Koroner Arter Stentlerinin Preklinik Değerlendirmesi

Özet

Yeni koroner arter stent tasarımları ve materyalleri, ilgili preklinik modellerde klinik kullanımdan önce test edilmelidir. Burada, in vivo ve histolojik analizlerle stent araştırması için bir aterosklerotik tavşan aort modeli ve bir domuz koroner arter modeli tanımlanmıştır.

Özet

Koroner arter hastalığı tüm dünyada morbidite ve mortaliteye önemli bir katkıda bulunmaktadır. Yaşam tarzı değişiklikleri ve ilaç tedavisi tedavinin temel taşları olmakla birlikte, akut koroner sendromlu ve kronik koroner arter hastalığı olan ve optik medikal tedavi ile semptomatik kalan hastalara rutin olarak koroner arter balon anjiyoplasti ve stentleme uygulanmaktadır. Son yıllarda birkaç nesil koroner stent geliştirilmiştir. Balon anjiyoplasti ve stentleme, balonlar ve stent yüzeyi üzerine uygulanan farmasötik ajanların kullanımı ile desteklenir, bu da ya müdahale sonrası arterin iyileşme özelliklerini ilerletmek ya da restenoz oluşumunu önlemek için yapılır. Yeni cihazların klinik uygulamaya kabul edilmeden önce güvenlik ve etkinlik açısından titizlikle test edilmesi gerekir; Bu nedenle, stent değerlendirmesinin güvenilir ve tekrarlanabilir klinik öncesi yöntemlerine sürekli bir ihtiyaç vardır. Burada koroner arter stent araştırması için bir domuz koroner arter modeli ve bir aterosklerotik tavşan modeli tanımlanmış ve intravasküler görüntüleme ve stent histolojisindeki temel adımlar tanımlanmıştır.

Giriş

Aterosklerotik koroner arter hastalığı, tüm dünyadaki ülkelerin sağlık sistemleri üzerinde önemli bir yüke neden olmaktadır¹. Koroner arter balon anjiyoplasti ve stentleme, akut koroner sendromlu hastaların yanı sıra stabil koroner arter hastalığı olan semptomatik hastalara rutin olarak uygulanmaktadır². Balon anjiyoplasti, daralmış ve hatta tıkanmış koroner arterleri revaskülarize etmek için devrim niteliğinde bir buluştu. Koroner arter stentleri, balon anjiyoplasti³ sonrası arterin akut geri tepmesini önleyerek perkütan koroner girişimlerin (PCI) sonuçlarını daha da iyileştirdi. PCI'lerin sonuçları, daha önce kullanılan bir stentin yeniden daralması olan stent içi restenoz (ISR) ile savaşmak için ilaç salınımlı stentlerin (DES'ler) veya antiproliferatif ilaçlarla kaplanmış stentlerin piyasaya sürülmesiyle daha da iyileştirildi. DES'ler ayrıca daha ince ancak daha dayanıklı stent desteklere ve ilaç salınımı için biyolojik olarak parçalanabilen polimerlere sahip olacak şekilde geliştirilmiştir. Kavramsal olarak, stentin sert platformu, arterin geri tepmesini önlemek için sadece birkaç hafta ila ay boyunca gereklidir. Bu, tamamen biyolojik olarak parçalanabilen yeni nesil iskele cihazlarına yol açmıştır. Erken biyolojik olarak parçalanabilen stentler ve iskeleler, çalışmalar stent trombozu insidansının arttığını bildirdiğinden, bazı aksiliklerle karşılaşmıştır⁴. Sonuç olarak, biyolojik olarak parçalanabilen stentler yaygın olarak kullanılmamaktadır.

Yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda yaklaşık bir milyon PCI gerçekleştirilmektedir. Giderek daha fazla hasta intravasküler olarak tedavi edildikçe yeni stent materyallerinin ve tasarımlarının geliştirilmesi devam edecektir. Yeni cihazların değerlendirilmesi, biyolojik olarak ilgili bir ortamda test yapılmasını gerektirir ve bu da uygun bir hayvan modelinin kullanılmasını gerektirir. Klinik öncesi hayvan modelleri, biyolojik olarak parçalanabilen cihazları incelerken daha da önemlidir, çünkü bu cihazların bozunma özellikleri tahmin edilemez olabilir. Değerlendirme, hasta kullanımına yönelik olacak kadar büyük cihazların çalışılabileceği büyük hayvan modellerinde yapılmalıdır.

Burada preklinik stent değerlendirmesi için bir domuz koroner arter modeli ve bir aterosklerotik tavşan aort modeli^{tanımlanmıştır 5,6}. Her iki model de klinik kullanım için tasarlanmış cihaz ve ekipmanları barındırabilir. Stent performansı, stent trombozu ve ISR'nin değerlendirilmesi için in vivo görüntüleme modaliteleri sunuyoruz. Ek olarak, immünohistoloji⁷ dahil olmak üzere plastik gömülü dokuların histolojik analizleri için yöntemler gösteriyoruz.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Finlandiya'daki Hayvan Deney Kurulu tarafından onaylandı. Aterosklerotik tavşan modeli için yetişkin 3.0-4.0 kg Yeni Zelanda Beyaz (NZW) tavşanları kullanıldı. Domuz koroner çalışması için, deneyin başlangıcında hayvanlar 30-40 kg ağırlığındaydı. Tavşan aterosklerotik modeli ve domuz koroner arter modeli için protokol ayrı ayrı açıklanır, ardından kullanılan in vivo modelden bağımsız olarak bozunamayan koroner stentler için histolojinin nasıl yapılabileceği açıklanır.

1. Tavşan aterosklerotik modeli

NOT: Aortta hızlı aterosklerotik değişiklikleri indüklemek için, hayvanlar yüksek kolesterollü bir diyetle beslenir ve aortlar, stent implantasyonundan önce endotelden arındırılır. Stentleme ve görüntüleme karotis arterlerden yapılır ve stentler aşağıda belirtildiği gibi histoloji için işlenir. İntravasküler ultrasonografi (IVUS), tavşan aortu için optik koherens tomografiden (OCT) daha uygundur çünkü arteriyel yıkamaya gerek yoktur.

1. Yüksek kolesterol diyeti (Şekil 1)
   1. Normal tavşan yemini kolesterol ekleyerek yüksek kolesterollü yeme dönüştürün. Kolesterolü bir kısım etanol ve bir kısım dietil eter (250 g kolesterol ila 2 L %96 EtOH ve 2 L dietil eter) halinde büyük bir beherde manyetik bir karıştırıcı üzerinde karıştırın.
   2. Kolesterol çözüldüğünde, karışımı bir davlumbazın içindeki büyük bir leğene 25 kg tavşan yemi üzerine dökün. Karışım kuruyana kadar yemi 3-4 gün boyunca günde birkaç kez karıştırın.
   3. Bu% 1'lik bir kolesterol beslemesi üretecektir. %0.025 kolesterol yemi yapmak için, %1 kolesterol yemi normal tavşan yemine 1:40 oranında karıştırılır.
2. Tavşan aortunun balon denudasyonu
   1. Aspirini, denudasyon yaralanmasından 3 gün önce başlayarak tavşan içme suyuna karıştırın ve deneyin sonuna kadar devam edin (100 mg aspirin ila 1 L içme suyu). Su ad libitum olarak sunulmaktadır.
   2. Tavşanları 0.3 mg/kg medetomidin ve 20 mg/kg ketamin ile subkutan olarak anestezi altına (s.c.) uygulayın. Sağ arka bacağın kasık bölgesinden ve iç uyluk bölgesinden kürkü tımar makası ile çıkarın ve cildi etanol bazlı bir dezenfektanla sterilize edin.
   3. Perioperatif profilaktik bir antibiyotik uygulayın (125 mg sefuroksim sc).
   4. Femoral bölgedeki ana kan damarlarını ve sinirleri tutan oluk boyunca iç uyluk bölgesi boyunca 10 mg / mL lidokain sc ile cilt kesilerinden önce lokal anestezik uygulayın.
   5. Deriden bir kesi yapın ve ameliyat makası ve diseksiyon makası ile deri altı doku ve bacak kasları boyunca dikkatlice ilerleyin.
   6. Femoral arteri açığa çıkarın ve çevredeki dokulardan, damar ve sinirden ayırın.
   7. Proksimal femoral arterdeki arterin altından iki kez 5-0 emilemeyen cerrahi sütür geçirin. Sütür hattı ile arteri dikkatlice yükseltin (ligatür yapılmaz, bunun yerine cerrahi sütür bir çift iğne sürücüsü veya sivrisinek forseps ile tutulur). Bu hat, femoral artere kan akışını geçici olarak durdurmak için kullanılır.
   8. Femoral arterin distal kısmının altından iki kez 5-0 emilemeyen bir sütür hattı geçirin ve distal femoral arteri tıkamak için güvenli bir şekilde bir ligatür bağlayın (örneğin, bir Miller düğümü ile).
   9. Mikrocerrahi makas veya ince bir neşter ile arter içine 1-2 mm'lik küçük bir kesi veya arteriyotomi yapın, arter bir asistan tarafından proksimal ve distal cerrahi hatlardan desteklenir ve yerinde tutulur.
   10. İlyak artere proksimal olarak giden artere bir Fogarty 3F embolektomi balon kateteri yerleştirin. Yerleştirmeden önce, embolektomi kateterini 0.6 mL hava ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırıngaya bağlayarak hazırlayın (salin de kullanılabilir, ancak hava dolu bir balon daha uygundur). Proksimal cerrahi çizgi, embolektomi kateterinin geçişine izin verecek şekilde alçaltılır.
       NOT: İşlem için kılavuz tel lümeni olmayan bir Fogarty embolektomi kateteri kullanılır.
   11. Embolektomi kateterini arterin 30 cm içine geçirin (kateter şaftı üzerindeki işaretlere göre değerlendirildiği gibi). Şırınga ile şişirin ve şişirilmiş kateteri en azından iliak bifurkasyona ulaşana kadar çekin, bu noktada kateter üzerinde direnç hissedilir.
   12. Embolektomi kateterini söndürün ve aort içine tekrar yerleştirin. Geri çekme işlemini toplam üç kez tekrarlayın.
   13. Denudasyon tamamlandıktan sonra embolektomi kateterini geri çekin ve femoral arteri proksimal sütür hattı ile kapatın. İşlemden sonra femoral arter böylece tıkanmış olacaktır. Bununla birlikte, tavşanın arka bacaktaki iyi kollateral dolaşım nedeniyle, iskemi ile ilgili nadiren herhangi bir sağlık sorunu vardır.
   14. Femoral arteri kaplayan kası 4-0 emilebilir sütür ile ve cildi 4-0 emilebilir sütür hattı ile cilt içi sütür ile bağlayın.
   15. Hayvanlar uyanık olana, uyanık olana ve su içene veya beslenene kadar izlenir. Su ve samana erişimi olan ısıtılmış bir oda kullanarak tavşanların geri kazanılmasını kolaylaştırın.
   16. Analjezi için cerrahi prosedürlerden sonra gerekirse 1-3 gün veya daha uzun süre (günde bir kez 2 mg / kg sc) uygulayın.
3. Tavşan aortunun stentlenmesi
   1. Klopidogrel'e stentleme gününde 30 mg'lık bir yükleme dozu ile başlayın ve deneyin sonuna kadar günde 15 mg ile devam edin. Klopidogrel tabletlerini bir havanda öğütün, musluk suyuna karıştırın (bir 75 mg klopidogrel tableti için 5 mL su; yükleme dozu 2 mL'dir, ardından günde 1 mL'dir) ve bir mide tüpü ile uygulayın.
      NOT: Klopidogrel musluk suyunda tamamen çözünmez; Tavşanları ilaçlamadan önce her gün taze bir doz yapın. Bu noktada, denudasyon yaralanmasını takiben tavşanların günlük olarak uygulanan aspirin aldığından emin olun.
   2. Tavşanları 0.3 mg / kg medetomidin ve 20 mg / kg ketamin sc ile uyuşturun.
   3. Perioperatif profilaktik bir antibiyotik uygulayın (125 mg sefuroksim sc).
   4. Tıraş makası ile boynun ön tarafındaki tüyleri alın ve cildi etanol bazlı bir dezenfektanla sterilize edin.
   5. Lidokaini boynun orta hattı boyunca (3-5 mL) lokal anestezik olarak uygulayın ve ciltten uzunlamasına 4-5 cm'lik bir kesi yapın.
   6. Diseksiyon makası ile uzunlamasına keserek platizmayı açın. Cerrahi cımbızla sıkarak veya unipolar veya bipolar pıhtılaşma cihazı ile pıhtılaştırarak küçük kanayan arteriyolleri pıhtılaştırın.
   7. Boyun kasları içinde, aralarında vagus siniri ile birlikte karotis arterin bulunabileceği (sternomastoid ve sternohyoid kaslar arasında) doğal bir oluk tanımlanır (Şekil 2A). Arteri dikkatlice inceleyin ve diğer dokulardan ayırın. Sağ karotis arter, inen aorta daha doğrudan bir erişim hattı sağladığı için tercih edilir.
   8. Karotis arterin distal kısmının altından iki kez 5-0 emilemeyen bir sütür hattı geçirin ve arteri güvenli bir şekilde bağlayın. Karotis arterin distal kısmını yükseltmek için cerrahi çizgiyi yukarıda tutun.
   9. Karotis arterin proksimal kısmının altından iki kez 5-0 emilemeyen bir cerrahi çizgiyi geçirin. Bir ligatür yapmadan, ameliyat alanındaki karotis artere kan akışını geçici olarak engellemek için karotis arteri kaldırmak için proksimal cerrahi çizgiyi kullanın.
   10. Mikrocerrahi makas ile ameliyat hatları arasındaki şah damarına 1-2 mm'lik küçük bir arteriyotomi yapın.
   11. Proksimal yöne tam olarak hazırlanmış bir 5F veya 6F giriş kılıfı yerleştirin.
       1. Kılıfı tuzlu suyla yıkayın, dilatörü kılıfın içine yerleştirin ve kılıfı artere yerleştirmeden önce yıkayın. Ek olarak, kılıfın ilerlemesini kolaylaştırmak için, kılıf için konik bir uç yapmak için dilatörün içinden kısa bir kılavuz tel sokun.
       2. Kılıfın ucu (veya daha doğrusu dilatör) karotis arterin içine girdikten sonra, kılıfın artere geçmesine izin vermek için proksimal cerrahi çizgiyi indirin.
   12. Kılıfı karotis artere 2-3 cm ilerletin.
   13. Obturatörü ve teli giriş kılıfından çıkarın.
   14. Kılıf valfini açarak ve kılıftan az miktarda (1-2 mL) kan çıkmasına izin vererek kılıfın artere yerleştirildiğini onaylayın.
   15. Kılıfı heparinize salin (1000 mL başına 5000 IU,% 0.9 NaCl) ile yıkayın ve cerrahi örtülere veya tavşanın derisine sabitlemek için dikiş. Kılıftan fraksiyone edilmemiş heparin uygulayarak tavşanı heparine edin (150 IU / kg).
   16. Ameliyat kateterizasyon laboratuvarının masasında yapılmadıysa hayvanı kateterizasyon masasına taşıyın.
   17. İnce bir koroner kılavuz telini ( 0.014 inç) giriş kılıfından ilerletin ve floroskopi altında inen aortun içine yönlendirin. Kılavuz telin üzerine bir 5F kılavuz kateter ilerletin.
       NOT: Karotis arterden inen aorta geçişte sorun yaşıyorsa, kıvrımlı bir kılavuz kateter kullanılabilir.
   18. İnen aorta erişmek için açılı uçlu bir kılavuz kateter kullanılmışsa, stentleri veya görüntüleme kateterlerini iletmek için kılavuz tel üzerinde düz bir kılavuz kateter ile değiştirin.
   19. İyot bazlı bir kontrast madde (250-350 mgI / mL) ile kılavuz kateter yoluyla kontrast enjeksiyonu ile abdominal aortun anjiyografik bir görüntüsünü elde edin.
   20. Stent uygulaması için infrarenal aorttaki lomber arterler arasında uygun bir bölüm seçin. Stent üreticisinin talimatlarına göre bir deflatör yardımıyla stenti 1.1:1 oranında (balon kateter çekildiğinde stentin hareket etmesini önlemek için stent artere biraz fazla büyük) aort içine yerleştirin (balon kateterlere takılan tüm stentler, stentle birlikte verilen bir boyutlandırma tablosuna sahip olacaktır). Balonu söndürün ve stent kateterini geri çekin (Şekil 2B).
   21. Stent yerleşimini doğrulamak için kontrast madde ile tekrar anjiyografi yapın.
   22. Stentleme ve görüntülemeden sonra giriş kılıfını çıkarın. Karotis arterdeki proksimal sütür hattı ile arteri kapatın. Bu, karotis arteri tamamen tıkayacaktır.
   23. Boynun kas tabakalarını (genellikle iki kat dikiş) 4-0 emilebilir dikişlerle ve cildi emilebilir 4-0 intrakutanöz dikişlerle kapatın.
   24. Hayvanın iyileşmesini izleyin ve balon denüdasyon işleminde anlatıldığı gibi analjezikler uygulayın (adım 1.2.15-1.2.16).
4. IVUS ile tavşan aortunun görüntülenmesi
   1. Vasküler erişim elde edin ve tavşan aortu için stentleme işlemi için tarif edildiği gibi inen aorta düz bir kılavuz kateter yerleştirin.
      NOT: Görüntüleme, stentleme sırasında aynı damar yolu üzerinden yapılır. Sol karotis arter kullanılarak ikinci bir görüntüleme zaman noktası oluşturulabilir.
   2. Görüntüleme kateterini bir kılavuz tel üzerinden stentli segmentin (veya stentleme öncesi görüntüleme yapılırsa stentin yerleştirileceği yerin) distal aortuna ilerletin.
   3. IVUS verileri kaydedilirken manuel olarak bir geri çekme işlemi gerçekleştirin veya otomatik geri çekmeyi başlatın (IVUS sistemi talimatlarına bakın). Geri çekme sırasında görüntüleme ünitesi, görüntüleme sistemi tarafından etkinleştirilmişse otomatik olarak veya görüntüleme verilerini kaydederken görüntüleme kateterini ilgilenilen alanın (stent) üzerine çekerek manuel olarak hedef alan üzerinde hareket eder.
   4. Görüntüleme verilerini kaydedin ve görüntüleme kateterini, kılavuz teli ve kılavuz kateteri çıkarın.
   5. Kılıfı çıkarın ve cerrahi yarayı stentleme prosedürü için tarif edildiği gibi kapatın (adım 1.3).
   6. Hayvan iyileşmesini daha önce açıklandığı gibi izleyin. Analjezikleri daha önce tarif edildiği gibi uygulayın (adım 1.2.15-1.2.16).
5. Doku perfüzyonu ve fiksasyonu (tavşan modeli)
   1. Hayvanları ketamin-medetomidin anestezisi altındayken 20-30 mL intravenöz (i.v.) doymuş magnezyum sülfat (_MgS04) enjeksiyonu ile sakrifiye edin.
   2. Tuzlu su ile perfüzür veya sadece histoloji için numune topluyorsanız% 1 paraformaldehit karışımı ile, özel bir pompa kullanarak.
   3. Perfüzyon sistemini bir iğne veya kanül yoluyla doğrudan renal arter seviyesinin üzerindeki inen aorta sokarak veya iğneyi kalbin sol ventrikülünden aort içine sokarak (tüm hayvanı perfüze edecektir) tavşan aortunu perfüze edin.
   4. Perfüzyon işlemi sırasında aort içine sabitlemek için iğnenin veya kanülün ucunun bulunduğu aortun üzerine bir kelepçe uygulayın.
   5. 1000 mL (inen aorttan) veya 1500 mL (çıkan aorttan sol ventrikülden geçen) salin veya% 1 PFA ile perfüz.
   6. Aortun stentli segmentini çevre dokulardan dikkatlice diseksiyon yaparak toplayın.
      NOT: Histoloji için aortun proksimal ve distal segmentlerini toplamayı düşünün. Ayrıca, gerekli tüm güvenlik dokularını toplayın.
   7. Histolojik analiz için belirlenen toplanan dokuları oda sıcaklığında (RT) 4 saat veya gece boyunca 4 °C'de% 4 paraformaldehit içine yerleştirin.
   8. Daha fazla depolama için, histoloji için hazırlanana kadar 24 saat boyunca 4 ° C'de% 50 EtOH'ye ve ardından 4 ° C'de% 70 EtOH'ye aktarın.

2. Domuz koroner arter modeli

NOT: Domuz kalbi anatomik ve fizyolojik olarak insan kalbine benzer. Koroner arterler de benzerdir - epikardiyal olarak çalışırlar ve üç ana koroner dal oluştururlar (sağ koroner arter (RCA) ve sol koroner arter (LCA), ayrıca sol yükselen koroner arter (LAD) ve sol sirkumfleks arter (LCX)). İşte yerli domuz koroner arterlerine stentleme ve OCT ile yapılan intravasküler görüntüleme ile bir model. Domuzlar anesteziden önce gece boyunca aç bırakılır.

1. Domuz koroner stentleme ve görüntüleme için anestezi ve vasküler erişim
   1. Hayvanları azaperon (8 mg / kg intramüsküler (i.m.)) ve atropin (0.05 mg / kg i.m.) ile sedasyon yapın ve intravenöz propofol (15 mg / kg / s) ve fentanil (10 μg / kg / s) ile anesteziye devam edin ve devam edin. Hayvanları entübe edin ve prosedürler boyunca onları bir ventilatörde tutun.
   2. Vasküler erişim sağ femoral arter yoluyla sağlanır. Bir ultrason dönüştürücü yardımıyla femoral arteri bulun (arter, arteriyel nabız atışı ve dönüştürücü ile sıkıştırarak damardan ayırt edilebilir).
   3. Ultrason rehberliğinde, femoral artere anjiyografik bir iğne ilerletin.
   4. Arterin içine girdikten sonra, iğneden güçlü bir titreşimli kan akışı gelecektir. Artere bir kılavuz tel ilerletin ve iğneyi çıkarın.
   5. Uygun boyutta (tipik olarak 5F veya 6F) monte edilmiş ve yıkanmış bir introdüseri tel üzerinden artere ilerletin.
      NOT: Telin her zaman görünür olmasına dikkat edin, böylece arterde kaybolmaz.
   6. Dilatörü ve teli giriş kılıfından çıkarın.
   7. Kılıfı heparinize tuzlu su ile (5 IU / mL) yıkayın.
   8. 1 mg / kg enoksaparin iv uygulayın vasküler erişim sağlandıktan sonra.
   9. Her invaziv prosedür için profilaktik bir antibiyotik uygulayın (500 mg sefuroksim i.m.).
2. Domuz koroner arter anjiyografisi ve stentleme
   1. Stent takma gününde os (po) başına 300 mg aspirin yükleme dozu ve 600 mg klopidogrel po yükleme dozu ile antitrombotik ilaca başlayın. Deneyin sonuna kadar aspirin (günde 100 mg) ve klopidogrel (günde 75 mg) devam edin.
   2. Floroskopi altında J uçlu bir kılavuz teli çıkan aorta ilerletin.
   3. J teli üzerinde uygun bir açıyla kılavuz bir kateter ilerletin ve sağ ve sol koroner arterleri devreye sokun (tipik olarak sağ koroner arter için AR1 ve sol koroner arter için AR2).
      NOT: Kılavuz kateter, görüntüleme sistemine hava girme riskini en aza indirmek için bir Y adaptörüne ve en azından kontrast madde için bir çizgiye sahip bir manifolda bağlanır.
   4. Koroner artere kontrast madde enjekte ederek koroner anjiyografi yapın.
      NOT: Görüntüleme her koroner arter için en az iki farklı açıdan yapılmalıdır. Ayrıca, görüntülemeden önce intrakoroner nitrat uygulayın (50-300 μL).
   5. Uygun koroner segmente bir koroner kılavuz tel (0.014 inç) geçirin. Stenti RCA'ya ve LCX'e veya LCX'ten çıkan geniş marjinal artere yerleştirin.
      NOT: LAD genellikle şekil olarak sivrilir ve bir stent kolayca distal kısımda aşırı genişlemiş veya proksimal kenarda az genişlemiş olarak bırakılabilir. Hangi koroner arterlerin kullanıldığına dikkat edilmelidir. İyi bir arteriyel segment seçmeye ve stentin boyutunu eşleştirmeye yardımcı olmak için X-ışını ünitesinin veya intravasküler görüntülemenin darlık analiz yazılımını kullanın.
   6. Stenti kılavuz tel üzerinden ilerletin ve üreticinin talimatlarına göre bir deflatör ile 1.1: 1 stent/arter oranına getirin, stenti arterin referans çapına kıyasla biraz fazla boyutlandırın.
   7. Uygunsa tekrar anjiyografi ve intravasküler görüntüleme yapın.
   8. Kateterizasyon ekipmanını çıkarın.
   9. Giriş kılıfını çıkarın ve manuel olarak veya bir femoral kompresyon cihazı yardımıyla delinme bölgesine baskı uygulayın.
      NOT: Vasküler kapatma cihazları, domuzun arka bacağının anatomisindeki insana kıyasla farklılıklar ve femoral arterin nispeten küçük boyutu nedeniyle genellikle domuzlarda iyi çalışmaz.
3. Koroner arterlerin OCT görüntülemesi
   1. Stent yerleştirilmesinden önce ve sonra ve takip sırasında OCT görüntüleme yapın. OCT görüntülemeye başlamak için vasküler erişim elde edin, hedef koroner arteri bir kılavuz kateter ile meşgul edin ve hedef arterde distal olarak bir koroner kılavuz teli ilerletin.
   2. OCT görüntüleme kateterini görüntüleme sisteminin yuvasına bağlayın.
      NOT: Üreticiler arasında ve farklı nesil görüntüleme kateterleri arasında farklılık gösterdiğinden görüntüleme sisteminin talimatlarını izleyin.
   3. Tercih edilen bir kimlik koduyla kayıt için yeni bir Hasta oluşturun.
   4. Görüntüleme kateteri lümenini bir kontrast madde ile yıkayın.
      NOT: Görüntüleme, tuzlu su yıkama ile gerçekleştirilebilir, ancak doğru sonuçlar için sistemin görüntü ayarlarının değiştirilmesi gerekebilir.
   5. Görüntüleme kateteri monoray sistemini kılavuz telin üzerine yerleştirin ve kateter görüntüleme işaretleyicilerini istenen görüntüleme konumuna ilerletin.
      NOT: Her zaman kılavuz telin artere yeterince ilerlediğinden emin olun; Kateterlerin (görüntüleme, balon, stent) kılavuz telin ucundan dışına geçmesine izin vermeyin.
   6. Görüntüleme gerçekleştirin. Geri çekilmeye tüm stentin yanı sıra distal ve proksimal referans damarlarını da dahil edin.
      1. Görüntüleme kateteri lümenini bir kontrast madde ile yıkayın.
      2. Otomatik geri çekme sırasını başlatın.
      3. Koroner arteri kılavuz kateterden (250-350 mgI/mL) büyük bir bolus kontrast madde ile yıkayın.
4. Doku perfüzyonu ve fiksasyonu (domuz modeli)
   1. Anestezi altında domuz, 50-100 mL iv bolus doymuş potasyum klorür (KCl) ile sakrifiye edilir.
   2. Tuzlu su ile perfüzür veya sadece histoloji için numune topluyorsanız% 1 paraformaldehit karışımı ile, özel bir pompa kullanarak.
   3. Perfüzyon pompasına bağlı bir kanül veya iğneyi çıkan aort içine gevşek bir şekilde yerleştirerek tüm domuz kalbini perfüze edin.
   4. İğne/kanül etrafındaki aortu kapatmak için aortun dışına bir kelepçe yerleştirin.
      NOT: Perfüzyon sıvısının koroner arterlere akmasına izin vermek için aort kapağının sivri uçlarının açık olduğundan emin olur.
   5. 750-1000 mL seçilmiş perfüzyon sıvısı ile perfüz.
   6. Koroner arterin stentli segmentlerini çevre dokulardan dikkatlice diseksiyon yaparak toplayın.
      NOT: Histoloji için koroner arterin proksimal ve distal segmentlerini toplamayı düşünün. Ek olarak, gerekli tüm güvenlik dokularını toplayın.
   7. Histolojik analiz için belirlenen toplanan dokuları RT'de 4 saat veya gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehite yerleştirin.
   8. Daha fazla depolama için, histoloji için hazırlanana kadar 24 saat boyunca 4 ° C'de% 50 EtOH'ye ve ardından 4 ° C'de% 70 EtOH'ye aktarın.

3. Stent histolojisi

NOT: Bozunmayan metalik stentlerden elde edilen stent histolojisi, plastik bir gömme sisteminin kullanılmasını ve özel bir mikrotom ile numune kesit alınmasını gerektirir. Gömme sistemi ticari olarak temin edilebilir, ancak antikor bazlı immünohistolojiye izin vermek için protokolde birkaç değişiklik yapılması gerekir. Gömme protokolü, kullanılan hayvan modelinden bağımsız olarak tüm numuneler için aynıdır. Gömme işlemi için plastik bir gömme sistemi kullanın. Tüm gömme ve histoloji prosedürleri için bir başlık içinde çalışın.

1. Numuneleri EtOH çözeltisinden ksilene kurutun.
2. İkinci ön sızma adımından başlayarak kararsız temel çözümün kullanılması dışında, gömme sistemi için protokolü izleyin.
   NOT: Bazik çözelti, amonyum oksitten süzülerek dengesizleştirilir.
3. Plastik numune kavanozlarındaki polimerizasyon sıvılarını stentli segmentlerle birleştirin.
   NOT: Stentli arterler, kabın dışından küçük bir iğne sokularak yerine sabitlenebilir.
4. Numunelere 10-15 dakika vakum uygulayın ve 4 °C'de en az 48 saat polimerleşmeye bırakın.
5. Düz yüzeyler oluşturmak için plastik bloğun kenarlarını (özellikle silindirik bir kalıp kullanıyorsanız) kesin. Bu, mikrotoma güvenli bir şekilde bağlanmaya izin verecektir.
6. Özel bir mikrotom ile 5-7 μm'lik bölümler halinde kesin.
7. Taze kesilmiş bölümleri %50 EtOH'de 5-10 dakika bekletin.
8. EtOH'den bölümleri standart mikroskopi slaytlarına toplayın (slayt başına iki veya üç bölüm).
9. İki veya üç damla Haupt solüsyonu ile örtün ve plastik bir film ile örtün. Plastik filmin üzerine bir kat kağıt yerleştirin ve kağıdın üzerine boş bir cam hazırlama sürgüsü yerleştirin.
10. Slaytları kağıt katmanlarıyla doldurulmuşken küçük bir masa üstü mengeneye yerleştirerek slayta en az 24 saat boyunca 42 °C'de basınç uygulayın.
11. Slaytları RT'de saklayın.
12. Histolojik boyamadan önce, slaytları metil metakrilat içinde 24-48 saat inkübe ederek plastik bazlı reçineyi çıkarın.
13. Standart histolojik veya immünohistolojik prosedürden önce ksilen içinde (2 x 10 dakikalık inkübasyon) berraktır ^7,8.

Sonuçlar

Stent genişlemesinin başarılı olup olmadığı anjiyografi ve ideal olarak intravasküler görüntüleme ile doğrulanmalıdır (Şekil 3A,B). Domuz koroner arter modeli, birden fazla görüntüleme seansına izin verir ve OCT, sık görüntüleme ile takip verileri oluşturmak için kullanılabilir. ISR ve stent genişletme ve olası dikme kırıkları anjiyografik ve OCT görüntülemeden kolayca değerlendirilebilir. İntravasküler g...

Tartışmalar

Mevcut nesil ilaç salınımlı koroner stentler yararlarını kanıtlamış olsa da, hastaların ve sağlık profesyonellerinin ihtiyaçlarına daha iyi uyacak yeni cihazlar geliştirilmektedir. Tamamen biyolojik olarak parçalanabilen koroner iskelelerin ilk turu, yeni cihazların biyolojik olarak ilgili modellerde test edilmesinin önemini daha da vurgulayan çeşitli zorluklarla karşılaştı⁹. Burada sunulan modeller, stent araştırması yapmak için iki se...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiographic puncture needle	Cordis	12-004943
Aspirin Cardio 100 mg	Bayer
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Plavix	Sanofi		Clopidogrel
Coronary stent (bare metal, drug eluting, biodegradable)			Stent should be selected according to the study plan. Stent length 18-25mm and diameter 2.5-3.5mm
Domitor	Orion		medetomide
Dragonfly Optis OCT catheter	Abbott	C408646	Use catheter compatible with available imaging system
Enoxaparine	Sanofi		Clexane
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-M
Fentanyl	Biocodex
Guide wire, coronary	Cordis	507114
Guide wire, J tip	Cordis	502717
Guiding catheter AR1	Cordis	670-110-00
Guiding catheter AR2	Cordis	670-112-00
Guiding catheter straight	Cordis	55626090
Indeflator	Medtronic	AC3200	Indeflator for stent balloon inflation and deflation
Introducer sheath 5F	Cordis	504605P
Introducer Sheath 6F	Cordis	504606X
Ketalar	Pfizer		Ketamine
Microsurgical set	Mediq	FBL-SET	S&T , basic lab set for example
Paraformaldehyde	VWR	VWRRC28794.295	Prepare 1% and 4% solutions
Propofol	B. Braun
Suture	OneMed	JOH8685H	5-0, nonresorbable
Suture	OneMed	JOHFH1642H	4-0 resorbable
Technovit 9100	Kulzer
Ultrasound with linear transducer	Philips
Vacuum chamber	SP Bel-Art	F42043-0000
X-Ray contrast agent	Iomeron
Xylene	Sigma-Aldrich	534056