CUBICによる全腎三次元染色

要約

本プロトコルは、3次元(3D)腎臓イメージングのための組織透明化法およびホールマウント免疫蛍光染色を記載する。この技術は、腎臓病理学における巨視的な視点を提供し、新しい生物学的発見につながる可能性があります。

要約

従来の病理では腎臓の微細構造に関する情報が数多くありましたが、腎臓の血管、近位尿細管、集合管、糸球体、交感神経の正確な構造を知ることは、3次元(3D)情報が不足しているため困難でした。光学クリアリングは、この大きなハードルを克服するための優れた戦略です。組織クリアリングと3Dイメージング技術を組み合わせることで、臓器全体の複数の細胞を単一細胞分解能で解析できます。しかし、全臓器イメージングのための細胞標識法は未開発のままです。特に、ホールマウント臓器染色は抗体の浸透が難しいため困難です。本プロトコルは、CUBIC(透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析)組織クリアリング法による3Dイメージング用のホールマウントマウス腎臓染色を開発しました。糖尿病性腎疾患の早期における虚血再灌流障害後の腎交感神経除神経や糸球体腫大を総合的に可視化することが可能となりました。したがって、この技術は、巨視的な視点を提供することにより、腎臓研究における新しい発見につながる可能性があります。

概要

腎臓はさまざまな細胞集団で構成されています。従来の病理では腎臓の微小環境に関する多くの情報が得られますが、腎臓病進行時の細胞間クロストークを正確に理解するためには、3次元(3D)イメージングが必要です。従来、臓器全体の3Dイメージングには膨大な数の連続切片作成と画像再構成が必要でした¹。しかし、この方法は手間がかかりすぎて再現性に問題がありました。

光学クリアリングは、このハードル^2,3を克服するための優れた戦略です。組織の不透明度は、各臓器が水、タンパク質、脂質などのさまざまな物質で構成されているため、主に光の散乱と吸収によるものです。したがって、組織透明化の基本的な戦略は、組織内の水と脂質を、タンパク質⁴と同じ光学特性を持つ屈折率(RI)マッチング試薬に置き換えることです。透明な標本を観察するためには、ライトシート蛍光顕微鏡が有用である⁵。ライトシートは透明な試料を側面から照らし、励起信号は垂直位置⁶にある対物レンズを通して取得される。この顕微鏡は、共焦点または多光子蛍光顕微鏡とは異なる、単一のスイープで断面情報を取得します。したがって、低レベルの光退色でzスタック画像をすばやく取得できます。

透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析(CUBIC)は、ライトシート蛍光顕微鏡による全臓器イメージングを可能にする組織クリアリング方法の1つです^2,7,8。CUBICおよびホールマウント免疫蛍光染色は、マウス腎臓の3D構造を視覚化するために本研究で最適化されています⁹、^10、11。このホールマウント染色法を用いて、糖尿病性腎疾患¹¹の早期虚血再灌流障害^9,10および糸球体腫大後の腎交感神経の変化、ならびに腎臓全体の血管、近位尿細管、および集合管^{の変化を可視化します9}。

プロトコル

すべての実験は東京大学治験審査委員会の承認を受けました。すべての動物の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。8週齢の雄C57BL/6NJclマウスを本研究に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。

1.動物の準備と腎臓の固定

1. 以下の手順に従って灌流固定を行います。
   1. イソフルラン(3%、2.0 L / min)の吸入と塩酸メデトミジン(0.3 mg / kg)、酒石酸ブトルファノール(5 mg / kg)、およびミダゾラム(4 mg / kg)の腹腔内投与によってマウスを麻酔します( 材料の表を参照)。.
   2. 心臓¹²の左心室を通して、20mLのPBS(pH7.4)およびリン酸緩衝液(PB)中の30mLの4%PFAで動物に灌流する。
2. 灌流固定と腎臓サンプリングの直後に浸漬固定を行う⁹.
   1. 腎臓を4%PFAに4°Cでさらに16時間浸した後、PBSで2時間(3回)洗浄します⁹ (図1)。
      注意: ホルムアルデヒドとパラホルムアルデヒドは有毒な刺激物です。適切な個人用保護具を備えたヒュームフード内の試薬を取り扱ってください。

2.脱色と脱脂

1. 以前に発表された報告^4,8,9に従って、10重量%のTriton X-100と10重量%のN-ブチルジエタノールアミンからなる脱色および脱脂質化用のCUBIC-Lを調製します(材料の表を参照)。
2. CUBIC-Lによる脱色・脱脂は以下の手順で行ってください。
   1. 固定した腎臓を7 mLの50%(v / v)CUBIC-L(水とCUBIC-Lの1:1混合物)に14 mLの丸底チューブ( 材料の表を参照)に浸し、室温で6時間穏やかに振とうします(図2A)。その後、14mLの丸底チューブに7mLのCUBIC-Lを浸漬し、37°Cで5日間穏やかに振とうします。
   2. このプロセス中は、CUBIC-Lを毎日更新してください。脱色および脱脂プロセスの後、腎臓をPBSで室温で2時間(3回)洗浄します⁹ (図1)。サンプルの取り扱いにはディスペンシングスプーンを使用してください(図2B)。

3. ホールマウント免疫蛍光染色

1. 染色バッファーを準備します。
   1. 0.5%(v/v)のTriton X-100、PBS中の0.5%カゼイン、および0.05%アジ化ナトリウムを混合することにより、一次抗体用の染色バッファー^{を調製します9}。
   2. 0.5%(v/v)のTriton X-100、0.1%のカゼインをPBSに、0.05%のアジ化ナトリウムを混合して、二次抗体用の染色バッファーを調製します⁹。
2. 一次抗体による染色を行います。
   1. 脱脂質化した腎臓を一次抗体(1:100または1:200、 材料の表を参照)で染色バッファー中で37°Cで7日間穏やかに振とうしながら免疫染色します。
      注:1つの腎臓に必要な染色バッファーの量は500〜600μLです(図2C)。
   2. PBS(PBST)中の0.5%(v / v)トリトンX-100で腎臓を室温で1日間^{洗浄します} 9(図1)。
3. 二次抗体による染色を行います。
   1. 腎臓を二次抗体(1:100または1:200、 材料表を参照)で染色バッファー中で37°C、7日間穏やかに振とうしながら免疫染色します。腎臓をPBSTで室温で1日間洗浄します⁹ (図1)。
   2. 固定^後9、腎臓をPB中の1%ホルムアルデヒド(37%ホルムアルデヒドとPBの1:36混合物)に3時間浸し、PBSで室温で6時間洗浄します(図1)。

4. 屈折率(RI)マッチング

1. キュービックR+を準備します。
   1. 45重量%の2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン/アンチピリンと30重量%のニコチンアミドを混合してCUBIC-Rを調製します(材料の表を参照)。
   2. 以前に発表されたレポート^4,8,9に従って、0.5 v%のN-ブチルジエタノールアミンをCUBIC-Rに添加することにより、屈折率(RI)マッチング用のCUBIC-R+を準備します。
2. RI マッチングを実行します。
   1. 腎臓を7 mLの50%(v / v)CUBIC-R +(水とCUBIC-R +の1:1混合物)に14 mLの丸底チューブに浸し、室温で1日間穏やかに振とうします。.次に、室温で^{2日間穏やか} に振とうしながら、14 mLの丸底チューブ内の7 mLのCUBIC-R+に浸します9(図1)。
      注:腎臓はRIマッチングの開始時に50%CUBIC-R +で浮遊しますが、プロセスの最後に沈み、CUBIC-R +で透明になります(図2D)。

5. 画像の取得と再構成

1. 画像取得中(RI = 1.51)⁵ (図3)中に、RIに整合した腎臓をシリコンオイル(RI = 1.555)とミネラルオイル(RI = 1.467)の混合物に浸します(55:45)。
2. 特注の⁹ ライトシート蛍光顕微鏡で腎臓全体の3D画像を取得します( 材料表を参照)。すべての生の画像データを16ビットTIFF形式で収集します。イメージング解析ソフトウェア(Imaris、 材料表を参照)を使用して、3Dレンダリングされた画像を視覚化およびキャプチャします。

結果

この染色法を用いて、腎臓全体の交感神経[抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体]および動脈[抗α平滑筋アクチン(αSMA)抗体](図4A、Bおよびビデオ1)を可視化^{しました9。}虚血/再灌流障害(IRI^)後の異常な腎交感神経も可視化されました^9,10(図4C)。さらに、脾臓

ディスカッション

本プロトコルにより、交感神経、集合管、動脈、近位尿細管、糸球体などのさまざまな構造の腎臓全体の3Dイメージングが可能になりました⁹、^10、11。この染色法は、糖尿病性腎疾患¹¹の虚血再灌流障害後の腎交感神経の変化を可視化し、新たな生物学的発見をもたらした。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer