Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nanomatrix-Gerüsts (JBNm) durch nacheinander Hinzufügen von Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts), Matrilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1). Der JBNm wurde hergestellt und charakterisiert; Darüber hinaus zeigte es eine ausgezeichnete Bioaktivität, die Zellfunktionen wie Adhäsion, Proliferation und Differenzierung fördert.

Zusammenfassung

Verschiedene Biomaterial-Scaffolds wurden entwickelt, um die Zelladhäsion und -proliferation zu steuern, in der Hoffnung, spezifische Funktionen für In-vitro - und In-vivo-Anwendungen zu fördern. Die Zugabe von Wachstumsfaktoren in diese Biomaterialgerüste erfolgt im Allgemeinen, um eine optimale Zellkulturumgebung zu schaffen, die die Zelldifferenzierung und ihre nachfolgenden Funktionen vermittelt. Die Wachstumsfaktoren in einem herkömmlichen Biomaterialgerüst sind jedoch typischerweise so konzipiert, dass sie bei der Implantation freigesetzt werden, was zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen auf das umgebende Gewebe oder die Zellen führen kann. Hier ist es der DNA-inspirierten Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) gelungen, eine hochlokalisierte Mikroumgebung mit einer Schicht-für-Schicht-Struktur für selbsttragende Knorpelgewebekonstrukte zu erreichen. JBNms sind selbstorganisierend aus Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts), Matrilin-3 und dem transformierenden Wachstumsfaktor beta-1 (TGF-β1) über Bioaffinität. Der JBNm wurde in einem TGF-β1:matrilin-3:JBNt-Verhältnis von 1:4:10 zusammengebaut, da dies das bestimmte Verhältnis war, bei dem eine ordnungsgemäße Montage in die Schicht-für-Schicht-Struktur erfolgen konnte. Zunächst wurde die TGF-β1-Lösung zur Matrilin-3-Lösung gegeben. Dann wurde diese Mischung mehrmals pipettiert, um eine ausreichende Homogenität vor der Zugabe der JBNt-Lösung zu gewährleisten. Dieser bildete Schicht für Schicht JBNm, nachdem er erneut mehrfach pipettiert hatte. Eine Vielzahl von Experimenten wurde durchgeführt, um die Schicht-für-Schicht-JBNm-Struktur, JBNts allein, Matilin-3 allein und TGF-β1 allein zu charakterisieren. Die Bildung von JBNm wurde mit UV-Vis-Absorptionsspektren untersucht, und die Struktur des JBNm wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet. Da das innovative schichtweise JBNm-Gerüst auf molekularer Ebene gebildet wird, konnte der fluoreszierende Farbstoff JBNm beobachtet werden. Das TGF-β1 ist in der inneren Schicht des injizierbaren JBNm eingeschlossen, was die Freisetzung von Wachstumsfaktoren in die Umgebung verhindern, die lokalisierte Chondrogenese fördern und eine antihypertrophe Mikroumgebung fördern kann.

Einleitung

Gerüste im Tissue Engineering spielen eine wichtige Rolle bei der strukturellen Unterstützung der Zellanheftung und der anschließenden Gewebeentwicklung¹. Typischerweise verlassen sich konventionelle Gewebekonstrukte ohne Gerüst auf die Zellkulturumgebung und zusätzliche Wachstumsfaktoren, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Darüber hinaus ist diese Zugabe von bioaktiven Molekülen in Gerüste oft der bevorzugte Ansatz zur Steuerung der Zelldifferenzierung und -funktion ^2,3. Einige Gerüste können die biochemische Mikroumgebung nativer Gewebe unabhängig voneinander nachahmen, während andere die Zellfunktionen über Wachstumsfaktoren direkt beeinflussen können. Forscher stoßen jedoch häufig auf Herausforderungen bei der Auswahl von Gerüsten, die die Zelladhäsion, das Wachstum und die Differenzierung positiv beeinflussen und gleichzeitig eine optimale strukturelle Unterstützung und Stabilität über einen langen Zeitraum bieten^{könnten 4,5}. Die bioaktiven Moleküle sind oft lose an das Gerüst gebunden, was zu einer schnellen Freisetzung dieser Proteine bei der Implantation führt, was zu ihrer Freisetzung an unerwünschten Stellen führt. Dies gipfelt in Nebenwirkungen auf Gewebe oder Zellen, die nicht absichtlich gezielt angegriffen wurden ^6,7.

Gerüste bestehen typischerweise aus polymeren Materialien. Die Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) ist eine biomimetische Gerüstplattform, die mit einer neuartigen Schicht-für-Schicht-Methode für selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt⁸ erstellt wurde. Diese neuartigen DNA-inspirierten Nanoröhren wurden Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts) genannt, da sie die Struktur und Oberflächenchemie von Kollagen in der extrazellulären Matrix (ECM) richtig nachahmen. Durch die Zugabe von bioaktiven Molekülen wie Matilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) kann das JBNm eine optimale Mikroumgebung schaffen, die dann die gewünschte Zell- und Gewebefunktionalität stimulieren kann⁹.

JBNts sind neuartige Nanoröhrchen, die aus synthetischen Versionen der Nukleobase Adenin und Thymin gewonnen werden. Die JBNts werden durch Selbstorganisation¹⁰ gebildet; Sechs synthetische Nukleobasen verbinden sich zu einem Ring, und diese Ringe unterliegen π-π-Stapelwechselwirkungen, um eine Nanoröhre von 200-300 μm Länge¹¹ zu erzeugen. Diese Nanoröhrchen ähneln strukturell Kollagenproteinen; Durch die Nachahmung eines Aspekts der nativen Knorpelmikroumgebung wurde gezeigt, dass JBNts eine günstige Bindungsstelle für Chondrozyten und humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) bieten11,12,13,14. Da die Nanoröhrchen einer Selbstorganisation unterzogen werden und keinerlei Initiator (wie UV-Licht) benötigen, zeigen sie ein aufregendes Potenzial als injizierbares Gerüst für schwer zugängliche Defektbereiche¹⁵.

Matrilin-3 ist ein strukturelles extrazelluläres Matrixprotein, das im Knorpel vorkommt. Dieses Protein spielt eine bedeutende Rolle bei der Chondrogenese und der richtigen Knorpelfunktion^16,17. Vor kurzem wurde es in Biomaterialgerüste aufgenommen, was die Chondrogenese ohne Hypertrophie fördert 9,18,19. Durch die Aufnahme dieses Proteins in das JBNm werden Knorpelzellen von einem Gerüst angezogen, das ähnliche Komponenten wie seine native Mikroumgebung enthält. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Matrilin-3 für die korrekte TGF-β1-Signalisierung innerhalb der Chondrozyten^{benötigt wird 20}. Wachstumsfaktoren fungieren als Signalmoleküle und verursachen spezifisches Wachstum einer bestimmten Zelle oder eines bestimmten Gewebes. Um eine optimale Knorpelregeneration zu erreichen, sind Matrilin-3 und TGF-β1 wesentliche Bestandteile innerhalb des JBNm. Die Zugabe von TGF-β1 in das schichtweise Gerüst kann die Knorpelregeneration in einem Gewebekonstrukt weiter fördern. TGF-β1 ist ein Wachstumsfaktor, der eingesetzt wird, um den Heilungsprozess von osteochondralen Defekten zu fördern und die Proliferation und Differenzierung von Chondrozyten und hMSC zu fördern^21,22. Somit spielt TGF-β1 eine Schlüsselrolle bei der Knorpelregeneration JBNm (J/T/M JBNm)²³ und fördert das richtige Wachstum, insbesondere wenn es innerhalb der JBNm-Schichten lokalisiert ist.

Wie bereits erwähnt, werden Wachstumsfaktoren typischerweise auf der Außenseite von Gerüsten ohne spezifische Einbaumethoden montiert. Hier wurde mit der präzise gestalteten Nanoarchitektur der Biomaterialien das JBNm für das spezifische Targeting von beabsichtigten Zellen und Geweben entwickelt. Das JBNm besteht aus TGF-β1, das auf JBNt-Oberflächen in der inneren Schicht und Matrilin-3 auf JBNt-Oberflächen in der äußeren Schicht^24,25 haftet. Der Einbau von TGF-β1 in die innere Schicht der Schicht-für-Schicht-Struktur ermöglicht eine stark lokalisierte Mikroumgebung entlang der JBNm-Fasern, wodurch ein homöostatisches Gewebekonstrukt mit einer viel langsameren Freisetzung des Proteins¹² entsteht. Die Injektionsfähigkeit des JBNm macht es zu einem idealen Knorpelgewebekonstrukt für verschiedene zukünftige Biomaterialanwendungen²⁶.

Protokoll

1. Synthese von JBNts

1. Herstellung des JBNt-Monomers unter Verwendung zuvor veröffentlichter Methoden, die die Synthese einer Vielzahl von Verbindungen^{beinhalten 12}.
2. Reinigen Sie das rohe JBNt-Monomer, nachdem es mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasensäule synthetisiert wurde. Verwenden Sie Lösungsmittel A: 100% Wasser, Lösungsmittel B: 100% Acetonitril und Lösungsmittel C: HCl-Wasserlösung mit pH = 1. Verwenden Sie eine Durchflussrate von 3 ml/min. Sammeln Sie den größten in der HPLC erhaltenen Peak nach 7,2 min.

2. Fertigung für JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

HINWEIS: Video 1 zeigt, dass der JBNm ein injizierbarer Feststoff ist, der in einer physiologischen Umgebung (Wasserlösung, kein UV-Licht, keine chemischen Zusätze und keine Erwärmung) gebildet wird und auch biologisch inspiriert ist.

1. 8 μL 1 mg/ml TGF-β1 suspendiert in H2O auf₃₂μL 1 mg/ml Matrilin-3 suspendiert in_H2O. Pipette zugeben, um eine ordnungsgemäße Mischung dieser Proteine zu gewährleisten.
2. 80 μL 1 mg/ml JBNts suspendiert in_H2Ozur TGF-β1/Matrilin-3-Lösung zugeben. Pipetten Sie wiederholt, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Das Vorhandensein von weißen Flocken kann unmittelbar nach der Zugabe von JBNts beobachtet werden, was auf die Bildung des JBNm hinweist (Video 1).

3. Beobachtung von Proben mit UV-sichtbarer (UV-Vis) Absorption

HINWEIS: Die UV-Vis-Absorptionsspektren wurden untersucht, um die Assemblierung des JBNm zu charakterisieren. Diese Messung wurde für vier Kategorien analysiert: JBNts allein, Matrilin-3 allein, TGF-β1 allein und das gesamte Schicht-für-Schicht-JBNm, bestehend aus allen drei Teilen. Alle Anfangskonzentrationen sind in_H2Osuspendiert.

1. Für die JBNt-Gruppe werden 5 μL 1 mg/ml JBNts zu 50 μL_H2Ohinzugefügt, um eine 90,9 μg/ml Lösung herzustellen.
2. Für die Matrilin-3-Gruppe werden 40 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 15 μL_H2Ogegeben, um eine 7,3 μg/ml Lösung zu erhalten.
3. Für die TGF-β1-Gruppe werden 10 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 45 μL_H2Ogegeben, um eine 1,8 μg/ml Lösung herzustellen.
4. Für die JBNm-Gruppe addieren Sie 40 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 10 μL 10 μg/mL ^TGF-β1. Rühren, um eine ordnungsgemäße Mischung sicherzustellen, und dann 5 μL 1 mg / ml JBNts zur Lösung hinzufügen und wiederholt pipettieren, um die Probe zu mischen.
5. Messen Sie mit einem Spektralphotometer das Absorptionsspektrum jeder Gruppe.

4. Zetapotentialmessung von Proben

HINWEIS: Das Zeta-Potential wurde analysiert, um besser vorhersagen zu können, wie der JBNm mit in vivo Gewebe interagieren würde. Drei Gruppen wurden gemessen: Matrilin-3 allein, Matilin-3 mit TGF-β1 und das gesamte Schicht-für-Schicht-JBNm.

1. Für die Matrilin-3-Gruppe werden 160 μL 10 mg/ml Matrilin-3 zu 640 μL_H2Ogegeben, um eine 800 μL Lösung herzustellen.
2. Für die Matrilin-3/TGF-β1-Verbindung werden 160 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 40 μL 10 μg/ml TGF-β1 hinzugefügt. Pipetten Sie wiederholt, um die richtige Homogenität zu gewährleisten. Dann fügen Sie es zu 600 μL_H2Ohinzu, was zu einer 800 μL Lösung führt.
3. Für die JBNm-Gruppe fügen Sie 160 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 40 μL 10 μg/ml TGF-β1 hinzu. Pipette mehrmals, um die Proteine zu mischen. Dann 20 μL 1 mg/ml JBNts in die Lösung geben und pipetten, um die Homogenität zu gewährleisten. Schließlich wird die JBNm-Lösung zu 580 μL_H2Ogegeben, um eine 800 μL-Lösung zu erhalten.
4. Messen Sie die Zeta-Potentialwerte für die drei Gruppen.

5. Herstellung von JBNt/matrilin-3 Nanomatrix für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

HINWEIS: Die TEM-Charakterisierung wird durchgeführt, um die Morphologie von JBNts und JBNm zu charakterisieren.

1. Führen Sie zwei Gitter in einen Plasmareiniger ein, um die Gitter vor der negativen Färbung der JBNts und JBNm gemäß den veröffentlichten Protokollen und den Protokollen des Herstellers¹² ordnungsgemäß zu reinigen.
2. Man kann eine 200 μg/ml JBNt-Lösung herstellen, indem man 10 μL 1 mg/ml JBNts mit 40 μL destilliertem Wasser mischt.
3. Mischen Sie 30 μL 100 μg/ml Matrilin-3 mit 20 μL 100 μg/ml TGF-β1 und pipetten Sie mehrmals. Zur Herstellung der JBNm-Probe werden 10 μL 1 mg/ml JBNts in das Matilin-3/TGF-β1-Gemisch gegeben. Wieder wiederholt pipetten.
4. 3 μL der JBNt-Lösung (200 μg/ml) und 3 μL der JBNm-Lösung auf getrennten Gittern zugeben und 2 min stehen lassen.
5. Spülen Sie jedes Gitter mit 100 μL Uranylacetatlösung (0,5%). Verwenden Sie Filterpapiere, um die überschüssige Lösung zu entfernen und die Gitter an der Luft trocknen zu lassen.
6. Bedienen Sie ein Transmissionselektronenmikroskop, um die Proben richtig zu beobachten und zu charakterisieren, wie zuvor^{veröffentlicht 11,12}.

6. Messung von Absorptionsspektren fluoreszenzmarkierter Proteine

HINWEIS: Die Struktur von JBNm wird durch Beobachtung der Strukturen des JBNm mit Absorptionsspektralanalyse verifiziert.

1. Beschriften Sie den TGF-β1 mit einem Proteinmarkierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. 20 μL 20 μg/ml markiertes TGF-β1 zu 25 μL_H2Ogeben, um eine 8,9 μg/ml Testlösung herzustellen.
2. Beschriften Sie den Matrilin-3 mit einem separaten Beschriftungskätzchen. Man fügt 20 μL 80 μg/ml markiertes Matrilin-3 zu 25 μL_H2Ohinzu, um eine 36 μg/ml Testlösung herzustellen.
   HINWEIS: Die fluoreszierende Farbstoffmarkierung des TGF-β1 ergab eine Endkonzentration von 20 μg/ml, während die Markierung des Matrilin-3 zu einer Endkonzentration von 80 μg/ml führte.
3. Mischen Sie 20 μL 80 μg/ml markiertes Matrilin-3 mit 20 μL von 20 μg/ml markiertem TGF-β1 und 5 μL_H2O, was zu einer markierten TGF-β1/Matrilin-3-Verbindung führt. Pipetten Sie die Mischung mehrmals, um sie zu mischen.
4. Man gibt 5 μL 1 mg/ml JBNts zu 40 μL_H2O, was zu einer 111 μg/ml Lösung führt.
5. 20 μL 20 μg/mL markiertes TGF-β1 auf 20 μL 80 μg/ml markiertes Matrilin-3 geben und mehrmals pipettieren. Fügen Sie 5 μL 1 mg/ml JBNts zu der markierten TGF-β1/Matrilin-3-Lösung hinzu und pipetten Sie wiederholt, um die Verbindung richtig zu mischen.
   HINWEIS: Die Endkonzentrationen der JBNt-Proben, gekennzeichnet mit TGF-β1, und der markierten Matrilin-3-Proben betrugen 111 μg/ml, 8,9 μg/ml bzw. 36 μg/ml.
6. Übertragen Sie jede Probengruppe (d. h. TGF-β1 (Schritt 6.1), beschriftete Matrilin-3 (Schritt 6.2), beschriftete TGF-β1/matrilin-3 (Schritt 6.3), JBNts (Schritt 6.4), JBNm (Schritt 6.5)) in ihre eigene Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Platte.
7. Legen Sie die schwarze 384-Well-Platte in einen Multimode-Mikroplattenleser ein und messen Sie bei Anregungswellenlängen von 488 nm und 555 nm gemäß dem Protokoll des Herstellers.

7. In-vitro-Test der biologischen Funktion

1. Zellhaftungstest an vorbeschichteten Deckglaskammern
   1. Bereiten Sie zwei Kammerdeckgläser mit fünf Probengruppen vor, da für jeden Zelltyp ein Deckglas verwendet wird.
   2. 1,25 μL 1 mg/ml JBNts zu 198,75 μL destilliertem Wasser geben, was zu einer 6,25 μg/ml Lösung führt.
   3. 10 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 190 μL destilliertem Wasser geben, was zu einer 0,5 μg/mLLösung führt.
   4. 2,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 197,5 μg/ml destilliertem Wasser geben, was zu einer 0,125 μg/ml Lösung führt.
   5. Für die JBNm-Gruppe 10 μL 10 μg/ml Matilin-3 zu 2,5 μL 10 μg/mLTGF-β1 geben und wiederholt pipettieren. 1,25 μL JBNts mit einer Konzentration von 1 mg/ml in die Mischungslösung geben und pipetten. Schließlich werden 186,25 μL destilliertes Wasser hinzugefügt, um eine 200 μL JBNm-Lösung zu erhalten.
      1. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe 200 μL destilliertes Wasser.
   6. Fügen Sie jede Probengruppe in eine eigene Vertiefung aus einem Kammerdeckglas Nr. 1,5 hinzu. Das Deckglas für 1 h in einen Gefrierschrank bei -80 °C geben und anschließend mit einem Gefriergerät gefriertrocknen.
   7. Samen Sie humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) und menschliche Chondrozytenzellen (10.000 Zellen pro Well) in jede Vertiefung der vorbereiteten Kammerdeckgläser.
   8. Die beiden Deckgläser für 4 h in einem 37 °C Inkubator inkubieren. Dann saugen Sie das Zellkulturmedium ab und spülen Sie zweimal mit PBS ab.
   9. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 5 min und entfernen und spülen Sie dann Proben mit PBS. Spülen Sie die Probe ein zweites Mal, um das 4% ige Paraformaldehyd vollständig zu entfernen.
   10. Zellen mit 100 μL 0,1% Triton-X für 10 min inkubieren und mit PBS waschen. Geben Sie 100 μL 0,165 μM Rhodamin-Phalloidin in jede Vertiefung. Warten Sie 30 Minuten und waschen Sie dann erneut mit PBS.
   11. Fügen Sie 0,1 μg/ml DAPI zu jeder Vertiefung hinzu, um die Kerne zu färben. Warten Sie 5 min und spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS ab.
   12. Verwenden Sie ein spektrales konfokales Mikroskop, um die Zellmorphologie zu beobachten und fluoreszierende Bilder aufzunehmen.
   13. Analysieren Sie außerdem die Zellzahl und Morphologie mit Bildverarbeitungssoftware. Öffnen Sie die Software und laden Sie die Bilder. Fügen Sie einen Maßstabsbalken hinzu und kalibrieren Sie die Software. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in einem bestimmten Bereich für jede Probe. Verwenden Sie dann das Messwerkzeug, um Daten zur Zellmorphologie für jede Probe zu sammeln.
2. Zellproliferation
   1. Bereiten Sie drei unbehandelte 96-Well-Platten vor und fügen Sie jeweils fünf Gruppen von Proben hinzu.
      1. Für die JBNt-Gruppe werden 3,75 μL 1 mg/ml JBNts zu 596,25 μL destilliertem Wasser gegeben, was zu einer 600 μL JBNt-Lösung mit einer Konzentration von 6,25 μg/ml führt.
      2. Für die TGF-β1-Gruppe werden 7,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 592,5 μL destilliertem Wasser gegeben, was zu einer Testlösung von 0,125 μg/ml führt.
      3. Für die Matrilin-3-Gruppe werden 30 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 570 μL destilliertem Wasser gegeben, was zu einer 0,5 μg/ml Testlösung führt.
      4. Für die JBNm-Gruppe 7,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 mit 30 μL 10 μg/ml Matilin-3 mischen und mehrmals pipettieren, gefolgt von Zugabe von 3,75 μL 1 mg/ml JBNts zur Lösung.
      5. JBNm-Lösung wird mit 558,75 μl destilliertem Wasser verdünnt, um die Endkonzentrationen von 6,25 μg/ml, 0,125 μg/ml bzw. 0,5 μg/ml für JBNt-, TGF-β1- und Matrilin-3-Proben zu erhalten.
      6. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe 600 μL destilliertes Wasser.
   2. Teilen Sie jede Probengruppe in sechs Vertiefungen auf (100 μL Probe pro Vertiefung).
   3. Die drei Platten mit allen Proben werden für 1 h in einen Gefrierschrank bei -80 °C gegeben und anschließend mit einem Gefriergerät gefriergetrocknet.
   4. Säen Sie hMSCs auf diese Platten und erhalten jeweils eine 100-μL-Zellsuspension (pro Vertiefung) mit 5.000 Zellen. Die drei Platten bei 37 °C für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage bei 5% CO₂ inkubieren.
   5. 10 μL CCK-8-Lösung in jede Vertiefung mit den Zellen geben und bei 37 °C für weitere 2 h inkubieren.
   6. Messen Sie die Absorptionswerte jeder Vertiefung mit Multimode-Mikroplattenlesern bei 450 nm.
   7. Säen Sie einen bekannten Gradienten von hMSCs auf eine 96-Well-Platte und inkubieren Sie für 4 h. Verwenden Sie den CCK-8-Assay, um die Absorptionswerte der bekannten Anzahl von Zellen zu messen und eine Standardkurve zu erstellen.
   8. Berechnen Sie die Zellproliferation mithilfe der Absorptionsstandardkurve.
3. Stabilitätstest
   HINWEIS: Ein humanes TGF-β1-gezieltes ELISA-Kit wurde verwendet, um die prozentuale Freisetzung von TGF-β1 aus dem JBNm in einem Agarose-Hydrogel zu bestimmen.
   1. Bereiten Sie 2% Agarose vor, indem Sie 400 mg Agarosepulver zu 20 ml PBS geben und auf 100 °C erhitzen, um das Agarosepulver vollständig aufzulösen.
   2. Bereiten Sie das JBNm im gekühlten 2% igen Agarose-Hydrogel vor.
      1. Kombinieren Sie 10 μL 10 μg/ml TGF-β1, 40 μL 10 μg/ml Matrilin-3, 5 μL 1 mg/ml JBNts und 195 μL PBS. Mischen Sie diese Lösung mit 250 μL 2% Agarose, wodurch das JBNm-Hydrogel entsteht.
   3. Fügen Sie 500 μL PBS hinzu, verwenden Sie es als Release-Lösung, und stellen Sie sicher, dass Sie es alle 3 Tage wechseln. Bewahren Sie jede freigegebene Lösung auf und lassen Sie die Probe 15 Tage lang ruhen.
   4. Verwenden Sie ein ELISA-Kit, um jede der erfassten Release-Lösungen zu testen, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
      ANMERKUNG: Durch Subtraktion der im PBS freigesetzten TGF-β1-Menge vom theoretischen Belastungswert von 100% kann die verbleibende Menge an TGF-β1 bestimmt werden.
4. Zelldifferenzierungsanalyse mit PCR²⁶.
   1. Es werden sieben Probengruppen vorbereitet, wobei jede Probe 20 μL Zellsuspension (4 x 10⁴ Zellen), 30 μL der spezifischen Lösung (oder PBS, je nach Probengruppe) und 50 μL 2 Gew.-% Agarose enthält.
      1. Für die TGF-β1-Gruppe werden 5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 25 μL PBS hinzugefügt, was zu einer 1,6 μg/ml Lösung führt.
      2. Für die Matrilin-3-Gruppe fügen Sie 20 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 10 μL PBS hinzu, was zu einer 6,7 μg/mL Lösung führt.
      3. Für die JBNt-Gruppe fügen Sie 2,5 μL 1 mg/ml JBNts zu 27,5 μL PBS hinzu, was zu einer 83,3 μg/ml Lösung führt.
      4. Für die J/T/M JBNm-Gruppe 10 μL 10 μg/ml Matrilin-3 auf 5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zugeben und nach oben und unten pipettieren, um die Lösung zu mischen. Dann fügen Sie 2,5 μL 1 mg / ml JBNts hinzu und pipetten Sie erneut. Zum Schluss mit 2,5 μL PBS verdünnen.
      5. Verwenden Sie für jede Kontrollgruppe 30 μL PBS als Probe.
   2. Fügen Sie 0,5 ml Zellkulturmedium zu jeder Vertiefung hinzu und ersetzen Sie sie alle 3 Tage.
      1. Verwenden Sie für die Positivkontrollgruppe ein kommerziell erhältliches chondrogenes hMSC-Medium, das zugesetztes TGF-β1 enthält. Dieser zusätzliche TGF-β1 entspricht dem Betrag in den Gruppen TGF-β1 und J/T/M JBNm.
      2. Verwenden Sie für eine der Negativkontrollgruppen ein handelsübliches chondrogenes hMSC-Medium, das kein TGF-β1 enthält. Verwenden Sie für die andere Negativkontrollgruppe ein DMEM-Zellkulturmedium, das 10% fötales Rinderserum (FBS) enthält.
      3. Verwenden Sie für jede andere Gruppe ein kommerzielles chondrogenes hMSC-Zellkulturmedium ohne TGF-β1.
   3. Kultivieren Sie die Proben für 15 Tage.
   4. Extrahieren Sie die RNA der Proben und führen Sie eine PCR durch, um die Differenzierung der Proben wie zuvor beschrieben^{zu untersuchen 26}.
5. Immunfärbung für Typ-X-Kollagenexpressionstest
   1. Bereiten Sie sieben Agarose-basierte Proben auf die gleiche Weise vor wie die Zelldifferenzierung mit dem PCR-Methodenabschnitt (Schritt 7.4).
   2. Kultivieren Sie die Proben für 15 Tage.
   3. Die Proben 1 Tag lang mit 4% Formaldehyd fixieren, über Nacht in 30%iger Saccharoselösung einweichen und dann über Nacht bei -80 °C mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Fixieren Sie die Proben mit dem optimalen Schnitttemperatur-Compound-Reagenz (OCT), einer Mischung aus wasserlöslichen Glykolen und Harzen, bei -10 °C.
   4. Bedienen Sie ein Kryostat-Mikrotom, um 20 μm dicke gefrorene Abschnitte jeder Probe zu erhalten.
   5. Färben Sie jeden Abschnitt mit einem Anti-Collagen X-Antikörper mit einer Verdünnung von 1:800 und einem fluoreszierenden sekundären Antikörper, der gemäß den Protokollen des Herstellers mit PBS verdünnt ist.
   6. Beobachten Sie jeden Abschnitt mit einem konfokalen Mikroskop mit einer Anregung von 488 nm und einer 40-fachen Vergrößerung des Okulars.

Ergebnisse

Nach dem Protokoll wurden JBNts erfolgreich synthetisiert und mit UV-Vis-Absorption und TEM charakterisiert. Das JBNm ist ein injizierbares festes Gerüst, das einen schnellen biomimetischen Prozess durchläuft. Nachdem JBNts zu einer Mischung aus TGF-β1/Matrilin-3-Lösung in einer physiologischen Umgebung gegeben wurden, bildete sich ein festes Weißmaschengerüst, das auf den erfolgreichen Zusammenbau von JBNm hinweist, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Dies wurde in den Charakterisierungs...

Diskussion

Das Ziel dieser Studie ist es, eine biomimetische Gerüstplattform, das JBNm, zu entwickeln, um die Einschränkungen herkömmlicher Gewebekonstrukte zu überwinden, die auf Zellkulturumgebungen angewiesen sind, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Das JBNm ist ein Schicht-für-Schicht-Strukturgerüst für ein selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt. Das innovative Design basiert auf neuartigen DNA-inspirierten Nanomaterialien, den JBNts. Das JBNm, bestehend aus JBNts³⁰, TGF-β1 und Matrilin-3,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.