבונים אלה.
  2. הוסף 80 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts המרחפים ב-H2O לתמיסת TGF-β1/matrilin-3. פיפטה שוב ושוב כדי להבטיח מיזוג נכון. נוכחות של floccules לבן ניתן לראות מיד לאחר תוספת של JBNts, המציין את היווצרות של JBNm (וידאו 1).

3. תצפית על דגימות עם ספיגה אולטרה סגולה גלויה (UV-Vis)

הערה: ספקטרום ספיגת UV-Vis נחקר כדי לאפיין את ההרכבה של JBNm. מדידה זו נותחה לארבע קטגוריות: JBNts בלבד, מטרילין-3 לבדו, TGF-β1 לבדו, ו- JBNm המלא שכבה אחר שכבה, המורכב מכל שלושת החלקים. כל הריכוזים ההתחלתיים מושעים ב-H2O.

  1. עבור קבוצת JBNt, הוסף 5 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts ל-50 μL של H2O כדי ליצור תמיסה של 90.9 מיקרוגרם/מ"ל.
  2. עבור קבוצת המטרילין-3, הוסף 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 15 μL של H2O כדי ליצור תמיסה של 7.3 מיקרוגרם/מ"ל.
  3. עבור קבוצת TGF-β1, הוסף 10 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ל-45 μL של H2O כדי ליצור תמיסה של 1.8 מיקרוגרם/מ"ל.
  4. עבור קבוצת JBNm, הוסף 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 10 μL של 10 מיקרוגרם/mL TGF-Β1. תסיסה כדי להבטיח ערבוב נכון, ולאחר מכן להוסיף 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNts לתמיסה, pipetting שוב ושוב לערבב את הדגימה.
  5. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדוד את ספקטרום הקליטה של כל קבוצה.

4. מדידת פוטנציאל זטה של דגימות

הערה: פוטנציאל הזטה נותח כדי לחזות טוב יותר כיצד JBNm יתקשר עם רקמת in vivo . נמדדו שלוש קבוצות: מטרילין-3 בלבד, מטרלין-3 עם TGF-β1, ו-JBNm מלא שכבה אחר שכבה.

  1. עבור קבוצת המטרילין-3, יש להוסיף 160 μL של 10 מ"ג/מ"ל מטרילין-3 עד 640 μL של H2O כדי ליצור תמיסה של 800 μL.
  2. עבור תרכובת המטרילין-3/TGF-β1, הוסף 160 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1. פיפטה שוב ושוב כדי להבטיח הומוגניות נכונה. לאחר מכן, הוסף אותו ל- 600 μL של H2O וכתוצאה מכך תמיסת 800 μL.
  3. עבור קבוצת JBNm, הוסף 160 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1. פיפטה מספר פעמים כדי לערבב את החלבונים. לאחר מכן, הוסיפו 20 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts לתמיסה ופיפטה כדי להבטיח הומוגניות. לבסוף, הוסף את פתרון JBNm ל- 580 μL של H2O כדי לייצר תמיסה של 800 μL.
  4. מדוד את ערכי פוטנציאל הזטה עבור שלוש הקבוצות.

5. הכנת ננו-מטריצת JBNt/מטרילין-3 למיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM)

הערה: אפיון TEM מתבצע כדי לאפיין את המורפולוגיה של JBNts ו- JBNm.

  1. הכנס שתי רשתות למנקה פלזמה כדי לנקות כראוי את הרשתות לפני הכתם השלילי של JBNts ו- JBNm על פי הפרוטוקולים שפורסמו ופרוטוקולי היצרן12.
  2. צור תמיסת JBNt של 200 מיקרוגרם/מ"ל על-ידי ערבוב של 10 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts עם 40 μL של מים מזוקקים.
  3. יש לערבב 30 μL של 100 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עם 20 μL של 100 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ופיפטה מספר פעמים. הוסיפו 10 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts לתערובת המטרילין-3/TGF-β1 כדי להכין את דגימת JBNm. שוב, פיפטה שוב ושוב.
  4. הוסף 3 μL של תמיסת JBNt (200 מיקרוגרם / מ"ל) ו -3 μL של פתרון JBNm על רשתות נפרדות, והשאר אותם למשך 2 דקות.
  5. יש לשטוף כל רשת עם 100 μL של תמיסת אורניל אצטט (0.5%). השתמשו בניירות סינון כדי להסיר את התמיסה העודפת ולאפשר לרשתות להתייבש באוויר.
  6. להפעיל מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כדי לצפות כראוי ולאפיין את הדגימות, כפי שפורסם קודםלכן 11,12.

6. מדידת ספקטרום ספיגה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית

הערה: המבנה של JBNm מאומת על ידי התבוננות במבנים של JBNm עם אנליזה ספקטרלית של בליעה.

  1. תייג את ה- TGF-β1 באמצעות ערכת תיוג חלבונים בהתאם להוראות היצרן. הוסף 20 μL של 20 מיקרוגרם / מ"ל עם התווית TGF-β1 עד 25 μL של H2O כדי ליצור פתרון בדיקה של 8.9 מיקרוגרם / מ"ל.
  2. תייג את המטרילין-3 באמצעות ערכת תיוג נפרדת. הוסף 20 μL של 80 מיקרוגרם / מ"ל עם התווית מטרילין-3 עד 25 μL של H2O כדי ליצור פתרון בדיקה של 36 מיקרוגרם / מ"ל.
    הערה: תיוג הצבע הפלואורסצנטי של TGF-β1 הביא לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל, בעוד שהתיוג של המטרילין-3 הביא לריכוז סופי של 80 מיקרוגרם/מ"ל.
  3. יש לערבב 20 μL של 80 מיקרוגרם/מ"ל עם תווית מטרילין-3 עם 20 μL של 20 מיקרוגרם/מ"ל עם תווית TGF-β1 ו-5 μL של H2O, והתוצאה היא תרכובת TGF-β1/matrilin-3 המסומנת. פיפטה את התערובת מספר פעמים כדי לערבב.
  4. הוסף 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNts ל 40 μL של H2O, וכתוצאה מכך פתרון 111 מיקרוגרם / מ"ל.
  5. הוסף 20 μL של 20 מיקרוגרם / מ"ל שכותרתו TGF-β1 עד 20 μL של 80 מיקרוגרם / מ"ל המסומנים מטרילין-3 ופיפטה מספר פעמים. הוסיפו 5 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts לתמיסת TGF-β1/ matrilin-3 המסומנת, ופיפט שוב ושוב כדי לערבב כראוי את התרכובת.
    הערה: הריכוזים הסופיים של JBNt, שכותרתו TGF-β1, ודגימות מטרילין-3 שסומנו היו 111 מיקרוגרם/מ"ל, 8.9 מיקרוגרם/מ"ל ו-36 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה.
  6. העבר כל קבוצת דגימה (כלומר, מסומנת כ- TGF-β1 (שלב 6.1), מסומנת כמטרילין-3 (שלב 6.2), מסומנת כ- TGF-β1/matrilin-3 (שלב 6.3), JBNts (שלב 6.4), JBNm (שלב 6.5)) לבאר משלה של צלחת שחורה של 384 בארות.
  7. טען את הלוח השחור בעל 384 הבארות לתוך קורא מיקרו-לוחות רב-מצבי ובצע מדידות באורכי גל עירור של 488 ננומטר ו-555 ננומטר בהתאם לפרוטוקול היצרן.

7. בדיקת פונקציה ביולוגית במבחנה

  1. בדיקת הידבקות תאים על תאי כיסוי מצופים מראש
    1. הכינו שני משקפי כיסוי עם חמש קבוצות של דגימות, שכן כיסוי אחד משמש לכל סוג תא.
    2. הוסף 1.25 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts ל-198.75 μL של מים מזוקקים, והתוצאה היא תמיסה של 6.25 מיקרוגרם/מ"ל.
    3. הוסף 10 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל מטרילין-3 עד 190 μL של מים מזוקקים, וכתוצאה מכך 0.5 מיקרוגרם / mLsolution.
    4. הוסף 2.5 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל TGF-β1 ל 197.5 מיקרוגרם / מ"ל מים מזוקקים, וכתוצאה מכך 0.125 מיקרוגרם / mLsolution.
    5. עבור קבוצת JBNm, הוסף 10 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 2.5 μL של 10 מיקרוגרם/mLTGF-β1 ופיפטה שוב ושוב. הוסף 1.25 μL של JBNts עם ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל את תמיסת התערובת ואת פיפטה. לבסוף, הוסף 186.25 μL של מים מזוקקים כדי לגרום לתמיסת JBNm של 200 μL.
      1. עבור קבוצת הביקורת, יש להשתמש ב-200 μL של מים מזוקקים.
    6. הוסף כל קבוצת דגימה לתוך באר משלהם של כיסוי מס '1.5 קאמרית. הכניסו את הכיסוי למקפיא של -80°C למשך שעה אחת, ולאחר מכן הקפיא-יבש אותו בעזרת מכשיר ליופילייזר.
    7. זרעו תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs) ותאי כונדרוציטים אנושיים (10,000 תאים לבאר) לתוך כל באר של משקפי כיסוי חדריים מוכנים.
    8. הדגירה של שני משקפי הכיסוי במשך 4 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו פעמיים עם PBS.
    9. לתקן תאים עם 4% paraformaldehyde במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולשטוף דגימות עם PBS. שטפו את הדגימה פעם נוספת כדי להסיר לחלוטין את הפרפורמלדהיד של 4%.
    10. לדגום תאים עם 100 μL של 0.1% Triton-X במשך 10 דקות ולשטוף עם PBS. יש להוסיף 100 μL של 0.165 μM רודמין-פלואידין לכל באר. המתן 30 דקות ולאחר מכן לשטוף עם PBS שוב.
    11. הוסיפו 0.1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI לכל באר כדי להכתים את הגרעינים. המתן 5 דקות ושטוף את הבארות עם PBS פעמיים.
    12. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי ספקטרלי כדי לצפות במורפולוגיה של התא וללכוד תמונות פלואורסצנטיות.
    13. יתר על כן, לנתח את מספר התא ואת המורפולוגיה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. פתח את התוכנה וטען את התמונות. הוסף סרגל קנה מידה וכייל את התוכנה. ספירת מספר התאים באזור נתון עבור כל דגימה. לאחר מכן, השתמש בכלי המדידה כדי לאסוף נתונים על מורפולוגיה של תאים עבור כל דגימה.
  2. התפשטות תאים
    1. הכינו שלוש צלחות 96 בארות שלא טופלו, והוסיפו חמש קבוצות של דגימות לכל אחת מהן.
      1. עבור קבוצת JBNt, יש להוסיף 3.75 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts ל-596.25 μL של מים מזוקקים, והתוצאה היא תמיסת JBNt של 600 μL עם ריכוז של 6.25 מיקרוגרם/מ"ל.
      2. עבור קבוצת TGF-β1, הוסף 7.5 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ל-592.5 μL של מים מזוקקים, והתוצאה היא תמיסת בדיקה של 0.125 מיקרוגרם/מ"ל.
      3. עבור קבוצת המטרילין-3, יש להוסיף 30 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 570 μL של מים מזוקקים, והתוצאה היא תמיסת בדיקה של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל.
      4. עבור קבוצת JBNm, ערבבו 7.5 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 עם 30 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 ופיפטה מספר פעמים, ולאחר מכן הוסיפו 3.75 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts לתמיסה.
      5. דלל תמיסת JBNm עם 558.75 μL של מים מזוקקים כדי להשיג את הריכוזים הסופיים של 6.25 מיקרוגרם/מ"ל, 0.125 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה, עבור דגימות JBNt, TGF-β1 ומטרילין-3.
      6. עבור קבוצת הביקורת, יש להשתמש ב-600 μL של מים מזוקקים.
    2. חלק כל קבוצת דגימה לשש בארות (דגימת 100 μL לכל באר).
    3. מניחים את שלוש הצלחות המכילות את כל הדגימות לתוך מקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ולאחר מכן מייבשים בהקפאה עם מכשיר ליופיליזציה.
    4. זרעו hMSCs על הצלחות האלה, שכל אחד מהם מקבל תרחיף תאים של 100 μL (לכל באר) המכיל 5,000 תאים. דגירה של שלוש הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד, 3 ימים או 5 ימים ב-5% CO2.
    5. הוסיפו 10 μL של תמיסת CCK-8 לכל באר עם התאים ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות.
    6. מדוד את ערכי הספיגה של כל באר עם קוראי מיקרו-פלטות מרובי מצבים במהירות של 450 ננומטר.
    7. זרעו שיפוע ידוע של hMSCs על צלחת של 96 בארות ודגרו במשך 4 שעות. השתמש במבחן CCK-8 כדי למדוד את ערכי הקליטה של מספר התאים הידוע וליצור עקומה סטנדרטית.
    8. חשב את התפשטות התאים באמצעות עקומת הספיגה הסטנדרטית.
  3. בדיקת יציבות
    הערה: ערכת ELISA ממוקדת TGF-β1 אנושית שימשה לקביעת אחוז השחרור של TGF-β1 מה- JBNm בהידרוג'ל אגרוז.
    1. הכינו 2% אגרוז על ידי הוספת 400 מ"ג אבקת אגרוז ל-20 מ"ל של PBS וחימום שלה עד 100 מעלות צלזיוס כדי להמיס לחלוטין את אבקת האגרוז.
    2. מכינים את ה-JBNm בתוך הידרוג'ל אגרוז מקורר 2%.
      1. שלב 10 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1, 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3, 5 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts, ו-195 μL של PBS. מערבבים תמיסה זו עם 250 μL של 2% agarose, יצירת הידרוג'ל JBNm.
    3. הוסף 500 μL של PBS, תוך שימוש בו כפתרון שחרור, והבטח לשנות אותו כל 3 ימים. שמור כל פתרון ששוחרר, ותן לדגימה לשבת במשך 15 יום.
    4. השתמש בערכת ELISA כדי לבדוק כל אחד מפתרונות השחרור שנתפסו, על ידי ביצוע הוראות היצרן.
      הערה: על-ידי הפחתת כמות ה- TGF-β1 המשתחררת ב- PBS מערך הטעינה התיאורטי של 100%, ניתן לקבוע את הכמות הנותרת של TGF-β1.
  4. ניתוח התמיינות תאים עם PCR26.
    1. הכן שבע קבוצות של דגימות כאשר כל דגימה מכילה 20 μL של תרחיף תאים (4 x 104 תאים ), 30 μL של התמיסה הספציפית (או PBS, בהתאם לקבוצת הדגימה), ו 50 μL של 2 wt % agarose.
      1. עבור קבוצת TGF-β1, הוסף 5 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ל-25 μL של PBS, והתוצאה היא תמיסה של 1.6 מיקרוגרם/מ"ל.
      2. עבור קבוצת המטרילין-3, הוסף 20 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 10 μL של PBS, והתוצאה היא תמיסה של 6.7 מיקרוגרם/מ"ל.
      3. עבור קבוצת JBNt, הוסף 2.5 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts ל-27.5 μL של PBS, והתוצאה היא תמיסת 83.3 מיקרוגרם/מ"ל.
      4. עבור קבוצת J/T/M JBNm, הוסף 10 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 5 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה. לאחר מכן, להוסיף 2.5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNts פיפטה שוב. לבסוף, לדלל עם 2.5 μL של PBS.
      5. עבור כל קבוצת ביקורת, השתמש ב- 30 μL של PBS כמדגם.
    2. הוסף 0.5 מ"ל של מדיום תרבית תאים לכל באר, תוך הקפדה להחליף אותו כל 3 ימים.
      1. עבור קבוצת הביקורת החיובית, השתמש במדיום כונדרוגני hMSC זמין מסחרית המכיל תוספת TGF-β1. תוספת זו של TGF-β1 שווה לכמות בשתי הקבוצות TGF-β1 ו-J/T/M JBNm.
      2. עבור אחת מקבוצות הביקורת השליליות, השתמש במדיום כונדרוגני hMSC מסחרי שאינו מכיל TGF-β1. עבור קבוצת הביקורת השלילית האחרת, השתמשו בתרבית תאי DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS).
      3. עבור כל קבוצה אחרת, השתמש בתרבית תאים כונדרוגנית hMSC מסחרית ללא TGF-β1.
    3. תרכזו את הדגימות במשך 15 יום.
    4. חלץ את הרנ"א של הדגימות ובצע PCR כדי לחקור את ההתמיינות של הדגימות כפי שתואר קודםלכן 26.
  5. בדיקה חיסונית לבדיקת ביטוי קולגן מסוג X
    1. הכן שבע דגימות מבוססות אגרוז באותו אופן כמו התמיינות התאים עם סעיף שיטת PCR (שלב 7.4).
    2. תרכזו את הדגימות במשך 15 יום.
    3. לתקן את הדגימות עם 4% פורמלדהיד במשך יום אחד, להשרות 30% סוכרוז תמיסת לילה, ולאחר מכן להקפיא לילה ב -80 מעלות צלזיוס עם חנקן נוזלי. תקן את הדגימות באמצעות ריאגנט תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT), תערובת של גליקולים מסיסים במים ושרפים, בטמפרטורה של -10 מעלות צלזיוס.
    4. הפעל מיקרוטום cryostat כדי לקבל חלקים קפואים בעובי 20 מיקרומטר של כל דגימה.
    5. יש להכתים כל מקטע בנוגדן אנטי-קולגן X עם דילול של 1:800 ונוגדן משני לתיוג פלואורסצנטי המדולל ב-PBS, על פי פרוטוקולי היצרן.
    6. התבונן בכל קטע עם מיקרוסקופ קונפוקלי, באמצעות עירור של 488 ננומטר והגדלה של 40x על העינית.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, JBNts סונתזו בהצלחה ואופיינו בספיגת UV-Vis ו- TEM. ה- JBNm הוא פיגום מוצק הניתן להזרקה העובר תהליך ביומימטי מהיר. לאחר ש-JBNts נוספו לתערובת של תמיסת TGF-β1/matrilin-3 בסביבה פיזיולוגית, נוצר פיגום רשת לבן מוצק המעיד על הרכבה מוצלחת של JBNm, כפי שניתן לראות באיור 1. הדבר הודגם בש?...

Discussion

מטרת מחקר זה היא לפתח פלטפורמת פיגומים ביומימטיים, JBNm, כדי להתגבר על המגבלות של מבני רקמה קונבנציונליים המסתמכים על סביבות תרביות תאים כדי לתווך התמיינות תאים. ה- JBNm הוא פיגום מבנה שכבה אחר שכבה לבניית רקמת סחוס בת קיימא. העיצוב החדשני מבוסס על ננו-חומרים חדשניים בהשראת דנ"א, ה-JBNts. ה-JBNm, המור...

Disclosures

ד"ר יופנג צ'ן הוא מייסד שותף של Eascra Biotech, Inc. ו- NanoDe Therapeutics, Inc. .

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH 7R01AR072027 ו- 7R03AR069383, פרס הקריירה של NSF 1905785, NSF 2025362 ואוניברסיטת קונטיקט. עבודה זו נתמכת בחלקה גם על ידי מענק NIH S10OD016435.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 % Normal Goat SerumThermo Fisher50062ZAgent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plateCorning07-200-74024-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated PlateThermo Fisher262260384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglassThermo Fisher155409PK8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottomCorning07-200-9196-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treatedThermo Fisher26089596-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose GelSigma-AldrichA9539Hydrogel used for cell culture.
Agarose GelSigma AldrichA9539Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling KitThermo FisherA30006 (488) and A30007 (555)Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X AntibodyThermo Fisher41-9771-82Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR MachineBio-RadEquipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell LineCells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8Milipore Sigma96992Cell proliferation assay.
Cell ProfilerBroad InstituteSoftware used to analyze cell images.
Cryostat MicrotomeEquipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPIInvitrogenD1306Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettesFISHER Scientific14-955-128Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture MediumThermo Fisher10566032Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine SerumGIBCOA4766801Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting MediumThermo Fisher00-4958-02Solution used to mount slides for immunostaining.
FormaldehydeCompound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary AntibodyThermo FisherA16110Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem CellsLONZAPT-2501Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic MediumLONZAPT-3003Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJNational Institutes of HealthImage analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step KitBioRad1725150Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic MicroscopeTecnaiEquipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLABMathWorksStatistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop SpectrophotometerThermo FisherEquipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal MicroscopeNikonA1R HD25Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber CoverglassThermo Fisher152250Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound ReagentCompound used to embed cells prior to microtoming.
ParaformaldehydeThermo ScientificAAJ19943K2Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma CleanerHarrick PlasmaCleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycinGIBCO15-140-148Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher10010023Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidinInvitrogenR415F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini KitQIAGEN74904Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose SolutionSolution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA KitInvitrogenBMS249-4Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1PEPROTECH100-21CGrowth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-XInvitrogenHFH10Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol ReagentThermo Fisher15596026Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalEquipment used to measure zeta-potential values of a sample.

References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved