Трехмерное окрашивание цельной почки с помощью CUBIC

Резюме

Настоящий протокол описывает метод очистки тканей и полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание для трехмерной (3D) визуализации почек. Этот метод может предложить макроскопические перспективы в патологии почек, что приводит к новым биологическим открытиям.

Аннотация

Хотя обычная патология предоставляла многочисленные сведения о микроструктуре почек, было трудно узнать точную структуру кровеносных сосудов, проксимальных канальцев, собирающих протоков, клубочков и симпатических нервов в почках из-за отсутствия трехмерной (3D) информации. Оптическая очистка является хорошей стратегией для преодоления этого большого препятствия. Несколько клеток в целом органе могут быть проанализированы с одноклеточным разрешением, сочетая очистку тканей и технику 3D-визуализации. Тем не менее, методы маркировки клеток для визуализации всего органа остаются недостаточно развитыми. В частности, окрашивание целых органов является сложной задачей из-за сложности проникновения антител. Настоящий протокол разработал окрашивание почек мыши для 3D-визуализации с помощью метода очистки тканей CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis). Протокол позволил визуализировать почечную симпатическую денервацию после ишемии-реперфузионного повреждения и гломеруломегалию на ранней стадии диабетической болезни почек с комплексной точки зрения. Таким образом, этот метод может привести к новым открытиям в исследованиях почек, обеспечивая макроскопическую перспективу.

Введение

Почка состоит из различных клеточных популяций. Хотя обычная патология дает нам много информации о микроокружении почек, трехмерная (3D) визуализация необходима для точного понимания межклеточных перекрестных помех во время прогрессирования заболевания почек. В прошлом для 3D-визуализации всего органа¹ требовалось выполнить огромное количество серийных секций и реконструкций изображений. Однако этот метод требовал слишком больших усилий и имел проблемы с точки зрения воспроизводимости.

Оптический клиринг является хорошей стратегией для преодоления этого препятствия ^2,3. Помутнение тканей в основном связано с рассеянием и поглощением света, потому что каждый орган состоит из различных веществ, включая воду, белок и липиды. Таким образом, основной стратегией очистки тканей является замена воды и липидов в тканях реагентами, соответствующими показателю преломления (RI), которые обладают теми же оптическими свойствами, что и белки⁴. Для того чтобы наблюдать прозрачный образец, полезна световая листовая флуоресцентная микроскопия⁵. Световые листы освещают прозрачный образец сбоку, а сигналы возбуждения принимаются через объектив, расположенный в вертикальном положении⁶. Эта микроскопия получает информацию о поперечном сечении за один развертку, которая отличается от конфокальной или многофотонной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, он может быстро получать z-стековые изображения с низким уровнем фотоотбеливания.

Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) является одним из методов очистки тканей, который позволяет визуализировать весь орган с помощью флуоресцентной микроскопии^{светового} листа ^2,7,8. CUBIC и цельное иммунофлуоресцентное окрашивание оптимизированы в настоящем исследовании для визуализации 3D-структур почек мыши ^9,10,11. С помощью этого цельно-монтажного метода окрашивания визуализируется изменение почечных симпатических нервов после ишемии-реперфузионного повреждения ^9,10 и клубомерулегалии на ранней стадии диабетической болезни почек¹¹, а также кровеносных сосудов, проксимальных канальцев и собирающих протоков во всей почке⁹.

протокол

Все эксперименты были одобрены Советом по институциональному обзору Токийского университета. Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения. Для настоящего исследования использовались самцы мышей C57BL/6NJcl в возрасте 8 недель. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка животных и фиксация почек

1. Выполните фиксацию перфузии, выполнив следующие действия.
   1. Обезболивают мышь путем вдыхания изофлурана (3%, 2,0 л/мин) и внутрибрюшинного введения медетомидина гидрохлорида (0,3 мг/кг), тартрата буторфанола (5 мг/кг) и мидазолама (4 мг/кг) (см. Таблицу материалов).
   2. Перфузируйте животное 20 мл PBS (рН 7,4) и 30 мл 4% PFA в фосфатном буфере (PB) через левый желудочек сердца¹².
2. Выполните фиксацию погружения сразу после фиксации перфузии и забора проб почек⁹.
   1. Погрузите почку в 4% PFA при 4 °C еще на 16 ч, затем промыть ее PBS в течение 2 ч (три раза)⁹ (рисунок 1).
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид и параформальдегид являются токсичными раздражителями. Обращайтесь с реагентами в вытяжном шкафу с соответствующими средствами индивидуальной защиты.

2. Обесцвечивание и делипидирование

1. Готовят CUBIC-L для обесцвечивания и делипидирования, состоящие из 10 мас.% тритона X-100 и 10 мас.% N-бутгилдиэтаноламина (см. Таблицу материалов), следуя ранее опубликованным отчетам ^4,8,9.
2. Выполните обесцвечивание и делипидацию CUBIC-L, выполнив следующие действия.
   1. Погрузить неподвижную почку в 7 мл 50% (v/v) CUBIC-L (смесь воды 1:1 и CUBIC-L) в трубку круглого дна объемом 14 мл (см. Таблицу материалов) с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 6 ч (рисунок 2A). Затем погрузите его в 7 мл CUBIC-L в трубку круглого дна объемом 14 мл с легким встряхиванием при 37 °C в течение 5 дней.
   2. Обновляйте CUBIC-L каждый день во время этого процесса. После процесса обесцвечивания и делипидации промыть почки ПБС комнатной температурой в течение 2 ч (трижды)⁹ (фиг.1). Используйте дозирующую ложку для обработки проб (рисунок 2B).

3. Цельное иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Подготовьте буферы окрашивания.
   1. Подготовьте окрашивающий буфер для первичных антител путем смешивания 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% казеина в PBS и 0,05% азида натрия⁹.
   2. Подготовьте буфер окрашивания для вторичных антител путем смешивания 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% казеина в PBS и 0,05% азида натрия⁹.
2. Выполняют окрашивание первичными антителами.
   1. Иммуноокрашить делипидированную почку первичными антителами (1:100 или 1:200, см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере при 37 °C с легким встряхиванием в течение 7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество окрашивающего буфера, необходимого для одной почки, составляет 500-600 мкл (рисунок 2C).
   2. Промыть почки 0,5% (v/v) Тритон Х-100 в PBS (PBST) при комнатной температуре в течение 1 дня⁹ (Фиг.1).
3. Выполняют окрашивание вторичными антителами.
   1. Иммуноокрашить почку вторичными антителами (1:100 или 1:200, см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере при 37 °C с легким встряхиванием в течение 7 дней. Промыть почки ПБСТ при комнатной температуре в течение 1 дня⁹ (рисунок 1).
   2. После фиксации⁹ погружают почку в 1% формальдегид в ПБ (смесь 1:36 37% формальдегида и ПБ) в течение 3 ч, и промывают ее ПБС при комнатной температуре в течение 6 ч (рисунок 1).

4. Сопоставление показателя преломления (RI)

1. Приготовьте CUBIC-R+.
   1. Получают CUBIC-R путем смешивания 45 мас.% 2,3-диметил-1-фенил-5-пиразолона/антипирина и 30 мас.% никотинамида (см. Таблицу материалов).
   2. Подготовьте CUBIC-R+ для сопоставления показателя преломления (RI), добавив 0,5 V% N-бутилдиэтаноламина в CUBIC-R после ранее опубликованных отчетов ^4,8,9.
2. Выполните сопоставление RI.
   1. Погрузить почку в 7 мл 50% (v/v) CUBIC-R+ (смесь воды 1:1 и CUBIC-R+) в трубку круглого дна объемом 14 мл с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 дня. Затем погрузите его в 7 мл CUBIC-R+ в 14 мл круглодонной трубки с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 2 дней⁹ (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя почка плавает в 50% CUBIC-R+ в начале сопоставления RI, она опускается и становится прозрачной в CUBIC-R+ в конце процесса (рисунок 2D).

5. Получение и реконструкция изображений

1. Погружайте RI-согласованную почку в смесь кремниевого масла (RI = 1,555) и минерального масла (RI = 1,467) (55: 45) во время получения изображения (RI = 1,51)⁵ (Рисунок 3).
2. Получайте 3D-изображения всей почки с помощью люминесцентного микроскопа на⁹ световых листов (см. Таблицу материалов). Соберите все необработанные данные изображения в 16-битном формате TIFF. Визуализируйте и захватывайте 3D-изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Imaris, см. Таблицу материалов).

Результаты

Используя этот метод окрашивания, симпатические нервы [антитирозингидроксилазное (TH) антитело] и артерии [антитело против α гладкомышечных актинов (αSMA)] во всей почке (Рисунок 4A, B и Видео 1) были визуализированы⁹. Аномальные почечные симпат?...

Обсуждение

Настоящий протокол позволял проводить 3D-визуализацию всей почки различных структур, таких как симпатические нервы, собирающие протоки, артерии, проксимальные канальцы и клубочки ^9,10,11. Этот метод окрашивания предложил макроскопическо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer