用立方体进行全肾三维染色

摘要

本协议描述了用于三维（3D）肾脏成像的组织清除方法和全安装免疫荧光染色。这种技术可以为肾脏病理学提供宏观视角，从而带来新的生物学发现。

摘要

尽管常规病理学提供了大量关于肾脏微观结构的信息，但由于缺乏三维（3D）信息，很难知道肾脏中血管，近端小管，集合管，肾小球和交感神经的精确结构。光学清除是克服这一巨大障碍的好策略。通过结合组织清除和3D成像技术，可以以单细胞分辨率分析整个器官中的多个细胞。然而，用于全器官成像的细胞标记方法仍然不发达。特别是，由于抗体穿透困难，整个安装器官染色具有挑战性。本协议开发了一种全安装小鼠肾脏染色，用于使用CUBIC（透明，无阻碍的脑/身体成像混合物和计算分析）组织清除方法进行3D成像。该方案能够从综合的角度可视化糖尿病肾病早期缺血再灌注损伤和肾小球肿大后的肾交感神经去神经。因此，这种技术可以通过提供宏观视角来导致肾脏研究的新发现。

引言

肾脏由各种细胞群组成。虽然常规病理学为我们提供了许多关于肾脏微环境的信息，但需要三维（3D）成像来精确了解肾脏疾病进展过程中的细胞间串扰。过去，全器官3D成像需要进行大量的连续切片和图像重建¹。然而，这种方法需要太多的努力，并且在重现性方面存在问题。

光学清除是克服这一障碍的好策略^2，3。组织混浊主要是由于光散射和吸收，因为每个器官由各种物质组成，包括水、蛋白质和脂质。因此，组织清除的基本策略是用折射率（RI）匹配试剂代替组织中的水和脂质，这些试剂具有与蛋白质^相同的光学特性4。为了观察透明标本，光片荧光显微镜是有用的⁵。光片从侧面照亮透明标本，激发信号通过位于垂直位置的物镜⁶采集。该显微镜在单次扫描中获取横截面信息，这与共聚焦或多光子荧光显微镜不同。因此，它可以快速获取具有低光漂白水平的z-stack图像。

清晰、无阻碍的脑/身体成像混合物和计算分析 （CUBIC） 是一种组织清除方法，可通过光片荧光显微镜²，^7，8 进行全器官成像。在本研究中优化了立方体和全安装免疫荧光染色，以可视化小鼠肾脏3D结构⁹，^10，11。使用这种全安装染色方法，在糖尿病肾病早期的缺血再灌注损伤 9^，10 和肾小球肿大¹¹ 以及整个肾脏中的血管、近端小管和集合管⁹ 后，可以看到肾交感神经的改变。

研究方案

所有实验均获得东京大学机构审查委员会的批准。所有动物程序均根据美国国立卫生研究院指南进行。8周龄的雄性C57BL / 6NJcl小鼠用于本研究。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 动物制备和肾脏固定

1. 按照以下步骤进行灌注固定。
   1. 通过吸入异氟醚（3%，2.0L / min）和腹膜内给予盐酸美托咪定（0.3mg / kg），酒石酸布托芬诺（5mg / kg）和咪达唑仑（4mg / kg）麻醉小鼠（参见 材料表）。
   2. 用 20 mL PBS （pH 7.4） 和 30 mL 4% PFA 磷酸盐缓冲液 （PB） 通过心脏左心室灌注动物¹²。
2. 在灌注固定和肾脏取样后立即进行浸入式固定⁹.
   1. 将肾脏浸入4°C的4%PFA中再浸泡16小时，然后用PBS洗涤2小时（三次）⁹ （图1）。
      注意:甲醛和多聚甲醛是有毒刺激物。使用适当的个人防护设备在通风橱中处理试剂。

2.脱色脱脂

1. 根据先前发表的报告⁴，^8，9，制备CUBIC-L用于脱色和脱脂，由10wt%的Triton X-100和10wt%的N-丁酰基二乙醇胺组成（见材料表）。
2. 按照以下步骤通过CUBIC-L进行脱色和脱脂。
   1. 将固定肾脏浸入 7 mL 的 50% （v/v） CUBIC-L（水和 CUBIC-L 的 1:1 混合物）中，在 14 mL 圆底管（参见 材料表）中，在室温下轻轻摇动 6 小时（图 2A）。然后，将其浸入7mL的CUBIC-L中，在37°C下轻轻摇动5天。
   2. 在此过程中每天刷新 CUBIC-L。脱色和脱脂过程后，在室温下用PBS洗涤肾脏2小时（三次）⁹ （图1）。使用分液勺处理样品（图2B）。

3. 全安装免疫荧光染色

1. 准备染色缓冲液。
   1. 通过将 0.5% （v/v） Triton X-100、0.5% 酪蛋白在 PBS 中和 0.05% 叠氮化钠⁹ 混合来制备一抗染色缓冲液。
   2. 通过将 0.5% （v/v） Triton X-100、0.1% 酪蛋白在 PBS 中和 0.05% 叠氮化钠⁹ 混合来制备二抗染色缓冲液。
2. 用一抗进行染色。
   1. 在37°C的染色缓冲液中用一抗（1:100或1:200，参见 材料表）对脱脂的肾脏进行免疫染色，轻轻摇动7天。
      注意:一个肾脏所需的染色缓冲液量为500-600μL（图2C）。
   2. 在室温下用0.5%（v / v）Triton X-100在PBS（PBST）中洗涤肾脏^1天9 （图1）。
3. 用二抗进行染色。
   1. 在37°C的染色缓冲液中用二抗（1:100或1:200，参见 材料表）对肾脏进行免疫染色，轻轻摇动7天。在室温下用PBST清洗肾脏^1天9 （图1）。
   2. 固定后⁹，将肾脏浸入1%甲醛中的PB（37%甲醛和PB的1:36混合物）中3小时，并在室温下用PBS洗涤6小时（图1）。

4. 折射率 （RI） 匹配

1. 准备立方体-R+。
   1. 通过混合45wt%的2，3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮/安替比林和30wt%的烟酰胺来制备CUBIC-R（见 材料表）。
   2. 按照先前发表的报告⁴，⁸，⁹，向 CUBIC-R 中添加 0.5 v% 的 N-丁酰基二乙醇胺^，制备用于折射率 （RI） 匹配的 CUBIC-R+。
2. 执行 RI 匹配。
   1. 将肾脏浸入 7 mL 的 50% （v/v） CUBIC-R+（水和 CUBIC-R+ 的 1:1 混合物）中，在 14 mL 圆底管中，在室温下轻轻摇动 1 天。然后，将其浸入 7 mL 的 CUBIC-R+ 中，在室温下轻轻摇动 2 天⁹ （图 1）。
      注意:尽管肾脏在RI匹配开始时漂浮在50%的CUBIC-R +中，但在该过程结束时，肾脏在CUBIC-R +中下沉并变得透明（图2D）。

5. 图像采集与重建

1. 在图像采集（RI = 1.51）⁵ （图3）期间，将RI匹配的肾脏浸入硅油（RI = 1.555）和矿物油（RI = 1.467）（55:45）的混合物中。
2. 使用定制的⁹ 光片荧光显微镜获取整个肾脏的3D图像（见 材料表）。以 16 位 TIFF 格式收集所有原始图像数据。使用成像分析软件（Imaris，参见 材料表）可视化和捕获 3D 渲染的图像。

结果

使用这种染色方法，可视化整个肾脏中的交感神经[抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体]和动脉[抗α平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体]（图4A，B和视频1^）9。缺血/再灌注损伤（IRI）后也可见异常的肾交感神经^9，10（图4C）。此外，使用该协议实现了整个脾^脏13中?...

讨论

该协议允许对各种结构进行全肾3D成像，例如交感神经，集合管，动脉，近端小管和肾小球⁹，^10，11。这种染色方法提供了宏观观察，并通过可视化缺血再灌^注损伤9，¹⁰后肾交感神经的改变和糖尿病肾病初始阶段肾小球肿大^11，带来了新的生物学发现。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer