כליות שלמות כתמים תלת מימדיים עם CUBIC

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת ניקוי רקמות והכתמה אימונופלואורסצנטית שלמה להדמיית כליות תלת-ממדית (3D). טכניקה זו יכולה להציע פרספקטיבות מקרוסקופיות בפתולוגיה של הכליות, מה שמוביל לתגליות ביולוגיות חדשות.

Abstract

למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית סיפקה מידע רב על מיקרו-מבנה הכליות, היה קשה לדעת את המבנה המדויק של כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, צינורות איסוף, גלומרולי ועצבים סימפתטיים בכליה בשל היעדר מידע תלת מימדי (3D). סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על המשוכה הגדולה הזו. ניתן לנתח תאים מרובים באיבר שלם ברזולוציה של תא בודד על ידי שילוב של ניקוי רקמות וטכניקת הדמיה תלת-ממדית. עם זאת, שיטות תיוג תאים להדמיית איברים שלמים עדיין אינן מפותחות. בפרט, צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים. הפרוטוקול הנוכחי פיתח כתמי כליה של עכברים שלמים להדמיה תלת-ממדית בשיטת ניקוי הרקמות CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה להדמיית מוח/גוף ואנליזה חישובית). הפרוטוקול איפשר לדמיין ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה וגלומרולאומגהליה בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית מנקודת מבט מקיפה. לפיכך, טכניקה זו יכולה להוביל לתגליות חדשות בחקר הכליות על ידי מתן פרספקטיבה מקרוסקופית.

Introduction

הכליה מורכבת מאוכלוסיות תאים שונות. למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית נותנת לנו מידע רב על המיקרו-סביבה של הכליות, יש צורך בהדמיה תלת-ממדית (3D) כדי להבין במדויק את ההצלבה הבין-תאית במהלך התקדמות מחלת הכליות. בעבר, היה צורך לבצע מספר עצום של חתכים סדרתיים ושחזור תמונה עבור הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם¹. עם זאת, שיטה זו דרשה מאמץ רב מדי והיו לה בעיות מבחינת יכולת השכפול.

סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על מכשול^{זה 2,3.} אטימות הרקמות נובעת בעיקר מפיזור וספיגת אור מכיוון שכל איבר מורכב מחומרים שונים, כולל מים, חלבון ושומנים. לפיכך, האסטרטגיה הבסיסית של ניקוי רקמות היא החלפת מים ושומנים ברקמות עם מקדם שבירה (RI) תואם ריאגנטים בעלי תכונות אופטיות זהות לאלה של חלבונים⁴. על מנת לצפות בדגימה שקופה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור שימושית⁵. לוחות אור מאירים את הדגימה השקופה מהצד, ואותות עירור נרכשים דרך העדשה האובייקטיבית הממוקמת במצב אנכי⁶. מיקרוסקופיה זו מקבלת מידע חתך רוחב במטאטא אחד, השונה מהמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית הקונפוקלית או הרב-פוטונית. לכן, הוא יכול לרכוש במהירות z-stack תמונות עם רמה נמוכה של photobleaching.

קוקטיילים ברורים ללא הפרעה של דימות מוח/גוף ואנליזה חישובית (CUBIC) היא אחת משיטות ניקוי הרקמות המאפשרת הדמיה של איברים שלמים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור ^2,7,8. מכתים אימונופלואורסצנטיים מעוקבים ושלמים ממוטבים במחקר הנוכחי כדי לדמיין מבנים תלת-ממדיים של כליות עכברים 9,10,11^. באמצעות שיטת צביעה זו, השינוי בעצבים סימפתטיים כלייתיים הוא הדמיה לאחר פגיעה איסכמיה-reperfusion 9,10 ו glomerulomegaly בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית ¹¹, כמו גם כלי דם, צינוריות פרוקסימליות^, ואיסוף צינורות בכליה שלמה⁹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת טוקיו. כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות. עכברי C57BL/6NJcl זכרים, בני 8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת בעלי חיים וקיבוע כליות

1. בצע קיבוע פרפוזיה לפי השלבים הבאים.
   1. הרדמת העכבר על ידי שאיפת איזופלורן (3%, 2.0 ליטר/דקה) ומתן תוך-צפקי של מדטומידין הידרוכלוריד (0.3 מ"ג/ק"ג), בוטורפנול טרטרט (5 מ"ג/ק"ג) ומידזולם (4 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים).
   2. יש ליטול את החיה עם 20 מ"ל של PBS (pH 7.4) ו-30 מ"ל של 4% PFA בחיץ פוספט (PB) דרך החדר השמאלי של הלב¹².
2. בצעו את קיבוע הטבילה מיד לאחר קיבוע הזלף ודגימת הכליות⁹.
   1. טבלו את הכליה ב-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות נוספות, ואז שטפו אותה עם PBS במשך שעתיים (שלוש פעמים)⁹ (איור 1).
      אזהרה: פורמלדהיד ופרפורמלדהיד הם חומרים מגרים רעילים. טפלו בריאגנטים במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים.

2. דה-קולוריזציה ודליפידציה

1. הכן את CUBIC-L לדה-צביעה ולעדנה המורכבת מ-10 wt% של טריטון X-100 ו-10 wt% של N-buthyldiethanolamine (ראו טבלת חומרים), בעקבות דוחות שפורסמו בעבר ^4,8,9.
2. בצע דה-צביעה והפחתה על-ידי CUBIC-L בהתאם לשלבים הבאים.
   1. טבלו את הכליה הקבועה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-L (תערובת של 1:1 של מים ו-CUBIC-L) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל (ראו טבלת חומרים) עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות (איור 2A). לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם רעידות עדינות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
   2. רענן את CUBIC-L מדי יום במהלך תהליך זה. לאחר תהליך הדה-צביעה וההעדה, שטפו את הכליה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים (שלוש פעמים)⁹ (איור 1). השתמשו בכף חלוקה לטיפול בדגימה (איור 2B).

3. צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה

1. מכינים את המאגרים המכתימים.
   1. הכינו את חיץ הצביעה לנוגדנים ראשוניים על ידי ערבוב של 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.5% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד⁹.
   2. הכינו את מאגר הצביעה לנוגדנים משניים על ידי ערבוב של 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.1% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד⁹.
2. בצע צביעה עם נוגדנים ראשוניים.
   1. Immunostain הכליה הפגועה עם נוגדנים ראשוניים (1:100 או 1:200, ראו טבלת חומרים) במאגר המכתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך 7 ימים.
      הערה: כמות חיץ הכתמים הדרושה לכליה אחת היא 500-600 μL (איור 2C).
   2. שטפו את הכליה ב-0.5% (v/v) Triton X-100 ב-PBS (PBST) בטמפרטורת החדר למשך יום^{אחד 9} (איור 1).
3. בצע צביעה עם נוגדנים משניים.
   1. מכתים את הכליה בנוגדנים משניים (1:100 או 1:200, ראו טבלת חומרים) בחיץ המכתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות למשך 7 ימים. שטפו את הכליה עם PBST בטמפרטורת החדר למשך יום^{אחד 9} (איור 1).
   2. לאחר קיבוע⁹, טבלו את הכליה בפורמלדהיד 1% ב-PB (תערובת של 37% פורמלדהיד ו-PB ביחס של 1:36) למשך 3 שעות, ושטפו אותה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות (איור 1).

4. התאמת מקדם שבירה (RI)

1. הכן CUBIC-R+.
   1. הכינו את CUBIC-R על ידי ערבוב של 45 wt% של 2,3-דימתיל-1-פניל-5-פיראזולון/אנטיפירין ו-30 wt% של ניקוטין-אמיד (ראו טבלת חומרים).
   2. הכן את CUBIC-R+ להתאמת מקדם השבירה (RI) על ידי הוספת 0.5 v% של N-buthyldiethanolamine ל- CUBIC-R בעקבות הדוחות שפורסמו בעבר ^4,8,9.
2. בצע את התאמת ה- RI.
   1. יש לטבול את הכליה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-R+ (תערובת של 1:1 של מים ו-CUBIC-R+) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-R+ בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יומיים⁹ (איור 1).
      הערה: למרות שהכליה צפה ב-50% CUBIC-R+ בתחילת התאמת ה-RI, היא שוקעת והופכת לשקופה ב-CUBIC-R+ בסוף התהליך (איור 2D).

5. רכישת תמונה ושחזורה

1. טבלו את הכליה התואמת ל-RI בתערובת של שמן סיליקון (RI = 1.555) ושמן מינרלי (RI = 1.467) (55:45) במהלך רכישת התמונה (RI = 1.51)⁵ (איור 3).
2. קבל תמונות תלת-ממדיות של הכליה כולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי^{בעל 9} יריעות אור שנבנה בהתאמה אישית (ראו טבלת חומרים). אסוף את כל נתוני התמונה הגולמיים בתבנית TIFF של 16 סיביות. הצג באופן חזותי ולכוד את התמונות המעובדות בתלת-ממד באמצעות תוכנת ניתוח ההדמיה (Imaris, ראה טבלת חומרים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות שיטת הכתמים הזו,^הודגמו עצבים סימפתטיים [נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH)] ועורקים [נוגדן אקטין נגד α שריר חלק (αSMA)] בכליה שלמה (איור 4A,B ווידאו 1). עצבים סימפתטיים כלייתיים חריגים הודגמו גם לאחר פגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה (IRI)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי איפשר הדמיה תלת-ממדית של כליות שלמות של מבנים שונים כגון עצבים סימפתטיים, צינורות איסוף, עורקים, צינוריות פרוקסימליות וגלומרולי 9,10,11^. שיטת צביעה זו הציעה תצפית מקרוסקופית והובילה לתגליות ביולוגיות חדשות, על ידי הדמיה של ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer