연골 재생을 촉진하기 위한 층별 야누스 베이스 나노매트릭스의 제작 및 특성 분석

요약

이 프로토콜은 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)을 순차적으로 추가하여 층별 야누스 염기 나노 매트릭스 (JBNm) 스캐 폴드의 조립을 설명합니다. JBNm은 제작되고 특성화되었습니다. 또한 우수한 생리활성을 나타내어 부착, 증식 및 분화와 같은 세포 기능을 촉진했습니다.

초록

다양한 생체 재료 스캐폴드는 시험관내 및 생체 내 사용을 위한 특정 기능을 촉진하기 위해 세포 부착 및 증식을 안내하기 위해 개발되었습니다. 이러한 생체 재료 스캐폴드 내로의 성장 인자의 첨가는 일반적으로 최적의 세포 배양 환경을 제공하고, 세포 분화 및 그 후속 기능을 매개하기 위해 수행된다. 그러나, 종래의 생체 재료 스캐폴드 내의 성장 인자는 전형적으로 이식시 방출되도록 설계되어, 주변 조직 또는 세포에 의도하지 않은 부작용을 초래할 수 있다. 여기에서 DNA에서 영감을 받은 야누스 염기 나노매트릭스(JBNm)는 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조로 고도로 국소화된 미세 환경을 성공적으로 달성했습니다. JBNms는 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 생체 친화도를 통해 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)에서 자체 조립됩니다. JBNm은 TGF-β1:matrilin-3:JBNt 비율이 1:4:10으로 조립되었는데, 이는 층별 구조로의 적절한 조립이 발생할 수 있는 결정된 비율이기 때문입니다. 먼저, TGF-β1 용액을 마트릴린-3 용액에 첨가하였다. 이어서, 이 혼합물을 JBNt 용액의 첨가 전에 충분한 균질성을 보장하기 위해 수회 피펫팅하였다. 이것은 여러 번 다시 피펫팅한 후 층별 JBNm을 형성했습니다. 층별 JBNm 구조, JBNt 단독, 마트릴린-3 단독, 및 TGF-β1 단독을 특성화하기 위해 다양한 실험을 수행하였다. JBNm의 형성은 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로 연구되었고, JBNm의 구조는 투과 전자 현미경 (TEM)으로 관찰되었습니다. 혁신적인 층별 JBNm 스캐폴드가 분자 규모로 형성됨에 따라 형광 염료 표지 JBNm을 관찰할 수 있었습니다. TGF-β1은 주사 가능한 JBNm의 내부 층 내에 국한되어 주변 부위로의 성장 인자 방출을 방지하고 국소 연골 생성을 촉진하며 항 비대 미세 환경을 촉진 할 수 있습니다.

서문

조직 공학의 스캐폴드는 세포 부착 및 후속^{조직 발달을} 위한 구조적 지지를 제공하는 데 중요한 역할을 합니다1. 전형적으로, 어떠한 스캐폴딩도 없는 종래의 조직 구축물은 세포 배양 환경에 의존하고 세포 분화를 매개하기 위해 추가된 성장 인자에 의존한다. 또한, 스캐폴드에 생리활성 분자를 추가하는 것은 종종 세포 분화 및 기능 ^2,3을 안내하는 데 선호되는 접근 방식입니다. 일부 스캐폴드는 네이티브 조직의 생화학적 미세 환경을 독립적으로 모방할 수 있는 반면, 다른 스캐폴드는 성장 인자를 통해 세포 기능에 직접 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 연구자들은 종종 세포 부착, 성장 및 분화에 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 스캐폴드를 선택하는 데 어려움을 겪는 동시에^{장기간에 걸쳐} 최적의 구조적 지지와 안정성을 제공합니다^4,5. 생리 활성 분자는 종종 스캐폴드에 느슨하게 결합되어 이식시 이러한 단백질이 빠르게 방출되어 원치 않는 위치에서 방출됩니다. 이것은 의도적으로 표적화되지 않은 조직이나 세포에 대한 부작용으로 절정에 달합니다 ^6,7.

비계는 일반적으로 고분자 재료로 만들어집니다. 야누스 베이스 나노-매트릭스(JBNm)는 자가 지속 가능한 연골 조직 구축물⁸을 위한 새로운 층별 방법으로 만들어진 생체모방 스캐폴드 플랫폼이다. 이 새로운 DNA에서 영감을 받은 나노튜브는 세포외 기질(ECM)에서 발견되는 콜라겐의 구조와 표면 화학을 적절하게 모방하기 때문에 야누스 베이스 나노튜브(JBNts)로 명명되었습니다. JBNm은 matrilin-3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)과 같은 생리 활성 분자를 첨가하여 원하는 세포 및 조직 기능을 자극 할 수있는 최적의 미세 환경을 만들 수 있습니다⁹.

JBNts는 핵염기 아데닌과 티민의 합성 버전에서 파생 된 새로운 나노 튜브입니다. JBNts는 자체 조립⁽¹⁰)을 통해 형성됩니다. 6 개의 합성 핵염기가 결합하여 고리를 형성하고,이 고리는 π-π 스태킹 상호 작용을 거쳐 길이 200-300 μm의 나노 튜브를 만듭니다¹¹. 이 나노 튜브는 구조적으로 콜라겐 단백질과 유사합니다. 천연 연골 미세 환경의 한 측면을 모방함으로써 JBNts는 연골 세포 및 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC^)에 유리한 부착 부위를 제공하는 것으로 나타났습니다^11,12,13,14. 나노 튜브는 자체 조립을 거치고 어떤 종류의 개시제 (예 : 자외선)도 필요로하지 않기 때문에 도달하기 어려운 결함 영역¹⁵에 대한 주사 가능한 스캐 폴드로서의 흥미로운 잠재력을 보여줍니다.

Matrilin-3는 연골에서 발견되는 구조적 세포 외 기질 단백질입니다. 이 단백질은 연골 형성과 적절한 연골 기능에 중요한 역할을합니다^16,17. 최근에는 생체 재료 스캐폴드에 포함되어 비대 ^9,18,19 없이 연골 생성을 촉진합니다. 이 단백질을 JBNm에 포함시킴으로써 연골 세포는 천연 미세 환경과 유사한 구성 요소를 포함하는 스캐 폴드에 끌립니다. 또한, 마트리린-3은 연골세포²⁰ 내에서 적절한 TGF-β1 신호전달을 위해 필요한 것으로 나타났다. 성장 인자는 신호 분자로 기능하여 특정 세포 또는 조직의 특정 성장을 유발합니다. 따라서 최적의 연골 재생을 달성하기 위해 매트릴린-3 및 TGF-β1은 JBNm 내의 필수 구성 요소입니다. 층별 스캐폴드 내로 TGF-β1을 첨가하면 조직 구축물에서 연골 재생을 더욱 촉진할 수 있다. TGF-β1은 연골 결손의 치유 과정을 촉진하고 연골 세포 및 hMSC 증식 및 분화를 촉진하는 데 사용되는 성장 인자입니다^21,22. 따라서 TGF-β1은 연골 재생 JBNm (J / T / M JBNm) ²³에서 중요한 역할을하며, 특히 JBNm 층 내에 국한 될 때 적절한 성장을 촉진합니다.

앞서 언급했듯이 성장 인자는 일반적으로 특정 혼입 방법 없이 스캐폴드 외부에 조립됩니다. 여기에서 생체 재료의 정밀하게 설계된 나노 아키텍처를 통해 JBNm은 의도된 세포와 조직의 특정 표적화를 위해 개발되었습니다. JBNm은 내층의 JBNt 표면에 부착된 TGF-β1과 외층(^24,25)의 JBNt 표면에 부착된 마트릴린-3으로 구성된다. 층별 구조의 내부 층에 TGF-β1을 혼입하면 JBNm 섬유를 따라 고도로 국소화된 미세 환경을 허용하여 단백질¹²의 훨씬 느린 방출을 갖는 항상성 조직 구축물을 생성합니다. JBNm의 주입성은 다양한 미래의 생체 재료 응용 분야에 이상적인 연골 조직 구조물입니다²⁶.

프로토콜

1. JBNts의 합성

1. 다양한 화합물¹²의 합성을 수반하는 이전에 공개된 방법을 활용하여 JBNt 단량체를 제조한다.
2. 조 JBNt 단량체가 합성된 후 역상 컬럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제합니다. 용매 A : 100 % 물, 용매 B : 100 % 아세토 니트릴 및 용매 C : pH = 1의 HCl 수용액을 사용하십시오. 3mL/분의 유속을 사용하십시오. HPLC에서 얻은 가장 큰 피크를 7.2분에 수집한다.

2. JBNt / Matn1 / TGF-β1 제작 (비디오 1)

알림: 비디오 1 은 JBNm이 생리적 환경(수용액, 자외선 없음, 화학 첨가물 없음 및 가열 없음)에서 형성된 주사 가능한 고체임을 보여주며, 이는 생물학적으로도 영감을 받았습니다.

1. H₂O에 현탁 된 1 mg / mL TGF-β1 8 μL를 H₂O에 현탁 된 1 mg / mL matrilin-3 3 32 μL에 첨가하여 이러한 단백질의 적절한 혼합을 보장합니다.
2. _H2O에 현탁된 1mg/mL JBNts 80μL를 TGF-β1/마트리린-3 용액에 첨가합니다. 적절한 혼합을 위해 반복적으로 피펫팅하십시오. 백색 응집의 존재는 JBNt의 첨가 직후에 관찰 될 수 있으며, 이는 JBNm의 형성을 나타냅니다 (비디오 1).

3. 자외선 가시광선(UV-Vis) 흡수가 있는 검체 관찰

참고: UV-Vis 흡수 스펙트럼은 JBNm의 어셈블리를 특성화하기 위해 연구되었습니다. 이 측정은 JBNt 단독, 마트릴린-3 단독, TGF-β1 단독, 및 세 부분으로 구성된 전체 층별 JBNm의 네 가지 범주에 대해 분석되었습니다. 모든 초기 농도는_H2O에 현탁된다.

1. JBNt 그룹의 경우 5μL의_H2O에 1mg/mL JBNt 50μL를 추가하여 90.9μg/mL 용액을 만듭니다.
2. matrilin-3 그룹의 경우 40μL의 10μg/mL matrilin-3을 15μL의_H2O에 추가하여 7.3μg/mL 용액을 만듭니다.
3. TGF-β1 그룹의 경우 10μL의 10μg/mL TGF-β1을 45μL의_H2O에 추가하여 1.8μg/mL 용액을 만듭니다.
4. JBNm 그룹의 경우 10μg/mL 마트릴린-3 40μL를 10μg/mL ^TGF-β1 10μL에 추가합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 교반한 다음 5μL의 1mg/mL JBNts를 용액에 첨가하고 반복적으로 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다.
5. 분광 광도계를 사용하여 각 그룹의 흡수 스펙트럼을 측정합니다.

4. 시편의 제타 전위 측정

참고: JBNm이 생체 내 조직과 어떻게 상호 작용하는지 더 잘 예측하기 위해 제타 전위를 분석했습니다. 세 그룹이 측정되었다: 마트릴린-3 단독, TGF-β1을 사용한 매트릴린-3, 및 전체 층별 JBNm.

1. matrilin-3 그룹의 경우 160μL의 10mg/mL matrilin-3을 640μL의_H2O에 추가하여 800μL 용액을 만듭니다.
2. 매트릴린-3/TGF-β1 화합물의 경우 10μg/mL 매트린-3 160μL를 10μg/mL TGF-β1 40μL에 추가합니다. 적절한 균질성을 보장하기 위해 반복적으로 피펫팅하십시오. 이어서, 이를 600 μL의_H2O에 첨가하여 800 μL 용액을 생성한다.
3. JBNm 그룹의 경우 10μg/mL 매트린-3 160μL를 10μg/mL TGF-β1 40μL에 추가합니다. 단백질을 혼합하기 위해 여러 번 피펫팅하십시오. 그런 다음 균질성을 보장하기 위해 용액과 피펫에 1mg/mL JBNts 20μL를 추가합니다. 마지막으로, JBNm 용액을 580 μL의_H2O에 첨가하여 800 μL 용액을 생성한다.
4. 세 그룹에 대한 제타 전위 값을 측정합니다.

5. 투과전자현미경(TEM)을 위한 JBNt/마트릴린-3 나노매트릭스의 제조

참고 : TEM 특성화는 JBNts 및 JBNm의 형태를 특성화하기 위해 수행됩니다.

1. 두 개의 그리드를 플라즈마 클리너에 삽입하여 게시된 프로토콜 및 제조업체의 프로토콜¹²에 따라 JBNts 및 JBNm의 음성 염색 전에 그리드를 적절하게 청소합니다.
2. 10μL의 1mg/mL JBNt와 40μL의 증류수를 혼합하여 200μg/mL JBNt 용액을 만듭니다.
3. 30μL의 100μg/mL 매트릴린-3을 20μL의 100μg/mL TGF-β1 및 피펫과 여러 번 혼합합니다. 10 μL의 1 mg / mL JBNts를 matrilin-3 / TGF-β1 혼합물에 첨가하여 JBNm 샘플을 준비합니다. 다시, 반복적으로 피펫.
4. 3μL의 JBNt 용액(200μg/mL)과 3μL의 JBNm 용액을 별도의 그리드에 추가하고 2분 동안 그대로 두십시오.
5. 각 그리드를 100 μL의 우라닐 아세테이트 용액 (0.5 %)으로 헹굽니다. 여과지를 사용하여 여분의 용액을 제거하고 그리드를 자연 건조시킵니다.
6. 투과 전자 현미경을 작동하여 이전에 발표 된^11,12와 같이 샘플을 적절하게 관찰하고 특성화합니다.

6. 형광표지 단백질의 흡수 스펙트럼 측정

참고 : JBNm의 구조는 흡수 스펙트럼 분석을 통해 JBNm의 구조를 관찰하여 검증됩니다.

1. 제조업체의 지침에 따라 단백질 라벨링 키트를 사용하여 TGF-β1에 라벨을 붙입니다. 20 μL의 20 μg/mL 표지된 TGF-β1을 25 μL의 H₂O에 첨가하여 8.9 μg/mL 시험 용액을 만듭니다.
2. 별도의 라벨링 키트를 사용하여 matrilin-3에 라벨을 붙입니다. 20 μL의 80 μg/mL 표지된 매트린-3을 25 μL의_H2O에 첨가하여 36 μg/mL 시험 용액을 만듭니다.
   참고 : TGF-β1의 형광 염료 라벨링은 최종 농도가 20 μg / mL 인 반면, matrilin-3의 라벨링은 최종 농도가 80 μg / mL입니다.
3. 20 μL의 80 μg/mL 표지된 매트린-3을 20 μL의 20 μg/mL 표지된 TGF-β1 및 5 μL의 H₂O와 혼합하면 표지된 TGF-β1/matrilin-3 화합물이 생성됩니다. 혼합물을 여러 번 피펫팅하여 혼합하십시오.
4. 40 μL의 H₂O에 5 μL의 1 mg / mL JBNts를 첨가하여 111 μg / mL 용액을 만듭니다.
5. 20μL의 20μg/mL 표지된 TGF-β1을 80μg/mL로 표지된 매트린-3 및 피펫 20μL에 여러 번 추가합니다. 표지된 TGF-β1/매트린-3 용액에 5μL의 1mg/mL JBNts를 추가하고 화합물을 적절하게 혼합하기 위해 반복적으로 피펫팅합니다.
   참고 : JBNt, 표지 된 TGF-β1 및 표지 된 matrilin-3 샘플의 최종 농도는 각각 111 μg / mL, 8.9 μg / mL 및 36 μg / mL였습니다.
6. 각 샘플 그룹 (즉, 표지 된 TGF-β1 (단계 6.1), 표지 된 매트린 -3 (단계 6.2), 표지 된 TGF-β1 / 마트릴린 -3 (단계 6.3), JBNts (단계 6.4), JBNm (단계 6.5))을 검은 색 384 웰 플레이트의 자신의 웰로 옮깁니다.
7. 검은색 384웰 플레이트를 다중 모드 마이크로플레이트 리더에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 488nm 및 555nm의 여기 파장에서 측정합니다.

7. 시험관 내 생물학적 기능 분석

1. 사전 코팅된 커버 유리 챔버의 세포 접착력 테스트
   1. 각 셀 유형에 하나의 커버 글라스가 사용되므로 5 개의 샘플 그룹으로 2 개의 챔버 커버 글라스를 준비하십시오.
   2. 198.75μL의 증류수에 1.25μL의 1mg/mL JBNts를 첨가하여 6.25μg/mL 용액을 생성합니다.
   3. 190μL의 증류수에 10μL의 10μg/mL 매트린-3을 추가하여 0.5μg/mL 용액을 만듭니다.
   4. 197.5 μg/mL의 증류수에 10 μg/mL TGF-β1 2.5 μL를 첨가하여 0.125 μg/mL 용액을 만듭니다.
   5. JBNm 그룹의 경우 10μg/mL 매트린-3 10μL를 10μg/mLTGF-β1 및 피펫 2.5μL에 추가합니다. 1 mg/mL 농도의 JBNts 1.25 μL를 혼합물 용액과 피펫에 추가합니다. 마지막으로 186.25μL의 증류수를 추가하여 200μL JBNm 용액을 만듭니다.
      1. 대조군의 경우 200μL의 증류수를 사용하십시오.
   6. 각 샘플 그룹을 No. 1.5 챔버 커버 글라스의 자체 웰에 추가하십시오. 커버 글라스를 -80 °C 냉동고에 1 시간 동안 넣은 다음 동결 건조기 기기로 동결 건조시킵니다.
   7. 준비된 챔버 커버 글라스의 각 웰에 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)와 인간 연골세포 세포(웰당 10,000개 세포)를 시드합니다.
   8. 두 개의 커버 글라스를 37°C 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다. 이어서, 세포 배양 배지를 흡인하고 PBS로 2회 헹굽니다.
   9. 세포를 4% 파라포름알데히드로 5분 동안 고정한 다음 PBS로 샘플을 제거하고 헹굽니다. 샘플을 두 번째로 헹구어 4% 파라포름알데히드를 완전히 제거합니다.
   10. 세포를 100 μL의 0.1% 트리톤-X로 10분 동안 배양하고 PBS로 세척한다. 각 웰에 0.165μM 로다민-팔로이딘 100μL를 추가합니다. 30분 동안 기다렸다가 PBS로 다시 씻습니다.
   11. 각 웰에 0.1μg/mL DAPI를 추가하여 핵을 염색합니다. 5 분 동안 기다렸다가 PBS로 웰을 두 번 헹굽니다.
   12. 스펙트럼 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 형태를 관찰하고 형광 이미지를 캡처합니다.
   13. 또한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 세포 수와 형태를 분석합니다. 소프트웨어를 열고 이미지를로드하십시오. 스케일 바를 추가하고 소프트웨어를 보정합니다. 각 샘플에 대해 주어진 영역의 셀 수를 계산합니다. 그런 다음 측정 도구를 사용하여 각 샘플의 세포 형태에 대한 데이터를 수집합니다.
2. 세포 증식
   1. 3개의 처리되지 않은 96웰 플레이트를 준비하고 각각에 5개의 샘플 그룹을 추가합니다.
      1. JBNt 그룹의 경우 증류수 596.25μL에 1mg/mL JBNts 3.75μL를 추가하면 농도가 6.25μg/mL인 600μL JBNt 용액이 생성됩니다.
      2. TGF-β1 그룹의 경우 592.5μL의 증류수에 10μg/mL TGF-β1 7.5μL를 추가하여 0.125μg/mL의 테스트 용액을 만듭니다.
      3. matrilin-3 그룹의 경우 30μL의 10μg/mL matrilin-3을 증류수 570μL에 추가하여 0.5μg/mL 테스트 용액을 만듭니다.
      4. JBNm 그룹의 경우 7.5μL의 10μg/mL TGF-β1과 30μL의 10μg/mL 매트릴린-3 및 피펫을 여러 번 혼합한 다음 3.75μL의 1mg/mL JBNts를 용액에 추가합니다.
      5. JBNt 용액 558.75μL를 증류수로 희석하여 JBNt, TGF-β1 및 matrilin-3 샘플에 대해 각각 6.25μg/mL, 0.125μg/mL 및 0.5μg/mL의 최종 농도를 얻습니다.
      6. 대조군의 경우 600μL의 증류수를 사용하십시오.
   2. 각 샘플 그룹을 6개의 웰(웰당 샘플 100μL)로 나눕니다.
   3. 모든 샘플이 들어 있는 3개의 플레이트를 -80°C 냉동고에 1시간 동안 넣은 다음 동결건조 기기로 동결건조합니다.
   4. 이 플레이트에 hMSC를 시드하고, 각각 5,000개의 세포를 포함하는 100μL 세포 현탁액(웰당)을 받습니다. 3개의 플레이트를 5%_CO2에서 1일, 3일, 또는 5일 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
   5. 10 μL의 CCK-8 용액을 세포와 함께 각 웰에 첨가하고 37 °C에서 2 시간 더 배양한다.
   6. 450nm에서 다중 모드 마이크로플레이트 리더로 각 웰의 흡수 값을 측정합니다.
   7. hMSC의 알려진 기울기를 96웰 플레이트에 시드하고 4시간 동안 배양합니다. CCK-8 분석을 사용하여 알려진 세포 수의 흡수 값을 측정하고 표준 곡선을 생성합니다.
   8. 흡수 표준 곡선을 사용하여 세포 증식을 계산합니다.
3. 안정성 테스트
   참고: 인간 TGF-β1 표적 ELISA 키트를 사용하여 아가로스 히드로겔에서 JBNm으로부터 TGF-β1의 백분율 방출을 측정하였다.
   1. PBS 20mL에 아가로스 분말 400mg을 첨가하고 100°C까지 가열하여 2% 아가로스를 제조하여 아가로스 분말을 완전히 용해시킨다.
   2. 냉각된 2% 아가로스 하이드로겔 내부에 JBNm을 준비한다.
      1. 10 μL의 10 μg/mL TGF-β1, 40 μL의 10 μg/mL 마트리린-3, 5 μL의 1 mg/mL JBNts 및 195 μL의 PBS를 결합합니다. 이 용액을 2 % 아가 로스 250 μL와 혼합하여 JBNm 하이드로 겔을 만듭니다.
   3. 500μL의 PBS를 방출 용액으로 사용하여 추가하고 3일마다 교체하십시오. 방출 된 모든 용액을 보관하고 샘플을 15 일 동안 그대로 두십시오.
   4. ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 캡처된 각 릴리스 솔루션을 테스트합니다.
      참고 : 이론적 로딩 값 100 %에서 PBS에서 방출되는 TGF-β1의 양을 빼면 TGF-β1의 잔량을 결정할 수 있습니다.
4. PCR²⁶을 이용한 세포 분화 분석.
   1. 20 μL의 세포 현탁액 (4 x 10⁴ 세포), 30 μL의 특정 용액 (또는 샘플 그룹에 따라 PBS), 및 50 μL의 2 wt% 아가로스를 함유하는 각각의 샘플로 7개의 샘플 그룹을 준비한다.
      1. TGF-β1 그룹의 경우 10μg/mL TGF-β1 5μL를 PBS 25μL에 추가하여 1.6μg/mL 용액을 만듭니다.
      2. matrilin-3 그룹의 경우 10μg/mL matrilin-3 20μL를 PBS 10μL에 추가하여 6.7μg/mL 용액을 만듭니다.
      3. JBNt 그룹의 경우 27.5μL의 PBS에 2.5μL의 1mg/mL JBNt를 추가하면 83.3μg/mL 용액이 생성됩니다.
      4. J/T/M JBNm 그룹의 경우 10μL의 10μg/mL 매트린-3에 5μL의 10μg/mL TGF-β1과 피펫을 위아래로 추가하여 용액을 혼합합니다. 그런 다음 2.5μL의 1mg/mL JBNt와 피펫을 다시 추가합니다. 마지막으로 2.5μL의 PBS로 희석합니다.
      5. 각 대조군에 대해 30μL의 PBS를 샘플로 사용합니다.
   2. 각 웰에 0.5mL의 세포 배양 배지를 추가하고 3일마다 교체해야 합니다.
      1. 양성대조군의 경우, TGF-β1이 첨가된 시판되는 hMSC 연골성 배지를 사용한다. 이 추가 TGF-β1은 TGF-β1 및 J/T/M JBNm 그룹 모두의 양과 동일하다.
      2. 음성 대조군 중 하나의 경우, TGF-β1을 포함하지 않는 상업용 hMSC 연골 배지를 사용하십시오. 다른 음성 대조군의 경우, 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM 세포 배양 배지를 사용한다.
      3. 다른 모든 그룹의 경우 TGF-β1이 없는 상업용 hMSC 연골성 세포 배양 배지를 사용하십시오.
   3. 샘플을 15일 동안 배양한다.
   4. 샘플의 RNA를 추출하고 PCR을 수행하여 앞서 설명한 대로 샘플의 분화를 연구합니다²⁶.
5. X형 콜라겐 발현 분석을 위한 면역염색
   1. 상기와 동일한 방법으로 분화된 7개의 아가로오스계 시료를 PCR 방법으로 PCR 방법으로 준비한다(단계 7.4).
   2. 샘플을 15일 동안 배양한다.
   3. 샘플을 4% 포름알데히드로 1일 동안 고정하고 30% 자당 용액에 밤새 담근 다음 액체 질소로 -80°C에서 밤새 동결합니다. 수용성 글리콜과 수지의 혼합물인 최적의 절단 온도 복합 시약(OCT)을 사용하여 -10°C에서 샘플을 고정합니다.
   4. 저온 유지 장치 마이크로톰을 작동하여 각 샘플의 20μm 두께의 냉동 섹션을 얻습니다.
   5. 제조업체의 프로토콜에 따라 1:800 희석된 항콜라겐 X 항체와 PBS로 희석된 형광 표지 2차 항체로 각 섹션을 염색합니다.
   6. 접안렌즈에서 488nm의 여기와 40x의 배율을 사용하여 컨포칼 현미경으로 각 섹션을 관찰합니다.

결과

프로토콜에 따라 JBNts는 UV-Vis 흡수 및 TEM으로 성공적으로 합성되고 특성화되었습니다. JBNm은 빠른 생체 모방 과정을 거치는 주사 가능한 고체 스캐폴드입니다. 생리학적 환경에서 TGF-β1/matrilin-3 용액의 혼합물에 JBNts를 첨가한 후, 그림 1에서 볼 수 있듯이 JBNm의 성공적인 조립을 나타내는 단단한 흰색 메쉬 스캐폴드가 형성되었습니다. 이것은 특성화 방법에서 입증되었습니?...

토론

이 연구의 목표는 세포 분화를 매개하기 위해 세포 배양 환경에 의존하는 기존 조직 구축물의 한계를 극복하기 위해 생체 모방 스캐폴드 플랫폼인 JBNm을 개발하는 것입니다. JBNm은 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조 스캐폴드입니다. 혁신적인 디자인은 새로운 DNA에서 영감을 받은 나노 물질인 JBNts를 기반으로 합니다. JBNts³⁰, TGF-β1 및 matrilin-3으로 구성된 JBNm은 스...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.