Avaliação Pré-clínica de Stents de Artéria Coronária

Resumo

Novos designs e materiais de stents de artéria coronária devem ser testados antes do uso clínico em modelos pré-clínicos relevantes. Aqui descrevemos um modelo de aorta aterosclerótica de coelho e um modelo de artéria coronária de porco para pesquisa de stent com análises in vivo e histológicas.

Resumo

A doença arterial coronariana é um dos principais contribuintes para a morbidade e mortalidade em todo o mundo. Embora as mudanças no estilo de vida e a medicação sejam os pilares do tratamento, a angioplastia com balão da artéria coronária e o implante de stent são rotineiramente realizados em pacientes com síndromes coronarianas agudas e doença arterial coronariana crônica que permanecem sintomáticos com tratamento médico óptico. Várias gerações de stents coronários foram desenvolvidas nas últimas décadas. A angioplastia com balão e o implante de stent são apoiados pelo uso de agentes farmacêuticos aplicados nos balões e na superfície do stent, seja para melhorar as propriedades de cicatrização da artéria pós-intervenção ou para prevenir a formação de reestenose. Novos dispositivos precisam ser rigorosamente testados quanto à segurança e eficácia antes de serem aceitos na prática clínica; Assim, há uma necessidade contínua de métodos pré-clínicos confiáveis e reprodutíveis de avaliação de stents. Descrevemos aqui um modelo de artéria coronária de porco, bem como um modelo de coelho aterosclerótico para pesquisa de stent de artéria coronária e descrevemos etapas básicas em imagem intravascular e histologia de stent.

Introdução

A doença arterial coronariana aterosclerótica causa uma carga significativa nos sistemas de saúde de países em todo o mundo¹. A angioplastia com balão de artéria coronária e o implante de stent são rotineiramente realizados em pacientes que sofrem de síndromes coronarianas agudas, bem como em pacientes sintomáticos com doença arterial coronariana estável². A angioplastia com balão foi uma invenção revolucionária para revascularizar artérias coronárias estreitadas ou mesmo ocluídas. Os stents de artéria coronária melhoraram ainda mais os resultados das intervenções coronárias percutâneas (ICPs), evitando o recolhimento agudo da artéria após a angioplastia com balão³. Os resultados das ICPs foram melhorados ainda mais com a introdução de stents farmacológicos (DESs) ou stents revestidos com medicação antiproliferativa para combater a reestenose intra-stent (ISR) - o estreitamento de um stent previamente implantado. Os DESs foram desenvolvidos para ter suportes de stent mais finos e duráveis e polímeros biodegradáveis para liberação de medicamentos. Conceitualmente, a plataforma rígida do stent é necessária apenas por algumas semanas a meses para evitar o recuo da artéria. Isso levou a uma nova geração de dispositivos de andaimes totalmente biodegradáveis. Os primeiros stents e scaffolds biodegradáveis encontraram alguns contratempos, pois estudos relataram um aumento da incidência de trombose do stent⁴. Como resultado, os stents biodegradáveis não são amplamente utilizados.

Quase um milhão de ICPs são realizadas anualmente apenas nos Estados Unidos. O desenvolvimento de novos materiais e designs de stents continuará à medida que mais e mais pacientes forem tratados por via intravascular. A avaliação de novos dispositivos requer testes em um ambiente biologicamente relevante, o que requer o uso de um modelo animal apropriado. Modelos animais pré-clínicos são ainda mais essenciais ao estudar dispositivos biodegradáveis, pois as propriedades de degradação desses dispositivos podem ser imprevisíveis. A avaliação deve ser realizada em modelos animais de grande porte, nos quais podem ser estudados dispositivos grandes o suficiente para serem destinados ao uso do paciente.

Descrevemos aqui um modelo de artéria coronária de porco e um modelo de aorta de coelho aterosclerótica para avaliação pré-clínica do stent ^5,6. Ambos os modelos podem acomodar dispositivos e equipamentos projetados para uso clínico. Apresentamos modalidades de imagem in vivo para a avaliação do desempenho do stent, trombose do stent e ISR. Além disso, mostramos métodos para análises histológicas de tecidos plásticos incorporados, incluindo imuno-histologia⁷.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Experiment Board na Finlândia. Coelhos adultos da raça Nova Zelândia White (NZW) de 3,0-4,0 kg foram utilizados para o modelo de coelho aterosclerótico. Para o estudo coronário de porcos, os animais pesavam 30-40 kg no início do experimento. O protocolo para o modelo aterosclerótico de coelho e o modelo de artéria coronária de porco é descrito separadamente, seguido da descrição de como a histologia pode ser realizada para stents coronários não degradáveis, independentemente do modelo in vivo utilizado.

1. Modelo aterosclerótico de coelho

NOTA: Para induzir alterações ateroscleróticas rápidas na aorta, os animais são alimentados com uma dieta rica em colesterol e as aortas são submetidas à desendotelização antes do implante do stent. O implante de stent e a imagem são realizados através das artérias carótidas, e os stents são processados para histologia conforme descrito abaixo. A ultrassonografia intravascular (IVUS) é mais adequada do que a tomografia de coerência óptica (OCT) para aorta de coelho porque não há necessidade de lavagem arterial.

1. Dieta hipercolesterol (Figura 1)
   1. Converta a ração normal para coelhos em ração com alto teor de colesterol adicionando colesterol. Misture o colesterol em uma parte de etanol e uma parte de éter dietílico (250 g de colesterol para 2 L de EtOH a 96% e 2 L de éter dietílico) em um agitador magnético em um béquer grande.
   2. Quando o colesterol se dissolver, despeje a mistura sobre 25 kg de ração para coelhos em uma bacia grande dentro de um exaustor. Misture a ração várias vezes ao dia por 3-4 dias até que a mistura seque.
   3. Isso produzirá uma alimentação com 1% de colesterol. Para fazer ração com 0,025% de colesterol, a ração com 1% de colesterol é misturada à ração normal para coelhos na proporção de 1:40.
2. Desnudação por balão da aorta de coelho
   1. Misture a aspirina na água potável do coelho, começando 3 dias antes da lesão de desnudação e continue até o final do experimento (100 mg de aspirina para 1 L de água potável). A água é oferecida ad libitum.
   2. Anestesiar os coelhos com 0,3 mg/kg de medetomidina e 20 mg/kg de cetamina por via subcutânea (s.c.). Remova o pelo da área inguinal e da área interna da coxa da perna traseira direita com uma tesoura e esterilize a pele com um desinfetante à base de etanol.
   3. Administrar um antibiótico profilático perioperatório (125 mg de cefuroxima s.c.).
   4. Aplique um anestésico local antes das incisões na pele com 10 mg/mL de lidocaína s.c. ao longo da área interna da coxa ao longo do sulco, que contém os principais vasos sanguíneos e nervos na região femoral.
   5. Faça uma incisão na pele e avance cuidadosamente pelo tecido subcutâneo e pelos músculos das pernas com uma tesoura cirúrgica e uma tesoura de dissecção.
   6. Exponha a artéria femoral e separe-se dos tecidos circundantes e da veia e do nervo.
   7. Passe uma sutura cirúrgica não reabsorvível 5-0 duas vezes sob a artéria na artéria femoral proximal. Eleve a artéria cuidadosamente com a linha de sutura (nenhuma ligadura é feita, em vez disso, a sutura cirúrgica é realizada com um par de chaves de agulha ou pinça de mosquito). Esta linha é usada para interromper temporariamente o fluxo sanguíneo para a artéria femoral.
   8. Passe uma linha de sutura não reabsorvível 5-0 duas vezes sob a parte distal da artéria femoral e amarre firmemente uma ligadura para ocluir a artéria femoral distal (por exemplo, com um nó de Miller).
   9. Faça uma pequena incisão ou arteriotomia de 1-2 mm na artéria com uma tesoura microcirúrgica ou um bisturi fino enquanto a artéria é apoiada e mantida no lugar a partir das linhas cirúrgicas proximal e distal por um assistente.
   10. Insira um cateter de balão de embolectomia Fogarty 3F na artéria em direção proximal à artéria ilíaca. Antes da inserção, prepare o cateter de embolectomia conectando-o a uma seringa de 1 mL cheia de 0,6 mL de ar (solução salina também pode ser usada, mas um balão cheio de ar é mais compatível). A linha cirúrgica proximal é abaixada para permitir a passagem do cateter de embolectomia.
       NOTA: Um cateter de embolectomia de Fogarty sem lúmen de fio-guia é usado para o procedimento.
   11. Passe o cateter de embolectomia 30 cm para dentro da artéria (conforme julgado pelas marcações na haste do cateter). Encha com a seringa e puxe o cateter inflado até atingir pelo menos a bifurcação ilíaca, momento em que a resistência é sentida no cateter.
   12. Desinfle o cateter de embolectomia e reintroduza-o na aorta. Repita o recuo um total de três vezes.
   13. Após a conclusão da desnudação, retire o cateter de embolectomia e feche a artéria femoral com a linha de sutura proximal. A artéria femoral será assim ocluída após o procedimento. No entanto, devido à boa circulação colateral no membro posterior do coelho, raramente há problemas de saúde relacionados à isquemia.
   14. Ligue o músculo que cobre a artéria femoral com suturas reabsorvíveis 4-0 e a pele com uma sutura intracutânea com uma linha de sutura reabsorvível 4-0.
   15. Os animais são monitorados até que estejam acordados, alertas e bebendo ou se alimentando. Facilite a recuperação de coelhos com o uso de uma câmara aquecida com acesso a água e feno.
   16. Administre carprofeno após procedimentos cirúrgicos por 1-3 dias ou mais, se necessário (2 mg / kg s.c., uma vez ao dia) para analgesia.
3. Implante de stent na aorta de coelho
   1. Iniciar o clopidogrel no dia do implante de stent com uma dose de ataque de 30 mg e continuar com 15 mg por dia até ao final da experiência. Moa os comprimidos de clopidogrel em um pilão, misture em água da torneira (5 mL de água para um comprimido de clopidogrel de 75 mg; a dose de ataque é de 2 mL seguida de 1 mL por dia) e administre por meio de um tubo gástrico.
      NOTA: O clopidogrel não se dissolve completamente na água da torneira; Faça uma nova dose diariamente antes de medicar os coelhos. Neste ponto, certifique-se de que os coelhos estejam tomando aspirina diariamente após a lesão de desnudação.
   2. Anestesiar os coelhos com 0,3 mg/kg de medetomidina e 20 mg/kg de cetamina s.c.
   3. Administrar um antibiótico profilático perioperatório (125 mg de cefuroxima s.c.).
   4. Remova os pelos da parte anterior do pescoço com uma tesoura de barbear e esterilize a pele com um desinfetante à base de etanol.
   5. Aplique lidocaína como anestésico local ao longo da linha média do pescoço (3-5 mL) e faça um corte longitudinal de 4-5 cm na pele.
   6. Abra o platisma cortando com tesoura de dissecção longitudinalmente. Coagule pequenas arteríolas sangrantes apertando com pinças cirúrgicas ou coagulando com um dispositivo de coagulação unipolar ou bipolar.
   7. Um sulco natural é identificado dentro dos músculos do pescoço, entre os quais a artéria carótida e o nervo vago podem ser encontrados (entre os músculos esternomastóideo e esterno-hióideo) (Figura 2A). Disseque a artéria com cuidado e separe-a de outros tecidos. A artéria carótida direita é preferida, pois fornece uma linha de acesso mais direta à aorta descendente.
   8. Passe uma linha de sutura não reabsorvível 5-0 duas vezes sob a parte distal da artéria carótida e ligue a artéria com segurança. Segure a linha cirúrgica para elevar a parte distal da artéria carótida.
   9. Passe uma linha cirúrgica não reabsorvível 5-0 duas vezes sob a parte proximal da artéria carótida. Sem fazer uma ligadura, use a linha cirúrgica proximal para levantar a artéria carótida para bloquear temporariamente o fluxo sanguíneo para a artéria carótida na área operacional.
   10. Faça uma pequena arteriotomia de 1-2 mm na artéria carótida entre as linhas cirúrgicas com uma tesoura microcirúrgica.
   11. Insira uma bainha introdutora 5F ou 6F totalmente preparada na direção proximal.
       1. Lave a bainha com solução salina, insira o dilatador na bainha e lave antes de inserir a bainha na artéria. Além disso, para facilitar o avanço da bainha, insira um fio-guia curto através do dilatador para fazer uma ponta cônica para a bainha.
       2. Uma vez que a ponta da bainha (ou melhor, o dilatador) esteja dentro da artéria carótida, abaixe a linha cirúrgica proximal para permitir que a bainha passe para a artéria.
   12. Avance a bainha 2-3 cm na artéria carótida.
   13. Remova o obturador e o fio da bainha do introdutor.
   14. Confirme a colocação da bainha na artéria abrindo a válvula da bainha e deixando uma pequena quantidade (1-2 mL) de sangue sair da bainha.
   15. Lave a bainha com solução salina heparinizada (5000 UI por 1000 mL, NaCl a 0,9%) e suture para prendê-la nas cortinas cirúrgicas ou na pele do coelho. Heparinizar o coelho administrando heparina não fracionada através da bainha (150 UI / kg).
   16. Mova o animal para a mesa de cateterismo se a cirurgia não foi realizada na mesa do laboratório de cateterismo.
   17. Avance um fio-guia coronário fino (0,014 pol.) através da bainha introdutora e guie-o para a aorta descendente sob fluoroscopia. Avance um cateter-guia 5F sobre o fio-guia.
       NOTA: Um cateter-guia com uma curva pode ser usado se alguém tiver problemas para navegar da artéria carótida para a aorta descendente.
   18. Se um cateter-guia com ponta angulada foi usado para acessar a aorta descendente, troque-o por um cateter-guia reto sobre o fio-guia para fornecer stents ou cateteres de imagem.
   19. Adquirir uma imagem angiográfica da aorta abdominal por injeção de contraste através do cateter-guia com um agente de contraste à base de iodo (250-350 mgI/mL).
   20. Selecione uma seção adequada entre as artérias lombares na aorta infrarrenal para implantação do stent. Implante o stent na proporção de 1,1:1 (o stent é ligeiramente superdimensionado em relação à artéria para evitar que o stent se mova quando o cateter de balão é retirado) na aorta com o auxílio de um indeflator de acordo com as instruções do fabricante do stent (todos os stents montados em cateteres de balão terão uma tabela de tamanhos fornecida com o stent). Desinflar o balão e retirar o cateter de stent (Figura 2B).
   21. Realize uma angiografia repetida com o agente de contraste para confirmar a colocação do stent.
   22. Remova a bainha introdutora após o implante de stent e imagem. Feche a artéria com a linha de sutura proximal na artéria carótida. Isso ocluirá completamente a artéria carótida.
   23. Feche as camadas musculares do pescoço (geralmente duas camadas de suturas) com suturas reabsorvíveis 4-0 e a pele com suturas intracutâneas reabsorvíveis 4-0.
   24. Monitorizar a recuperação do animal e administrar analgésicos conforme descrito na operação de desnudamento com balão (passos 1.2.15-1.2.16).
4. Imagem da aorta de coelho com IVUS
   1. Adquira acesso vascular e posicione um cateter-guia reto na aorta descendente, conforme descrito para a operação de implante de stent na aorta de coelho.
      NOTA: A imagem é realizada no momento do implante do stent através do mesmo acesso vascular. Um segundo ponto de tempo de imagem pode ser criado utilizando a artéria carótida esquerda.
   2. Avance o cateter de imagem sobre um fio-guia na aorta distal além do segmento com stent (ou onde o stent será colocado se a imagem pré-stent for realizada).
   3. Execute um recuo manualmente enquanto os dados do IVUS são gravados ou inicie o recuo automático (consulte as instruções para o sistema IVUS). Durante o pullback, a unidade de imagem se move sobre a área alvo automaticamente se habilitado pelo sistema de imagem ou manualmente puxando o cateter de imagem sobre a área de interesse (o stent) enquanto registra os dados de imagem.
   4. Salve os dados de imagem e remova o cateter de imagem, o fio-guia e o cateter-guia.
   5. Remova a bainha e feche a ferida cirúrgica conforme descrito para o procedimento de implante de stent (etapa 1.3).
   6. Monitore a recuperação do animal conforme descrito anteriormente. Administre analgésicos conforme descrito anteriormente (etapas 1.2.15-1.2.16).
5. Perfusão e fixação tecidual (modelo coelho)
   1. Sacrifique os animais sob anestesia cetamina-medetomidina com uma injeção intravenosa (i.v.) de 20-30 mL de sulfato de magnésio saturado (MgSO₄).
   2. Perfundir com solução salina ou, se coletar amostras apenas para histologia com mistura de paraformaldeído a 1%, usando uma bomba dedicada.
   3. Perfundir a aorta do coelho inserindo o sistema de perfusão por meio de uma agulha ou cânula diretamente na aorta descendente acima do nível da artéria renal ou inserindo a agulha através do ventrículo esquerdo do coração e na aorta (que irá perfundir todo o animal).
   4. Aplique uma pinça sobre a aorta onde está a ponta da agulha ou cânula para prendê-la na aorta durante o procedimento de perfusão.
   5. Perfundir com 1000 mL (da aorta descendente) ou 1500 mL (da aorta ascendente através do ventrículo esquerdo) de soro fisiológico ou PFA a 1%.
   6. Colete o segmento com stent da aorta dissecando cuidadosamente os tecidos circundantes.
      NOTA: Considere coletar segmentos proximais e distais da aorta para histologia. Além disso, colete todos os tecidos de segurança necessários.
   7. Colocar os tecidos recolhidos designados para análise histológica em paraformaldeído a 4% durante 4 h à temperatura ambiente (RT) ou durante a noite a 4 °C.
   8. Para armazenamento posterior, transfira para 50% de EtOH a 4 °C por 24 h e, em seguida, 70% de EtOH a 4 °C até preparar para histologia.

2. Modelo de artéria coronária de porco

NOTA: O coração de porco se assemelha anatômica e fisiologicamente ao coração humano. As artérias coronárias também são semelhantes - elas correm epicárdico e formam três ramos coronários principais (a artéria coronária direita (CD) e a artéria coronária esquerda (LCA), que se divide em artéria coronária ascendente esquerda (LAD) e artéria circunflexa esquerda (LCX)). Aqui está um modelo com implante de stent realizado em artérias coronárias de porcos nativos e imagens intravasculares realizadas com OCT. Os porcos são colocados em jejum durante a noite antes da anestesia.

1. Anestesia e acesso vascular para implante de stent coronário e imagem de suínos
   1. Sedar os animais com azaperona (8 mg/kg por via intramuscular) e atropina (0,05 mg/kg i.m.) e induzir e continuar a anestesia com propofol (15 mg/kg/h) e fentanil (10 μg/kg/h) por via venosa. Intubar os animais e mantê-los em um ventilador durante os procedimentos.
   2. O acesso vascular é adquirido através da artéria femoral direita. Localize a artéria femoral com o auxílio de um transdutor de ultrassom (a artéria pode ser distinguida da veia pela pulsação arterial e pela compressão com o transdutor).
   3. Sob orientação de ultrassom, avance uma agulha angiográfica na artéria femoral.
   4. Uma vez dentro da artéria, um forte fluxo sanguíneo pulsante passará pela agulha. Avance um fio-guia na artéria e remova a agulha.
   5. Avance um introdutor montado e lavado de tamanho apropriado (normalmente 5F ou 6F) na artéria sobre o fio.
      NOTA: Tome cuidado para manter o fio visível o tempo todo, para que não se perca na artéria.
   6. Remova o dilatador e o fio da bainha do introdutor.
   7. Lave a bainha com solução salina heparinizada (5 UI / mL).
   8. Administre 1 mg / kg de enoxaparina intravenosa assim que o acesso vascular for realizado.
   9. Administrar um antibiótico profilático para cada procedimento invasivo (500 mg de cefuroxima i.m.).
2. Angiografia da artéria coronária de porco e implante de stent
   1. Inicie a medicação antitrombótica no dia do implante de stent com uma dose de ataque de 300 mg de aspirina por via oral (po) e uma dose de ataque de 600 mg de clopidogrel po. Continue aspirina (100 mg por dia) e clopidogrel (75 mg por dia) até o final do experimento.
   2. Avance um fio-guia com ponta em J sob fluoroscopia para a aorta ascendente.
   3. Avance um cateter-guia com um ângulo apropriado sobre o fio J e envolva as artérias coronárias direita e esquerda (normalmente AR1 para a artéria coronária direita e AR2 para a artéria coronária esquerda).
      NOTA: O cateter-guia é conectado a um adaptador em Y e a um coletor com uma linha para pelo menos o agente de contraste para minimizar o risco de entrada de ar no sistema de imagem.
   4. Realize a angiografia coronária injetando um agente de contraste na artéria coronária.
      NOTA: A imagem deve ser realizada de pelo menos dois ângulos diferentes para cada artéria coronária. Além disso, administre nitrato intracoronário antes da imagem (50-300 μL).
   5. Passe um fio-guia coronário (0,014 pol.) no segmento coronário apropriado. Coloque o stent na ACD e no LCX ou na artéria marginal obtusa originada do LCX.
      NOTA: A DA áurea geralmente tem formato cônico e um stent pode facilmente ser deixado superexpandido na parte distal ou subexpandido na borda proximal. Uma consideração cuidadosa de quais artérias coronárias são usadas deve ser feita. Use o software de análise de estenose da unidade de raios-X ou imagens intravasculares para ajudar a escolher um bom segmento arterial e combinar com o tamanho do stent.
   6. Avance o stent sobre o fio-guia e implante com um indeflator de acordo com as instruções do fabricante para uma proporção de 1,1:1 stent para artéria, superdimensionando ligeiramente o stent em comparação com o diâmetro de referência da artéria.
   7. Realize angiografia repetida e imagens intravasculares, se apropriado.
   8. Remova o equipamento de cateterismo.
   9. Remova a bainha introdutora e aplique pressão no local da punção manualmente ou com o auxílio de um dispositivo de compressão femoral.
      NOTA: Os dispositivos de fechamento vascular geralmente não funcionam bem em porcos devido a diferenças na anatomia da perna traseira do porco em comparação com o homem e ao tamanho relativamente pequeno da artéria femoral.
3. Imagem de OCT de artérias coronárias
   1. Realize imagens de OCT antes e depois da implantação do stent e durante o acompanhamento. Para iniciar a imagem da OCT, adquira acesso vascular, envolva a artéria coronária alvo com um cateter-guia e avance um fio-guia coronário distalmente na artéria-alvo.
   2. Conecte o cateter de imagem OCT à doca do sistema de imagem.
      NOTA: Siga as instruções do sistema de imagem, pois elas variam entre os fabricantes, bem como entre as diferentes gerações de cateteres de imagem.
   3. Crie um novo paciente para a gravação com um código de identificação de sua escolha.
   4. Lave o lúmen do cateter de imagem com um agente de contraste.
      NOTA: A imagem pode ser realizada com lavagem salina, mas pode exigir a alteração das configurações de imagem do sistema para obter resultados precisos.
   5. Insira o sistema de monotrilho do cateter de imagem sobre o fio-guia e avance os marcadores de imagem do cateter para o local de imagem desejado.
      NOTA: Certifique-se sempre de que o fio-guia avance o suficiente para dentro da artéria; Não deixe os cateteres (imagem, balão, stent) passarem além da ponta do fio-guia.
   6. Realize imagens. Inclua todo o stent, bem como os vasos de referência distal e proximal no pullback.
      1. Lave o lúmen do cateter de imagem com um agente de contraste.
      2. Inicie a sequência de recuo automático.
      3. Lave a artéria coronária com um grande bolus de agente de contraste através do cateter-guia (250-350 mgI / mL).
4. Perfusão e fixação tecidual (modelo suíno)
   1. Sob anestesia, o porco é sacrificado com um bolus intravenoso de 50-100 mL de cloreto de potássio saturado (KCl).
   2. Perfundir com solução salina ou, se coletar amostras apenas para histologia com mistura de paraformaldeído a 1%, usando uma bomba dedicada.
   3. Perfunda todo o coração do porco colocando uma cânula ou agulha presa à bomba de perfusão frouxamente na aorta ascendente.
   4. Coloque uma pinça fora da aorta para fechar a aorta ao redor da agulha/cânula.
      NOTA: Certifique-se de que as cúspides da válvula aórtica estejam abertas para permitir que o líquido de perfusão flua para as artérias coronárias.
   5. Perfundir com 750-1000 mL de líquido de perfusão escolhido.
   6. Colete os segmentos com stent da artéria coronária dissecando cuidadosamente os tecidos circundantes.
      NOTA: Considere a coleta de segmentos proximais e distais da artéria coronária para histologia. Além disso, colete todos os tecidos de segurança necessários.
   7. Colocar os tecidos recolhidos para análise histológica em paraformaldeído a 4% durante 4 h à RT ou durante a noite a 4 °C.
   8. Para armazenamento posterior, transfira para 50% de EtOH a 4 °C por 24 h e, em seguida, 70% de EtOH a 4 °C até preparar para histologia.

3. Histologia do stent

NOTA: A histologia do stent de stents metálicos não degradáveis requer o uso de um sistema de incorporação de plástico e seccionamento da amostra com um micrótomo especializado. O sistema de incorporação está disponível comercialmente, mas para permitir a imunohistologia baseada em anticorpos, algumas modificações precisam ser feitas no protocolo. O protocolo de incorporação é o mesmo para todas as amostras, independentemente do modelo animal utilizado. Use um sistema de incorporação de plástico para o processo de incorporação. Trabalhe dentro de um capuz para todos os procedimentos de incorporação e histologia.

1. Desidrate as amostras da solução de EtOH para xileno.
2. Siga o protocolo para o sistema de incorporação, com exceção do uso de solução básica desestabilizada a partir da segunda etapa de pré-infiltração.
   NOTA: A solução básica é desestabilizada por drenagem através do óxido de amônio.
3. Combine os líquidos de polimerização em frascos de amostra de plástico com os segmentos com stent.
   NOTA: As artérias com stent podem ser fixadas na posição inserindo uma pequena agulha na parte externa do recipiente.
4. Aplique vácuo nas amostras por 10-15 min e deixe polimerizar a 4 °C por pelo menos 48 h.
5. Serre as bordas do bloco de plástico (especialmente se estiver usando um molde cilíndrico) para criar superfícies retas. Isso permitirá uma fixação segura ao micrótomo.
6. Corte com um micrótomo dedicado em seções de 5-7 μm.
7. Deixe as seções recém-cortadas em 50% EtOH por 5-10 min.
8. Colete as seções do EtOH em lâminas de microscopia padrão (duas ou três seções por lâmina).
9. Cubra com duas ou três gotas da solução de Hupt e cubra com um filme plástico. Coloque uma camada de papel em cima do filme plástico e coloque uma lâmina de vidro vazia em cima do papel.
10. Aplique pressão na lâmina por pelo menos 24 h a 42 ° C, colocando-as em um pequeno torno de mesa enquanto acolchoadas com camadas de papel.
11. Armazene os slides no RT.
12. Antes da coloração histológica, remova a resina à base de plástico incubando as lâminas em metacrilato de metila por 24-48 h.
13. Limpar em xileno (2 x 10 min de incubação) antes do procedimento histológico ou imuno-histológico padrão ^7,8.

Resultados

A expansão bem-sucedida do stent deve ser confirmada com angiografia e, idealmente, com imagens intravasculares (Figura 3A,B). O modelo de artéria coronária de porco permite várias sessões de imagem, e a OCT pode ser usada para criar dados de acompanhamento com imagens frequentes. ISR e expansão do stent e possíveis fraturas da haste podem ser facilmente avaliadas a partir de imagens angiográficas e OCT. A imagem intravascular també...

Discussão

Embora a atual geração de stents coronários farmacológicos tenha provado seus méritos, novos dispositivos estão sendo desenvolvidos para melhor atender às necessidades de pacientes e profissionais de saúde. A primeira rodada de andaimes coronários totalmente biodegradáveis enfrentou vários desafios, o que reforça ainda mais a importância de testar novos dispositivos em modelos biologicamente relevantes⁹. Os modelos apresentados aqui fornecem duas opç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiographic puncture needle	Cordis	12-004943
Aspirin Cardio 100 mg	Bayer
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Plavix	Sanofi		Clopidogrel
Coronary stent (bare metal, drug eluting, biodegradable)			Stent should be selected according to the study plan. Stent length 18-25mm and diameter 2.5-3.5mm
Domitor	Orion		medetomide
Dragonfly Optis OCT catheter	Abbott	C408646	Use catheter compatible with available imaging system
Enoxaparine	Sanofi		Clexane
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-M
Fentanyl	Biocodex
Guide wire, coronary	Cordis	507114
Guide wire, J tip	Cordis	502717
Guiding catheter AR1	Cordis	670-110-00
Guiding catheter AR2	Cordis	670-112-00
Guiding catheter straight	Cordis	55626090
Indeflator	Medtronic	AC3200	Indeflator for stent balloon inflation and deflation
Introducer sheath 5F	Cordis	504605P
Introducer Sheath 6F	Cordis	504606X
Ketalar	Pfizer		Ketamine
Microsurgical set	Mediq	FBL-SET	S&T , basic lab set for example
Paraformaldehyde	VWR	VWRRC28794.295	Prepare 1% and 4% solutions
Propofol	B. Braun
Suture	OneMed	JOH8685H	5-0, nonresorbable
Suture	OneMed	JOHFH1642H	4-0 resorbable
Technovit 9100	Kulzer
Ultrasound with linear transducer	Philips
Vacuum chamber	SP Bel-Art	F42043-0000
X-Ray contrast agent	Iomeron
Xylene	Sigma-Aldrich	534056