冠状动脉支架的临床前评价

摘要

新冠状动脉支架的设计和材料必须在相关临床前模型中临床使用前进行测试。在这里，我们描述了一种动脉粥样硬化的兔主动脉模型和一种猪冠状动脉模型，用于 体内和组织 学分析的支架研究。

摘要

冠状动脉疾病是全球发病率和死亡率的主要因素。虽然生活方式的改变和药物治疗是治疗的基石，但冠状动脉球囊血管成形术和支架置入术常规用于急性冠脉综合征和慢性冠状动脉疾病患者，这些患者在接受光学药物治疗后仍有症状。近几十年来，已经开发了几代冠状动脉支架。球囊血管成形术和支架置入术通过使用涂抹在球囊和支架表面的药物来支持，以提高干预后动脉的愈合特性或防止再狭窄的形成。新器械在被接受用于临床实践之前需要经过严格的安全性和有效性测试;因此，持续需要可靠且可重复的支架评估临床前方法。我们在这里描述了用于冠状动脉支架研究的猪冠状动脉模型和动脉粥样硬化兔模型，并描述了血管内成像和支架组织学的基本步骤。

引言

动脉粥样硬化性冠状动脉疾病给全球各国的医疗保健系统造成了沉重的负担¹。冠状动脉球囊血管成形术和支架置入术常规用于急性冠状动脉综合征患者以及有症状的稳定冠状动脉疾病患者²。球囊血管成形术是一项革命性的发明，用于使狭窄甚至闭塞的冠状动脉血运重建。冠状动脉支架通过防止球囊血管成形术后动脉急性回缩，进一步改善了经皮冠状动脉介入治疗 （PCIs） 的结果³。通过引入药物洗脱支架 （DES） 或涂有抗增殖药物的支架来对抗支架内再狭窄 （ISR） - 先前部署的支架的重新狭窄，PCI 的结果进一步改善。DES 已被进一步开发为具有更薄但更耐用的支架支柱和用于药物释放的可生物降解聚合物。从概念上讲，支架的刚性平台只需要几周到几个月，以防止动脉回缩。这导致了完全可生物降解的新一代脚手架设备。早期的可生物降解支架和支架遇到了一些挫折，因为研究报告了支架血栓形成的发生率增加⁴。因此，可生物降解支架并未得到广泛使用。

仅在美国，每年就进行近 100 万例 PCI。随着越来越多的患者接受血管内治疗，新的支架材料和设计的开发将继续进行。新设备的评估需要在生物相关环境中进行测试，这需要使用适当的动物模型。在研究可生物降解设备时，临床前动物模型更为重要，因为这些设备的降解特性可能无法预测。应在大型动物模型中进行评估，其中可以研究足够大以供患者使用的设备。

我们在这里描述了用于临床前支架评估的猪冠状动脉模型和动脉粥样硬化兔主动脉模型 ^5,6。两种型号都可以容纳专为临床使用而设计的装置和设备。我们提出了用于评估支架性能、支架血栓形成和 ISR 的体内成像方式。此外，我们还展示了塑料包埋组织的组织学分析方法，包括免疫组织学⁷。

研究方案

所有动物实验均已获得芬兰动物实验委员会的批准。成年 3.0-4.0 kg 新西兰白兔 （NZW） 用于动脉粥样硬化兔模型。对于猪冠状动脉研究，动物在实验开始时体重为 30-40 公斤。兔动脉粥样硬化模型和猪冠状动脉模型的方案分别描述，然后描述如何对不可降解的冠状动脉支架进行组织学检查，而不管使用何种 体内 模型。

1. 兔动脉粥样硬化模型

注意：为了诱导主动脉的快速动脉粥样硬化变化，给动物喂食高胆固醇饮食，并且在支架植入前主动脉进行去内皮化。通过颈动脉进行支架置入术和成像，并如下所述对支架进行组织学处理。血管内超声 （IVUS） 比光学相干断层扫描 （OCT） 更适合兔主动脉，因为不需要动脉冲洗。

1. 高胆固醇饮食（图 1）
   1. 通过添加胆固醇将普通兔饲料转化为高胆固醇饲料。在大烧杯中的磁力搅拌器上，将胆固醇混合到一份乙醇和一份乙醚（250 克胆固醇兑 2 升 96% 乙醇和 2 升乙醚）中。
   2. 当胆固醇溶解后，将超过 25 公斤的兔饲料混合物倒入罩内的大盆中。每天将饲料混合数次，持续 3-4 天，直到混合物干燥。
   3. 这将产生 1% 胆固醇的饲料。为了制作 0.025% 胆固醇饲料，将 1% 胆固醇饲料以 1：40 的比例混合到普通兔饲料中。
2. 兔主动脉球囊剥脱
   1. 将阿司匹林混合到兔子饮用水中，从剥脱损伤前 3 天开始，一直持续到实验结束（100 毫克阿司匹林兑 1 升饮用水）。水是 随意提供的。
   2. 用 0.3 mg/kg 美托咪定和 20 mg/kg 氯胺酮皮下注射 （sc） 麻醉兔子。用美容剪去除右后腿腹股沟区域和大腿内侧区域的毛皮，并用乙醇消毒剂对皮肤进行消毒。
   3. 围手术期预防性抗生素（125 mg 头孢呋辛皮下注射）。
   4. 在皮肤切口之前用 10 mg/mL 利多卡因皮下注射局部麻醉剂，沿着将主要血管和神经保持在股骨区域的凹槽沿大腿内侧区域。
   5. 做一个皮肤切口，用手术剪刀和解剖剪刀小心地穿过皮下组织和腿部肌肉。
   6. 暴露股动脉，与周围组织以及静脉和神经分离。
   7. 将 5-0 不可吸收的手术缝合线穿过股动脉近端动脉下方两次。用缝合线小心地抬高动脉（不做结扎，而是用一对针头驱动器或蚊子钳固定手术缝合）。这条线用于暂时阻止血液流入股动脉。
   8. 在股动脉远端部分下方穿过 5-0 不可吸收缝合线两次，并牢固地系上结扎线以闭塞股动脉远端（例如，使用 Miller 结）。
   9. 用显微外科剪刀或细手术刀在动脉中做一个 1-2 毫米的小切口或动脉切开术，同时由助手从近端和远端手术线支撑和固定动脉。
   10. 将 Fogarty 3F 取栓球囊导管插入动脉，向近端朝向髂动脉。插入前，将取栓导管连接到充满 0.6 mL 空气的 1 mL 注射器（也可以使用生理盐水，但充气球囊更合适），以准备取栓切除术导管。降低近端手术线以允许取栓导管通过。
       注意：该手术使用没有导丝管腔的 Fogarty 取栓导管。
   11. 将取栓导管插入动脉 30 cm（根据导管轴上的标记判断）。用注射器充气并拉动充气的导管，直到它至少到达髂分叉处，此时导管会感觉到阻力。
   12. 给取栓导管放气，然后将其重新引入主动脉。重复 pull back 总共 3 次。
   13. 剥脱完成后，拔出取栓术导管，用近端缝合线闭合股动脉。因此，股动脉将在手术后闭塞。然而，由于兔子后肢的良好侧支循环，很少出现与缺血相关的任何健康问题。
   14. 用 4-0 可吸收缝合线连接覆盖股动脉的肌肉，用 4-0 可吸收缝合线用皮内缝合线连接皮肤。
   15. 对动物进行监测，直到它们清醒、警觉、饮水或喂食。使用可接触水和干草的加热室促进兔子的恢复。
   16. 手术后给予卡洛芬 1-3 天或更长时间（如果需要）（2 mg/kg sc，每天一次）用于镇痛。
3. 兔主动脉支架置入术
   1. 在支架置入当天以 30 毫克的负荷剂量开始氯吡格雷，并继续每天 15 毫克直至实验结束。将氯吡格雷片剂放入研钵中研磨，混入自来水中（一片 75 毫克氯吡格雷片剂加入 5 mL 水;负荷剂量为 2 mL，然后每天 1 mL）， 并通过 胃管给药。
      注意：氯吡格雷不完全溶于自来水;在给兔子用药之前，每天服用新鲜剂量。此时，确保兔子在剥脱损伤后每天服用阿司匹林。
   2. 用 0.3 mg/kg 美托咪定和 20 mg/kg 氯胺酮 sc 麻醉兔子。
   3. 围手术期预防性抗生素（125 mg 头孢呋辛皮下注射）。
   4. 用剃须刀去除颈部前侧的毛发，并用乙醇消毒剂对皮肤进行消毒。
   5. 沿颈部中线 （3-5 mL） 涂抹利多卡因作为局部麻醉剂，并在皮肤上纵向切开 4-5 厘米。
   6. 用解剖剪刀纵向切割，打开颈阔肌。通过用手术镊挤压或使用单极或双极凝血装置凝固来凝固小出血的小动脉。
   7. 在颈部肌肉内发现了一个天然凹槽，在该凹槽之间可以找到颈动脉和迷走神经（在胸骨瘤肌和胸骨舌骨肌之间）（图2A）。仔细解剖动脉并将其与其他组织分开。右颈动脉是首选，因为它提供了通往降主动脉的更直接通道。
   8. 在颈动脉远端部分下方穿过 5-0 不可吸收缝合线两次，并牢固地结扎动脉。向上握住手术线以抬高颈动脉的远端部分。
   9. 在颈动脉近端部分下方将 5-0 不可吸收的手术线穿过两次。在不结扎的情况下，使用近端手术线抬起颈动脉，暂时阻止血液流向手术区域的颈动脉。
   10. 用显微外科剪刀在手术线之间的颈动脉中做一个 1-2 毫米的小动脉切开术。
   11. 将准备好的 5F 或 6F 导引鞘插入近端方向。
       1. 用生理盐水冲洗鞘，将扩张器插入鞘中，并在将鞘插入动脉之前冲洗。此外，为了促进护套的推进，将一根短导丝穿过扩张器，为护套制作一个锥形尖端。
       2. 一旦鞘的尖端（或者更确切地说是扩张器）位于颈动脉内，降低近端手术线以使鞘进入动脉。
   12. 将鞘推进 2-3 cm 进入颈动脉。
   13. 从导引器护套上取下闭孔器和电线。
   14. 通过打开鞘阀并让少量 （1-2 mL） 血液从鞘中流出，确认鞘在动脉中的位置。
   15. 用肝素化盐水（每 1000 mL 5000 IU，0.9% NaCl）冲洗护套并缝合以将其固定在手术单或兔子的皮肤中。通过鞘施用普通肝素 （150 IU/kg） 使兔肝素化。
   16. 如果未在导管实验室的手术台上进行手术，请将动物移至导管插入台。
   17. 通过导引器护套推进一根细的冠状动脉导丝（0.014 英寸），并在透视下将其引导到降主动脉中。将 5F 导引导管推进到导丝上。
       注意：如果难以从颈动脉导航到降主动脉，可以使用弯曲的引导导管。
   18. 如果使用带有斜尖的导引导管进入降主动脉，请将其更换为导丝上的直导导管，以输送支架或成像导管。
   19. 通过引导导管用碘造影剂 （250-350 mgI/mL） 进行造影剂注射，获取腹主动脉的血管造影图像。
   20. 在肾下主动脉的腰动脉之间选择合适的部分进行支架置入。根据支架制造商的说明，在放气管的帮助下，将支架以 1.1：1 的比例（支架与动脉的距离略大，以防止在球囊导管拔出时支架移动）部署到主动脉中（所有安装在球囊导管上的支架都将有一个尺寸表随支架一起提供）。给球囊放气并拔出支架导管（图 2B）。
   21. 使用造影剂重复进行血管造影，以确认支架放置。
   22. 支架置入和成像后取下导引器鞘。用颈动脉中的近端缝合线闭合动脉。这将完全阻塞颈动脉。
   23. 用 4-0 可吸收缝合线闭合颈部的肌肉层（通常为两层缝合线），用可吸收的 4-0 皮内缝合线闭合皮肤。
   24. 监测动物的恢复情况，并按照球囊剥脱手术（步骤1.2.15-1.2.16）中的说明施用镇痛药。
4. 使用 IVUS 对兔主动脉进行成像
   1. 获取血管通路并将直引导导管定位到降主动脉中，如兔主动脉支架置入手术所述。
      注意：成像是在支架置入时 通过 相同的血管通路进行的。可以利用左颈动脉创建第二个成像时间点。
   2. 将成像导管通过导丝推进到支架段以外的远端主动脉（如果进行支架前成像，则进入支架放置位置）。
   3. 在记录 IVUS 数据时手动执行回调，或启动自动回调（参见 IVUS 系统的说明）。在回拉期间，成像单元会自动在目标区域上移动（如果由成像系统启用），或者在记录成像数据的同时通过将成像导管拉到感兴趣区域（支架）上手动移动。
   4. 保存成像数据并取出成像导管、导丝和引导导管。
   5. 按照支架置入术（步骤 1.3）的说明取下护套并闭合手术伤口。
   6. 如前所述监控动物恢复情况。如前所述使用镇痛药（步骤 1.2.15-1.2.16）。
5. 组织灌注和固定（兔模型）
   1. 在氯胺酮 - 美托咪定麻醉下用 20-30 mL 静脉内 （iv.） 注射饱和硫酸镁 （MgSO₄） 处死动物。
   2. 用生理盐水灌注，或者如果仅使用 1% 多聚甲醛混合物收集样本用于组织学，则使用专用泵。
   3. 通过针头或套管将灌注系统直接插入肾动脉水平以上的降主动脉，或将针头穿过心脏左心室并插入主动脉（将灌注整个动物），从而灌注兔主动脉。
   4. 在灌注过程中，将针头或套管尖端固定在主动脉中的主动脉上夹住。
   5. 灌注 1000 mL（从降主动脉）或 1500 mL（从升主动脉通过左心室）盐水或 1% PFA。
   6. 通过仔细解剖周围组织来收集主动脉的支架段。
      注意：考虑收集主动脉的近端和远端段用于组织学。此外，收集任何必要的安全组织。
   7. 将收集到的组织指定用于组织学分析，在室温 （RT） 下放入 4% 多聚甲醛中 4 小时，或在 4 °C 下过夜。
   8. 为了进一步储存，在 4 °C 下转移至 50% EtOH 24 小时，然后在 4 °C 下转移至 70% EtOH，直至准备进行组织学。

2. 猪冠状动脉模型

注意：猪的心脏在解剖学和生理学上与人的心脏相似。冠状动脉也很相似——它们沿心外膜走行并形成三个主要的冠状动脉分支（右冠状动脉 （RCA） 和左冠状动脉 （LCA），进一步分为左升冠状动脉 （LAD） 和左回旋支动脉 （LCX））。这是一个对自体猪冠状动脉进行支架置入术和使用 OCT 进行血管内成像的模型。猪在麻醉前禁食过夜。

1. 猪冠状动脉支架置入术和成像的麻醉和血管通路
   1. 用阿扎培隆 （8 mg/kg 肌肉注射 （i.m.）） 和阿托品 （0.05 mg/kg im） 镇静动物，并用静脉注射异丙酚 （15 mg/kg/h） 和芬太尼 （10 μg/kg/h） 诱导并继续麻醉。在整个手术过程中为动物插管并让它们使用呼吸机。
   2. 血管通路是通过右股 动脉获得的。 借助超声换能器定位股动脉（可以通过动脉搏动和换能器压迫来区分动脉与静脉）。
   3. 在超声引导下，将血管造影针推进股动脉。
   4. 一旦进入动脉，强烈的脉动血流就会通过针头流出。将导丝推进动脉并取出针头。
   5. 将组装并冲洗的适当尺寸（通常为 5F 或 6F）的导引器通过导线推进动脉。
      注意：注意始终保持电线可见，以免在动脉中丢失。
   6. 从导引器护套上拆下扩张器和导线。
   7. 用肝素化盐水 （5 IU/mL） 冲洗护套。
   8. 静脉注射 1 mg/kg 依诺肝素 一旦完成血管通路。
   9. 为每次侵入性手术使用预防性抗生素（500 毫克头孢呋辛 i.m.）。
2. 猪冠状动脉血管造影术和支架置入术
   1. 在支架置入当天开始抗血栓药物治疗，负荷剂量为 300 mg 阿司匹林 （po） 和 600 mg 氯吡格雷 po。继续阿司匹林（每天 100 毫克）和氯吡格雷（每天 75 毫克）直到实验结束。
   2. 在透视下将 J 形尖端导丝推进到升主动脉。
   3. 在 J 型丝上以适当角度推进引导导管，并接合左右冠状动脉（通常右冠状动脉为 AR1，左冠状动脉为 AR2）。
      注意：引导导管连接到 Y 型适配器和歧管，其中至少有一条用于造影剂的线，以最大限度地降低空气进入成像系统的风险。
   4. 通过将造影剂注射到冠状动脉中进行冠状动脉造影。
      注意：每个冠状动脉应至少从两个不同的角度进行成像。此外，在成像前施用冠状动脉内硝酸盐 （50-300 μL）。
   5. 将冠状动脉导丝（0.014 英寸）插入适当的冠状动脉段。将支架放入 RCA 和 LCX 或源自 LCX 的钝边动脉。
      注意：LAD 的形状通常是锥形的，支架很容易在远端过度膨胀或在近端边缘过度膨胀。必须仔细考虑使用哪些冠状动脉。使用 X 线装置的狭窄分析软件或血管内成像来帮助选择良好的动脉段并与支架的大小相匹配。
   6. 将支架推进到导丝上，并根据制造商的说明使用充气管展开，支架与动脉的比例为 1.1：1，与动脉的参考直径相比，支架的尺寸略有过大。
   7. 如果合适，重复进行血管造影和血管内影像学检查。
   8. 拆下导管插入设备。
   9. 取下导引器护套，手动或借助股骨加压装置对穿刺部位施加压力。
      注意：由于猪后腿的解剖结构与人相比不同，而且股动脉的尺寸相对较小，因此血管闭合装置通常在猪中效果不佳。
3. 冠状动脉的 OCT 成像
   1. 在支架置入前后以及随访期间进行 OCT 成像。要开始 OCT 成像，请获取血管通路，用引导导管接合目标冠状动脉，并在目标动脉中远端推进冠状动脉导丝。
   2. 将 OCT 成像导管连接到成像系统的底座。
      注意：请遵循成像系统的说明，因为它们因制造商以及不同代的成像导管而异。
   3. 使用所选的 ID 代码为录制创建新的 Patient 。
   4. 用造影剂冲洗成像导管管腔。
      注：可以通过盐水冲洗进行成像，但可能需要更改系统的图像设置才能获得准确的结果。
   5. 将成像导管单轨系统插入导丝，并将导管成像标记推进到所需的成像位置。
      注意： 始终确保导丝深入动脉足够远;不要让导管（成像、球囊、支架）穿过导丝尖端。
   6. 进行成像。在回拉中包括整个支架以及远端和近端参考血管。
      1. 用造影剂冲洗成像导管管腔。
      2. 启动自动 pullback 序列。
      3. 通过引导导管 （250-350 mgI/mL） 用大量造影剂冲洗冠状动脉。
4. 组织灌注和固定（猪模型）
   1. 在麻醉下，用 50-100 mL 静脉推注饱和氯化钾 （KCl） 处死猪。
   2. 用生理盐水灌注，或者如果仅使用 1% 多聚甲醛混合物收集样本用于组织学，则使用专用泵。
   3. 通过将连接到灌注泵的套管或针头松散地放入升主动脉中，灌注整个猪心脏。
   4. 在主动脉外放置一个夹子，以关闭针头/套管周围的主动脉。
      注意：确保主动脉瓣的尖端打开，以允许灌注液流入冠状动脉。
   5. 灌注 750-1000 mL 选定的灌注液。
   6. 通过仔细解剖周围组织来收集冠状动脉的支架段。
      注意：考虑收集冠状动脉的近端和远端段进行组织学检查。此外，收集任何必要的安全组织。
   7. 将收集到的组织指定用于组织学分析，在 RT 下放入 4% 多聚甲醛中 4 小时，或在 4 °C 下过夜。
   8. 为了进一步储存，在 4 °C 下转移至 50% EtOH 24 小时，然后在 4 °C 下转移至 70% EtOH，直至准备进行组织学。

3. 支架组织学

注意：不可降解金属支架的支架组织学需要使用塑料包埋系统和使用专用切片机进行样品切片。包埋系统是市售的，但为了实现基于抗体的免疫组织学，需要对方案进行一些修改。无论使用何种动物模型，所有样品的包埋方案都是相同的。使用塑料包埋系统进行包埋过程。在引擎盖内工作，进行所有包埋和组织学程序。

1. 将样品从 EtOH 溶液脱水成二甲苯。
2. 遵循包埋系统的方案，但从第二个预浸润步骤开始使用不稳定的基本溶液除外。
   注：碱性溶液通过氧化铵排空而不稳定。
3. 将塑料样品瓶中的聚合液与支架段混合。
   注意：可以通过将小针头穿过容器外部将支架动脉固定到位。
4. 对样品施加真空 10-15 分钟，然后在 4 °C 下聚合至少 48 小时。
5. 锯掉塑料块的边缘（尤其是在使用圆柱形模具时）以创建直表面。这将允许安全地连接到切片机。
6. 用专用切片机切成 5-7 μm 的切片。
7. 将新鲜切割的切片在 50% 乙醇中放置 5-10 分钟。
8. 将 EtOH 中的切片收集到标准显微镜载玻片上（每张载玻片两个或三个切片）。
9. 用两滴或三滴 Haupt 溶液覆盖，并用塑料薄膜覆盖。在塑料薄膜上放一层纸，并在纸上放一张空的玻璃预备玻片。
10. 将载玻片放在一个小的桌面虎钳中，同时用纸层填充，在 42 °C 下对载玻片施加压力至少 24 小时。
11. 将载玻片储存在 RT 中。
12. 在组织学染色之前，通过将载玻片在甲基丙烯酸甲酯中孵育 24-48 小时来去除塑料基树脂。
13. 在标准组织学或免疫组织学程序之前，在二甲苯中澄清（2 x 10 分钟孵育）^7,8。

结果

支架扩张成功必须通过血管造影确认，最好通过血管内成像（图3、A、B）。猪冠状动脉模型允许多次成像，OCT 可用于创建具有频繁成像的随访数据。ISR 和支架扩张以及可能的支柱骨折可以通过血管造影和 OCT 成像轻松评估。与组织学不同，血管内成像还可以沿整个支架的长度生成数据，组织学通常只能沿支架进行到几个节段。

讨论

虽然当前一代药物洗脱冠状动脉支架已经证明了其优点，但正在开发新设备以更好地满足患者和医疗保健专业人员的需求。第一轮完全可生物降解的冠状动脉支架遇到了多项挑战，这进一步强调了在生物相关模型中测试新设备的重要性⁹。这里介绍的模型为进行支架研究提供了两种选择。应应用冠状动脉模型，并且通常适用于新的血管内冠状动脉装置，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiographic puncture needle	Cordis	12-004943
Aspirin Cardio 100 mg	Bayer
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Plavix	Sanofi		Clopidogrel
Coronary stent (bare metal, drug eluting, biodegradable)			Stent should be selected according to the study plan. Stent length 18-25mm and diameter 2.5-3.5mm
Domitor	Orion		medetomide
Dragonfly Optis OCT catheter	Abbott	C408646	Use catheter compatible with available imaging system
Enoxaparine	Sanofi		Clexane
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-M
Fentanyl	Biocodex
Guide wire, coronary	Cordis	507114
Guide wire, J tip	Cordis	502717
Guiding catheter AR1	Cordis	670-110-00
Guiding catheter AR2	Cordis	670-112-00
Guiding catheter straight	Cordis	55626090
Indeflator	Medtronic	AC3200	Indeflator for stent balloon inflation and deflation
Introducer sheath 5F	Cordis	504605P
Introducer Sheath 6F	Cordis	504606X
Ketalar	Pfizer		Ketamine
Microsurgical set	Mediq	FBL-SET	S&T , basic lab set for example
Paraformaldehyde	VWR	VWRRC28794.295	Prepare 1% and 4% solutions
Propofol	B. Braun
Suture	OneMed	JOH8685H	5-0, nonresorbable
Suture	OneMed	JOHFH1642H	4-0 resorbable
Technovit 9100	Kulzer
Ultrasound with linear transducer	Philips
Vacuum chamber	SP Bel-Art	F42043-0000
X-Ray contrast agent	Iomeron
Xylene	Sigma-Aldrich	534056