Coloration tridimensionnelle des reins entiers avec CUBIC

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode de nettoyage tissulaire et une coloration immunofluorescente à montage entier pour l’imagerie rénale tridimensionnelle (3D). Cette technique peut offrir des perspectives macroscopiques en pathologie rénale, conduisant à de nouvelles découvertes biologiques.

Résumé

Bien que la pathologie conventionnelle fournisse de nombreuses informations sur la microstructure rénale, il était difficile de connaître la structure précise des vaisseaux sanguins, des tubules proximaux, des canaux collecteurs, des glomérules et des nerfs sympathiques dans le rein en raison du manque d’informations tridimensionnelles (3D). La compensation optique est une bonne stratégie pour surmonter ce gros obstacle. Plusieurs cellules d’un organe entier peuvent être analysées à une résolution unicellulaire en combinant la clairance tissulaire et la technique d’imagerie 3D. Cependant, les méthodes de marquage cellulaire pour l’imagerie des organes entiers restent sous-développées. En particulier, la coloration des organes entiers est difficile en raison de la difficulté de pénétration des anticorps. Le présent protocole a développé une coloration rénale de souris à montage entier pour l’imagerie 3D avec la méthode de nettoyage tissulaire CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Le protocole a permis de visualiser la dénervation sympathique rénale après une lésion d’ischémie-reperfusion et une glomérulomégalie au stade précoce de la maladie rénale diabétique d’un point de vue global. Ainsi, cette technique peut mener à de nouvelles découvertes dans la recherche rénale en fournissant une perspective macroscopique.

Introduction

Le rein est composé de diverses populations cellulaires. Bien que la pathologie conventionnelle nous donne beaucoup d’informations sur le microenvironnement rénal, l’imagerie tridimensionnelle (3D) est nécessaire pour comprendre précisément la diaphonie intercellulaire au cours de la progression de la maladie rénale. Dans le passé, un grand nombre de coupes en série et de reconstruction d’images devaient être effectuées pour l’imagerie 3D de l’organe entier¹. Cependant, cette méthode nécessitait trop d’efforts et présentait des problèmes en termes de reproductibilité.

Le défrichage optique est une bonne stratégie pour surmonter cet obstacle ^2,3. L’opacité tissulaire est principalement due à la diffusion et à l’absorption de la lumière, car chaque organe est constitué de diverses substances, notamment de l’eau, des protéines et des lipides. Ainsi, la stratégie de base de la clairissance tissulaire consiste à remplacer l’eau et les lipides dans les tissus par des réactifs correspondant à l’indice de réfraction (IR) qui ont les mêmes propriétés optiques que les protéines⁴. Afin d’observer un échantillon transparent, une microscopie fluorescente à feuille de lumière est utile⁵. Des feuilles lumineuses éclairent l’échantillon transparent de côté, et les signaux d’excitation sont acquis à travers la lentille de l’objectif située en position verticale⁶. Cette microscopie permet d’obtenir des informations de coupe transversale en un seul balayage, ce qui est différent de la microscopie confocale ou multiphotonique. Ainsi, il peut rapidement acquérir des images z-stack avec un faible niveau de photoblanchiment.

Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) est l’une des méthodes de nettoyage des tissus qui permet l’imagerie d’organes entiers par microscopie fluorescente^à feuille de lumière ^2,7,8. La coloration immunofluorescente CUBIC et à montage entier est optimisée dans la présente étude pour visualiser les structures 3D des reins^de souris 9,10,11. En utilisant cette méthode de coloration à montage entier, l’altération des nerfs sympathiques rénaux est visualisée après une lésion d’ischémie-reperfusion 9,10 et une glomérulomégalie au stade précoce de la maladie rénale diabétique ¹¹, ainsi que des vaisseaux sanguins^, des tubules proximaux et des canaux collecteurs dans un rein entier ⁹.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Tokyo. Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health. Des souris C57BL/6NJcl mâles, âgées de 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).

1. Préparation animale et fixation rénale

1. Effectuez la fixation de perfusion en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane (3 %, 2,0 L/min) et administration intrapéritonéale de chlorhydrate de médétomidine (0,3 mg/kg), de tartrate de butorphanol (5 mg/kg) et de midazolam (4 mg/kg) (voir le tableau des matières).
   2. Perfuser l’animal avec 20 mL de PBS (pH 7,4) et 30 mL de PFA à 4% dans un tampon phosphate (PB) à travers le ventricule gauche du cœur¹².
2. Effectuer la fixation par immersion juste après la fixation de perfusion et le prélèvement de rein⁹.
   1. Immergez le rein dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant 16 heures supplémentaires, puis lavez-le avec du PBS pendant 2 h (trois fois)⁹ (Figure 1).
      ATTENTION : Le formaldéhyde et le paraformaldéhyde sont des irritants toxiques. Manipuler les réactifs dans une hotte avec l’équipement de protection individuelle approprié.

2. Décoloration et délipidation

1. Préparer CUBIC-L pour la décoloration et la délipidation consistant en 10 % en poids de Triton X-100 et 10 % en poids de N-buthyldiéthanolamine (voir le tableau des matériaux), conformément aux rapports précédemment publiés ^4,8,9.
2. Effectuer la décoloration et la délipidation par CUBIC-L en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Tremper le rein fixe dans 7 mL de CUBIC-L à 50 % (v/v) (mélange 1:1 d’eau et de CUBIC-L) dans un tube à fond rond de 14 ml (voir le tableau des matières) en agitant doucement à température ambiante pendant 6 h (figure 2A). Ensuite, plongez-le dans 7 mL de CUBIC-L dans un tube à fond rond de 14 ml en agitant doucement à 37 °C pendant 5 jours.
   2. Actualisez CUBIC-L tous les jours pendant ce processus. Après le processus de décoloration et de délipidation, laver le rein avec du PBS à température ambiante pendant 2 h (trois fois)⁹ (Figure 1). Utiliser une cuillère de distribution pour la manipulation des échantillons (figure 2B).

3. Coloration immunofluorescente à montage entier

1. Préparez les tampons de coloration.
   1. Préparer le tampon de coloration pour les anticorps primaires en mélangeant 0,5% (v / v) Triton X-100, 0,5% de caséine dans PBS et 0,05% d’azoture de sodium⁹.
   2. Préparer le tampon de coloration pour les anticorps secondaires en mélangeant 0,5% (v / v) Triton X-100, 0,1% de caséine dans PBS et 0,05% d’azoture de sodium⁹.
2. Effectuer une coloration avec des anticorps primaires.
   1. Immunocolorer le rein délipidé avec des anticorps primaires (1:100 ou 1:200, voir le tableau des matières) dans le tampon de coloration à 37 °C avec agitation douce pendant 7 jours.
      REMARQUE : La quantité de tampon de coloration nécessaire pour un rein est de 500 à 600 μL (figure 2C).
   2. Laver le rein avec du Triton X-100 à 0,5 % (v/v) dans du PBS (PBST) à température ambiante pendant 1 jour⁹ (Figure 1).
3. Effectuer une coloration avec des anticorps secondaires.
   1. Immunocolorer le rein avec des anticorps secondaires (1:100 ou 1:200, voir le tableau des matières) dans le tampon de coloration à 37 °C en agitant doucement pendant 7 jours. Lavez le rein avec du PBST à température ambiante pendant 1 jour⁹ (Figure 1).
   2. Après la fixation⁹, immerger le rein dans du formaldéhyde à 1 % dans du PB (mélange 1:36 de formaldéhyde à 37 % et de PB) pendant 3 h, puis le laver avec du PBS à température ambiante pendant 6 h (Figure 1).

4. Appariement de l’indice de réfraction (IR)

1. Préparez CUBIC-R+.
   1. Préparer CUBIC-R en mélangeant 45 % en poids de 2,3-diméthyl-1-phényl-5-pyrazolone/antipyrine et 30 % en poids de nicotinamide (voir le tableau des matières).
   2. Préparer CUBIC-R+ pour l’appariement de l’indice de réfraction (IR) en ajoutant 0,5 v% de N-buthyldiéthanolamine à CUBIC-R en suivant les rapports précédemment publiés ^4,8,9.
2. Effectuez la correspondance RI.
   1. Plongez le rein dans 7 mL de CUBIC-R+ à 50 % (v/v) (mélange 1:1 d’eau et de CUBIC-R+) dans un tube à fond rond de 14 ml en agitant doucement à température ambiante pendant 1 jour. Ensuite, plongez-le dans 7 mL de CUBIC-R+ dans un tube à fond rond de 14 mL en agitant doucement à température ambiante pendant 2 jours⁹ (Figure 1).
      REMARQUE : Bien que le rein flotte à 50 % dans CUBIC-R+ au début de l’appariement IR, il coule et devient transparent dans CUBIC-R+ à la fin du processus (Figure 2D).

5. Acquisition et reconstruction d’images

1. Immergez le rein compatible IR dans un mélange d’huile de silicium (IR = 1,555) et d’huile minérale (IR = 1,467) (55:45) pendant l’acquisition de l’image (IR = 1,51)⁵ (Figure 3).
2. Obtenez des images 3D du rein entier avec un microscope fluorescent personnalisé^{à 9} feuilles de lumière (voir Tableau des matériaux). Collectez toutes les données d’image brutes au format TIFF 16 bits. Visualisez et capturez les images rendues en 3D avec le logiciel d’analyse d’imagerie (Imaris, voir Tableau des matériaux).

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Résultats

En utilisant cette méthode de coloration, les nerfs sympathiques [anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH)] et les artères [anticorps anti-actine α-muscle lisse (αSMA)] dans un rein entier (Figure 4A, B et Vidéo 1) ont été visualisés⁹. Des nerfs sympathiques rénaux anormaux ont également été visualisés après une lésion d’ischémie/reperfusion (IRI)^9,10 (

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Discussion

Le protocole actuel a permis l’imagerie 3D du rein entier de diverses structures telles que les nerfs sympathiques, les canaux collecteurs, les artères, les tubules proximaux et les glomérules 9,10,11. Cette méthode de coloration offrait une observation macroscopique et conduisait à de nouvelles découvertes biologiques, en visualisant l’altération des nerfs sympathiques rénaux après une lésion

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer