Colorazione tridimensionale a rene intero con CUBIC

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo di pulizia dei tessuti e una colorazione immunofluorescente a montaggio intero per l'imaging renale tridimensionale (3D). Questa tecnica può offrire prospettive macroscopiche nella patologia renale, portando a nuove scoperte biologiche.

Abstract

Sebbene la patologia convenzionale fornisse numerose informazioni sulla microstruttura renale, era difficile conoscere la struttura precisa dei vasi sanguigni, dei tubuli prossimali, dei dotti collettivi, dei glomeruli e dei nervi simpatici nel rene a causa della mancanza di informazioni tridimensionali (3D). La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo grande ostacolo. Più cellule in un intero organo possono essere analizzate alla risoluzione di una singola cellula combinando la pulizia dei tessuti e la tecnica di imaging 3D. Tuttavia, i metodi di etichettatura cellulare per l'imaging dell'intero organo rimangono sottosviluppati. In particolare, la colorazione dell'intero organo è difficile a causa della difficoltà nella penetrazione degli anticorpi. Il presente protocollo ha sviluppato una colorazione renale di topo a montaggio intero per l'imaging 3D con il metodo di pulizia dei tessuti CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Il protocollo ha permesso di visualizzare la denervazione simpatica renale dopo danno da ischemia-riperfusione e glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica da un punto di vista completo. Pertanto, questa tecnica può portare a nuove scoperte nella ricerca sui reni fornendo una prospettiva macroscopica.

Introduzione

Il rene è composto da varie popolazioni cellulari. Sebbene la patologia convenzionale ci fornisca molte informazioni sul microambiente renale, è necessaria l'imaging tridimensionale (3D) per comprendere con precisione la diafonia intercellulare durante la progressione della malattia renale. In passato, era necessario eseguire un numero enorme di sezionamenti seriali e ricostruzione delle immagini per l'imaging 3D dell'intero organo¹. Tuttavia, questo metodo richiedeva troppo sforzo e presentava problemi in termini di riproducibilità.

La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo ostacolo

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Tokyo. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida del National Institutes of Health. Topi maschi C57BL / 6NJcl, di 8 settimane, sono stati utilizzati per il presente studio. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione animale e fissazione dei reni

1. Eseguire la fissazione della perfusione seguendo i passaggi seguenti.
   1. Anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano (3%, 2,0 L/min) e somministrazione intraperitoneale....

Risultati

Utilizzando questo metodo di colorazione, sono stati visualizzati i nervi simpatici [anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH)] e le arterie [anticorpo anti-α-actina del muscolo liscio (αSMA)] in un rene intero (Figura 4A, B e Video 1). Sono stati visualizzati anche nervi simpatici renali anomali dopo ischemia/danno da riperfusione (IRI)^9,10 (Figura 4C

Discussione

Il presente protocollo ha permesso l'imaging 3D dell'intero rene di varie strutture come nervi simpatici, dotti collettivi, arterie, tubuli prossimali e glomeruli 9,10,11. Questo metodo di colorazione ha offerto un'osservazione macroscopica e ha portato a nuove scoperte biologiche, visualizzando l'alterazione dei nervi simpatici renali dopo danno da ischemia-riperfusione ^9,10 e glomerulomegalia.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer