CUBIC 전체 신장 3차원 염색

요약

본 프로토콜은 3차원(3D) 신장 영상을 위한 조직 투명화 방법 및 전체-마운트 면역형광 염색을 기술한다. 이 기술은 신장 병리학에서 거시적 관점을 제공하여 새로운 생물학적 발견으로 이어질 수 있습니다.

초록

기존의 병리학은 신장 미세 구조에 대한 많은 정보를 제공했지만 3차원(3D) 정보가 부족하여 신장의 혈관, 근위 세뇨관, 수집 관, 사구체 및 교감 신경의 정확한 구조를 알기가 어려웠습니다. 광학 클리어링은 이 큰 장애물을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 전체 장기의 여러 세포는 조직 투명화와 3D 이미징 기술을 결합하여 단일 세포 분해능으로 분석할 수 있습니다. 그러나 전체 장기 이미징을위한 세포 표지 방법은 아직 개발되지 않았습니다. 특히, 전체 장착 장기 염색은 항체 침투의 어려움 때문에 어렵습니다. 본 프로토콜은 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌 / 신체 이미징 칵테일 및 전산 분석) 조직 투명화 방법을 사용하여 3D 이미징을위한 전체 마운트 마우스 신장 염색을 개발했습니다. 이 프로토콜은 포괄적 인 관점에서 당뇨병 성 신장 질환의 초기 단계에서 허혈 재관류 손상 및 사구체 비대 후 신장 교감 신경 탈신경을 시각화 할 수있게했습니다. 따라서이 기술은 거시적 관점을 제공함으로써 신장 연구에서 새로운 발견으로 이어질 수 있습니다.

서문

신장은 다양한 세포 집단으로 구성됩니다. 기존의 병리학은 신장 미세 환경에 대한 많은 정보를 제공하지만 신장 질환 진행 중 세포 간 누화를 정확하게 이해하려면 3차원(3D) 영상이 필요합니다. 과거에는 전체 장기 3D 이미징¹을 위해 수많은 연속 절단 및 이미지 재구성을 수행해야 했습니다. 그러나이 방법은 너무 많은 노력이 필요하고 재현성 측면에서 문제가있었습니다.

광학 클리어링은 이 장애물 ^2,3을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 조직 불투명도는 각 기관이 물, 단백질 및 지질을 포함한 다양한 물질로 구성되어 있기 때문에 주로 광산란 및 흡수로 인한 것입니다. 따라서 조직 청소의 기본 전략은 조직의 물과 지질을 단백질⁴와 동일한 광학적 특성을 갖는 굴절률(RI) 일치 시약으로 대체하는 것입니다. 투명한 시편을 관찰하기 위해서는, 라이트 시트 형광 현미경^{이 유용하다}5. 라이트 시트는 측면에서 투명한 시편을 비추고 여기 신호는 수직 위치⁶에 위치한 대물 렌즈를 통해 획득됩니다. 이 현미경은 단일 스윕으로 단면 정보를 얻으며, 이는 컨포칼 또는 다광자 형광 현미경과 다릅니다. 따라서 낮은 수준의 광퇴색으로 z 스택 이미지를 빠르게 획득할 수 있습니다.

투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 영상 칵테일 및 전산 분석(CUBIC)은 광학 시트 형광 현미경 ^2,7,8로 전체 장기 이미징을 가능하게 하는 조직 투명화 방법 중 하나입니다. CUBIC 및 전체 장착 면역형광 염색은 마우스 신장 3D 구조 9,10,11을 시각화하기 위해 본 연구에서 최적화되었습니다. 이 전체 장착 염색 방법을 사용하여 허혈 재관류 손상 9,10 및 당뇨병 성 신장 질환 ¹¹의 초기 단계의 사구체 비대뿐만 아니라 혈관^, 근위 세뇨관 및 전체 신장 ⁹의 수집 덕트 후에 신장 교감 신경의 변화를 시각화합니다.

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프로토콜

모든 실험은 도쿄 대학 기관 검토위원회의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 국립 보건원 지침에 따라 수행되었습니다. 8주령의 수컷 C57BL/6NJcl 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조).

1. 동물 준비 및 신장 고정

1. 아래 단계에 따라 관류 고정을 수행하십시오.
   1. 이소플루란(3%, 2.0L/min)을 흡입하고 메데토미딘 염산염(0.3mg/kg), 부토르파놀 타르트레이트(5mg/kg) 및 미다졸람(4mg/kg)을 복강내 투여하여 마우스를 마취시킵니다( 재료 표 참조).
   2. 동물을 20mL의 PBS(pH 7.4) 및 30mL의 4% PFA로 인산염 완충액(PB)으로 관류시킨다(¹²).
2. 관류 고정 직후 침지 고정을 수행하고 신장 샘플링⁹.
   1. 신장을 4°C에서 4% PFA에 16시간 더 담근 다음 PBS로 2시간(3회)⁹ 동안 세척합니다(그림 1).
      주의 : 포름 알데히드와 파라 포름 알데히드는 독성 자극제입니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 흄 후드에서 시약을 취급하십시오.

2. 탈색 및 탈색

1. 이전에 발표 된 보고서 ^4,8,9에 따라 10wt %의 Triton X-100과 10wt %의 N- 부틸 디 에탄올 아민 (재료 표 참조)으로 구성된 탈색 및 탈색을 위해 CUBIC-L을 준비하십시오.
2. 아래 단계에 따라 CUBIC-L에 의한 탈색 및 탈색을 수행하십시오.
   1. 고정된 신장을 14mL 둥근 바닥 튜브(재료 표 참조)에 넣고 7mL의 50%(v/v) CUBIC-L(물과 CUBIC-L의 1:1 혼합물)에 담그고 실온에서 6시간 동안 부드럽게 흔듭니다(그림 2A). 그런 다음 14mL 둥근 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-L에 담그고 37°C에서 5일 동안 부드럽게 흔듭니다.
   2. 이 과정에서 매일 CUBIC-L을 새로 고칩니다. 탈색 및 탈색 과정 후 실온에서 PBS로 신장을 2시간(3회)⁹ 세척합니다(그림 1). 시료 취급을 위해 분주 스푼을 사용하십시오(그림 2B).

3. 전체 마운트 면역 형광 염색

1. 염색 완충액을 준비한다.
   1. PBS에 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.5% 카제인, 0.05% 아지드화나트륨⁹를 혼합하여 1차 항체용 염색 완충액을 준비합니다.
   2. PBS에 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.1% 카제인, 0.05% 아지드화나트륨⁹를 혼합하여 2차 항체용 염색 완충액을 준비합니다.
2. 1 차 항체로 염색을 수행하십시오.
   1. 37°C에서 염색 완충액에서 1차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 지질된 신장을 면역염색하고 7일 동안 부드럽게 흔들었다.
      참고: 한 신장에 필요한 염색 완충액의 양은 500-600 μL입니다(그림 2C).
   2. 신장을 PBS(PBST)의 0.5%(v/v) 트리톤 X-100으로 실온에서^{1일 동안} 세척합니다(그림 1).
3. 2 차 항체로 염색을 수행하십시오.
   1. 37°C에서 염색 완충액에서 2차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 신장을 면역염색하고 7일 동안 부드럽게 흔들었다. 실온에서 PBST로 신장을^{1일 동안} 세척합니다(그림 1).
   2. 고정^{후 9}, 신장을 PB의 1% 포름알데히드(37% 포름알데히드와 PB의 혼합물 1:36)에 3시간 동안 담그고 실온에서 PBS로 6시간 동안 세척합니다(그림 1).

4. 굴절률 (RI) 일치

1. 큐빅-R+를 준비합니다.
   1. 45wt%의 2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론/안티피린과 30wt%의 니코틴아미드를 혼합하여 CUBIC-R을 준비합니다( 재료 표 참조).
   2. 이전에 발표 된 보고서 ^4,8,9에 따라 CUBIC-R에 N- 부틸 디 에탄올 아민 0.5 v%를 추가하여 굴절률 (RI) 일치를 위해 CUBIC-R +를 준비합니다.
2. RI 일치를 수행합니다.
   1. 신장을 14mL 둥근 바닥 튜브에 넣고 14mL 둥근 바닥 튜브에 50%(v/v) CUBIC-R+(물과 CUBIC-R+의 1:1 혼합물) 7mL에 담그고 실온에서 1일 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 14mL 둥근 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-R+를 담그고 실온에서^{2일 동안} 부드럽게 흔들어 9(그림 1).
      참고: 신장은 RI 매칭이 시작될 때 50% CUBIC-R+에 떠 있지만 프로세스가 끝나면 CUBIC-R+에서 가라앉고 투명해집니다(그림 2D).

5. 이미지 획득 및 재구성

1. 이미지 획득 중에 RI 매칭 신장을 실리콘 오일(RI = 1.555)과 미네랄 오일(RI = 1.467)(55:45)의 혼합물에 담그십시오(RI = 1.51)⁵ (그림 3).
2. 맞춤형⁹ 라이트 시트 형광 현미경으로 전체 신장의 3D 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조). 모든 원시 이미지 데이터를 16비트 TIFF 형식으로 수집합니다. 이미징 분석 소프트웨어로 3D 렌더링 이미지를 시각화하고 캡처합니다(Imaris, 재료 표 참조).

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결과

이 염색 방법을 사용하여 전체 신장 (그림 4A, B 및 비디오 1)의 교감 신경 [항 티로신 하이드 록 실라 제 (TH) 항체] 및 동맥 [항 α 평활근 액틴 (αSMA) 항체]을 시각화했습니다⁹. 비정상적인 신장 교감 신경은 허혈 / 재관류 손상 (IRI) ^9,10 후에 시각화되었습니다 (그림 4C)....

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토론

본 프로토콜은 교감 신경, 수집 관, 동맥, 근위 세뇨관 및 사구체 9,10,11과 같은 다양한 구조의 전체 신장 3D 이미징을 허용했습니다. 이 염색 방법은 거시적 관찰을 제공하고 허혈 재관류 손상 ^9,10 후 신장 교감 신경의 변화와 당뇨병 신장 질환 ¹¹의 초기 단계에서 사구체 비대를 시각?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer