Coloração tridimensional de rim inteiro com CUBIC

Resumo

O presente protocolo descreve um método de clareamento tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa para imagens renais tridimensionais (3D). Esta técnica pode oferecer perspectivas macroscópicas na patologia renal, levando a novas descobertas biológicas.

Resumo

Embora a patologia convencional fornecesse inúmeras informações sobre a microestrutura renal, era difícil saber a estrutura precisa dos vasos sanguíneos, túbulos proximais, ductos coletores, glomérulos e nervos simpáticos no rim devido à falta de informações tridimensionais (3D). A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse grande obstáculo. Múltiplas células em um órgão inteiro podem ser analisadas em resolução de célula única, combinando limpeza de tecido e técnica de imagem 3D. No entanto, os métodos de marcação celular para imagens de órgãos inteiros permanecem subdesenvolvidos. Em particular, a coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. O presente protocolo desenvolveu uma coloração renal de camundongo de montagem completa para imagens 3D com o método de clareamento tecidual CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). O protocolo possibilitou visualizar a denervação simpática renal após lesão de isquemia-reperfusão e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética de um ponto de vista abrangente. Assim, esta técnica pode levar a novas descobertas na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica.

Introdução

O rim é composto por várias populações celulares. Embora a patologia convencional nos dê muita informação sobre o microambiente renal, a imagem tridimensional (3D) é necessária para entender com precisão o crosstalk intercelular durante a progressão da doença renal. No passado, um grande número de cortes seriados e reconstrução de imagens precisava ser realizado para a imagem 3D de todo o órgão¹. No entanto, este método exigiu muito esforço e teve problemas em termos de reprodutibilidade.

A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse obstáculo ^2,3. A opacidade tecidual é principalmente devido à dispersão e absorção de luz, porque cada órgão consiste em várias substâncias, incluindo água, proteínas e lipídios. Assim, a estratégia básica de clareamento tecidual é a substituição de água e lipídios nos tecidos por reagentes correspondentes ao índice de refração (IR) que possuem as mesmas propriedades ópticas que as proteínas⁴. Para observar um espécime transparente, uma microscopia fluorescente de folha de luz é útil⁵. As folhas de luz iluminam a amostra transparente de lado, e os sinais de excitação são adquiridos através da lente objetiva localizada em uma posição vertical⁶. Esta microscopia obtém informações de seção transversal em uma única varredura, que é diferente da microscopia fluorescente confocal ou multifóton. Assim, ele pode adquirir rapidamente imagens z-stack com um baixo nível de fotobranqueamento.

Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) é um dos métodos de clareamento tecidual que permite a imagem de órgãos inteiros por microscopia fluorescente de folha de luz ^2,7,8. A coloração CUBIC e imunofluorescente de montagem completa são otimizadas no presente estudo para visualizar estruturas 3D renais de camundongos 9,10,11. Utilizando esse método de coloração de montagem completa, a alteração nos nervos simpáticos renais é visualizada após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética ¹¹, bem como vasos sanguíneos^, túbulos proximais e ductos coletores em um rim inteiro⁹.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Tóquio. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health. Camundongos machos C57BL/6NJcl, com 8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação animal e fixação renal

1. Realize a fixação de perfusão seguindo os passos abaixo.
   1. Anestesiar o rato por inalação de isoflurano (3%, 2,0 L/min) e administração intraperitoneal de cloridrato de medetomidina (0,3 mg/kg), tartarato de butorfanol (5 mg/kg) e midazolam (4 mg/kg) (ver Tabela de Materiais).
   2. Perfundir o animal com 20 mL de PBS (pH 7,4) e 30 mL de PFA a 4% em tampão fosfato (PB) através do ventrículo esquerdo do coração¹².
2. Realizar a fixação da imersão logo após a fixação da perfusão e amostragem renal⁹.
   1. Imergir o rim em PFA a 4% a 4 °C por mais 16 h e, em seguida, lavá-lo com PBS por 2 h (três vezes)⁹ (Figura 1).
      CUIDADO: Formaldeído e paraformaldeído são irritantes tóxicos. Manuseie os reagentes em um exaustor com equipamento de proteção individual apropriado.

2. Descoloração e deslipidação

1. Preparar CUBIC-L para descoloração e deslipidação consistindo de 10% em peso de Triton X-100 e 10% em peso de N-butildietanolamina (ver Tabela de Materiais), seguindo relatórios publicados anteriormente ^4,8,9.
2. Realizar a descoloração e deslipidação por CUBIC-L seguindo os passos abaixo.
   1. Imergir o rim fixo em 7 mL de 50% (v/v) CUBIC-L (mistura 1:1 de água e CUBIC-L) em um tubo de fundo redondo de 14 mL (ver Tabela de Materiais) com agitação suave à temperatura ambiente por 6 h (Figura 2A). Em seguida, mergulhe-o em 7 mL de CUBIC-L em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave a 37 °C por 5 dias.
   2. Atualize o CUBIC-L todos os dias durante este processo. Após o processo de descoloração e deslipidação, lavar o rim com PBS em temperatura ambiente por 2 h (três vezes)⁹ (Figura 1). Use uma colher dispensadora para o manuseio da amostra (Figura 2B).

3. Coloração imunofluorescente de montagem completa

1. Prepare os amortecedores de coloração.
   1. Preparar o tampão de coloração para anticorpos primários misturando 0,5% (v/v) de Triton X-100, 0,5% de caseína em PBS e 0,05% de azida de sódio⁹.
   2. Prepare o tampão de coloração para anticorpos secundários misturando 0,5% (v/v) de Triton X-100, 0,1% de caseína em PBS e 0,05% de azida de sódio⁹.
2. Realizar coloração com anticorpos primários.
   1. Imunocorar o rim deslipidado com anticorpos primários (1:100 ou 1:200, ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração a 37 °C com agitação suave durante 7 dias.
      NOTA: A quantidade do tampão de coloração necessário para um rim é de 500-600 μL (Figura 2C).
   2. Lavar o rim com Triton X-100 a 0,5% (v/v) em PBS (PBST) à temperatura ambiente por 1 dia⁹ (Figura 1).
3. Realizar coloração com anticorpos secundários.
   1. Imunocorar o rim com anticorpos secundários (1:100 ou 1:200, ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração a 37 °C com agitação suave durante 7 dias. Lavar o rim com PBST à temperatura ambiente por 1 dia⁹ (Figura 1).
   2. Após a fixação⁹, imergir o rim em formaldeído a 1% em PB (mistura 1:36 de formaldeído a 37% e PB) por 3 h, e lavá-lo com PBS à temperatura ambiente por 6 h (Figura 1).

4. Correspondência do índice de refração (IR)

1. Prepare CUBIC-R+.
   1. Preparar CUBIC-R misturando 45 % em peso de 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolona/antipirina e 30 % em peso de nicotinamida (ver Tabela de Materiais).
   2. Preparar CUBIC-R+ para correspondência de índice de refração (IR) adicionando 0,5 v% de N-butildietanolamina ao CUBIC-R seguindo os relatórios publicados anteriormente ^4,8,9.
2. Execute a correspondência do RI.
   1. Mergulhe o rim em 7 mL de 50% (v/v) CUBIC-R+ (mistura 1:1 de água e CUBIC-R+) em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave à temperatura ambiente por 1 dia. Em seguida, mergulhe-o em 7 mL de CUBIC-R+ em um tubo de fundo redondo de 14 mL com agitação suave à temperatura ambiente por 2 dias⁹ (Figura 1).
      NOTA: Embora o rim flutue em 50% de CUBIC-R+ no início da correspondência do IR, ele afunda e se torna transparente no CUBIC-R+ no final do processo (Figura 2D).

5. Aquisição e reconstrução de imagens

1. Imergir o rim compatível com IR em uma mistura de óleo de silício (IR = 1,555) e óleo mineral (IR = 1,467) (55:45) durante a aquisição da imagem (IR = 1,51)⁵ (Figura 3).
2. Adquira imagens 3D de todo o rim com um microscópio fluorescente de⁹ folhas de luz personalizado (consulte Tabela de materiais). Colete todos os dados brutos da imagem em um formato TIFF de 16 bits. Visualize e capture as imagens renderizadas em 3D com o software de análise de imagem (Imaris, consulte Tabela de Materiais).

Resultados

Utilizando esse método de coloração, foram visualizados nervos simpáticos [anticorpo antitirosina hidroxilase (TH)] e artérias [anticorpo anti-actina do músculo liso (αSMA) anti-α] em um rim inteiro (Figura 4A,B e Vídeo 1)⁹. Nervos simpáticos renais anormais também foram visualizados após lesão de isquemia/reperfusão (IRA)^9,10 (Figura 4C

Discussão

O presente protocolo permitiu a imagem 3D de todo o rim de várias estruturas, como nervos simpáticos, ductos coletores, artérias, túbulos proximais e glomérulos 9,10,11. Esse método de coloração ofereceu observação macroscópica e levou a novas descobertas biológicas, visualizando a alteração dos nervos simpáticos renais após lesão de isquemia-reperfusão ^9,10 e glomerulomegalia...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer