관상동맥 스텐트의 전임상 평가

요약

새로운 관상동맥 스텐트 디자인 및 재료는 관련 전임상 모델에서 임상적으로 사용하기 전에 테스트해야 합니다. 여기에서는 생체 내 및 조직학적 분석을 통해 스텐트 연구를 위한 죽상경화성 토끼 대동맥 모델과 돼지 관상동맥 모델에 대해 설명합니다.

초록

관상 동맥 질환은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 생활 방식의 변화와 약물 치료가 치료의 초석이지만, 광학 치료로 증상이 남아 있는 급성 관상 동맥 증후군 및 만성 관상 동맥 질환 환자에게는 관상 동맥 풍선 성형술 및 스텐트 삽입술이 일상적으로 시행됩니다. 최근 수십 년 동안 여러 세대에 걸쳐 관상동맥 스텐트가 개발되었습니다. 풍선 혈관 성형술 및 스텐트 삽입술은 중재 후 동맥의 치유 특성을 촉진하거나 재협착의 형성을 방지하기 위해 풍선과 스텐트 표면에 적용되는 약제를 사용하여 지원됩니다. 새로운 기기는 임상 실습에 적용되기 전에 안전성과 효능에 대한 엄격한 테스트를 거쳐야 합니다. 따라서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 전임상 스텐트 평가 방법에 대한 지속적인 요구가 있습니다. 여기에서는 관상동맥 스텐트 연구를 위한 돼지 관상동맥 모델과 죽상경화성 토끼 모델을 설명하고 혈관 내 영상 및 스텐트 조직학의 기본 단계를 설명합니다.

서문

죽상경화성 관상동맥질환은 전 세계 국가의 의료 시스템에 상당한 부담을 준다¹. 관상동맥 풍선 성형술 및 스텐트 삽입술은 급성 관상동맥 증후군을 앓고 있는 환자와 안정된 관상동맥 질환을 앓고 있는 증상이 있는 환자에게 일상적으로 시행됩니다². 풍선 혈관 성형술은 좁아지거나 심지어 막힌 관상 동맥을 혈관화하는 혁신적인 발명품이었습니다. 관상동맥 스텐트는 풍선 혈관성형술 후 동맥의 급성 반동을 예방함으로써 경피적 관상동맥 중재술(PCI)의 결과를 더욱 개선했다³. PCI의 결과는 약물 용출 스텐트(DES) 또는 항증식 약물로 코팅된 스텐트를 도입하여 이전에 배치된 스텐트의 재협착증(ISR)과 싸우면서 더욱 개선되었습니다. DES는 더 얇지만 내구성이 뛰어난 스텐트 스트럿과 약물 방출을 위한 생분해성 폴리머를 갖도록 개발되었습니다. 개념적으로, 스텐트의 단단한 플랫폼은 동맥의 반동을 방지하기 위해 몇 주에서 몇 달 동안만 필요합니다. 이로 인해 완전히 생분해되는 새로운 세대의 비계 장치가 탄생했습니다. 초기의 생분해성 스텐트와 골격은 스텐트 혈전증의 발병률이 증가한다는 연구 결과가 발표됨에 따라 일부 차질을 빚었습니다⁴. 그 결과, 생분해성 스텐트는 널리 사용되지 않습니다.

미국에서만 매년 약 100만 건의 PCI가 수행됩니다. 새로운 스텐트 재료 및 디자인의 개발은 점점 더 많은 환자가 혈관 내 치료를 받음에 따라 계속될 것입니다. 새로운 장치를 평가하려면 생물학적으로 관련된 환경에서 테스트해야 하며, 이를 위해서는 적절한 동물 모델을 사용해야 합니다. 전임상 동물 모델은 생분해성 장치를 연구할 때 이러한 장치의 분해 특성을 예측할 수 없기 때문에 더욱 중요합니다. 평가는 환자가 사용할 수 있을 만큼 충분히 큰 장치를 연구할 수 있는 대형 동물 모델에서 수행해야 합니다.

여기에서는 전임상 스텐트 평가를 위한 돼지 관상동맥 모델과 죽상경화성 토끼 대동맥 모델을 설명합니다 ^5,6. 두 모델 모두 임상용으로 설계된 장치와 장비를 수용할 수 있습니다. 우리는 스텐트 성능, 스텐트 혈전증 및 ISR의 평가를 위한 생체 내 이미징 방식을 제시합니다. 또한, 면역조직학⁷을 포함한 플라스틱 포매 조직의 조직학적 분석 방법을 보여줍니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 핀란드 동물 실험 위원회의 승인을 받았습니다. 성체 3.0-4.0kg의 뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼를 죽상경화성 토끼 모델에 사용했습니다. 돼지 관상 동맥 연구의 경우, 실험 시작 시 동물의 체중은 30-40kg이었습니다. 토끼 죽상경화성 모델과 돼지 관상동맥 모델에 대한 프로토콜은 별도로 설명되며, 이어서 사용된 in vivo 모델에 관계없이 비분해성 관상동맥 스텐트에 대해 조직학을 수행할 수 있는 방법에 대한 설명이 이어집니다.

1. 토끼 죽상 경화 모델

참고: 대동맥의 급격한 죽상경화성 변화를 유도하기 위해 동물에게 고콜레스테롤 식단을 먹이고 대동맥은 스텐트 이식 전에 탈내피화를 거칩니다. 스텐트 삽입과 영상 촬영은 경동맥을 통해 수행되며, 스텐트는 아래와 같이 조직학을 위해 처리됩니다. 동맥 플러싱이 필요하지 않기 때문에 토끼 대동맥에는 혈관 내 초음파(IVUS)가 광간섭 단층촬영(OCT)보다 더 적합합니다.

1. 고콜레스테롤 다이어트(그림 1)
   1. 콜레스테롤을 첨가하여 일반 토끼 사료를 고콜레스테롤 사료로 전환하십시오. 콜레스테롤을 에탄올 1부와 디에틸 에테르(콜레스테롤 250g, 96% EtOH 2L, 디에틸 에테르 2L)를 큰 비이커의 자석 교반기에 섞습니다.
   2. 콜레스테롤이 녹으면 후드 안의 큰 대야에 토끼 사료 25kg 이상을 붓습니다. 혼합물이 마를 때까지 3-4일 동안 매일 여러 번 사료를 혼합하십시오.
   3. 이것은 1% 콜레스테롤 사료를 생성합니다. 0.025% 콜레스테롤 사료를 만들기 위해 1% 콜레스테롤 사료를 일반 토끼 사료에 1:40 비율로 혼합합니다.
2. 토끼 대동맥의 풍선 탈락
   1. 아스피린을 토끼 식수에 섞고, 탈피 손상 3일 전부터 실험이 끝날 때까지 계속합니다(아스피린 100mg, 식수 1L). 물은 임시로 제공됩니다.
   2. 0.3mg/kg 메데토미딘과 20mg/kg 케타민으로 토끼를 피하주사(s.c.)로 마취합니다. 그루밍 클리퍼로 오른쪽 뒷다리의 서혜부 부위와 허벅지 안쪽 부위의 털을 제거하고 에탄올 성분의 소독제로 피부를 살균합니다.
   3. 수술 전후 예방적 항생제(125mg cefuroxime s.c.)를 투여합니다.
   4. 대퇴부 부위의 주요 혈관과 신경을 지탱하는 홈을 따라 허벅지 안쪽 부위를 따라 피부 절개 전에 10mg/mL 리도카인 s.c.를 국소 마취제로 바르십시오.
   5. 피부를 절개하고 수술 가위와 해부 가위로 피하 조직과 다리 근육을 조심스럽게 전진시킵니다.
   6. 대퇴 동맥을 노출시키고 주변 조직과 정맥 및 신경과 분리하십시오.
   7. 5-0 비흡수성 수술 봉합사를 근위 대퇴 동맥의 동맥 아래에 두 번 통과시킵니다. 봉합선으로 동맥을 조심스럽게 들어 올립니다(결찰은 이루어지지 않고 수술용 봉합사는 한 쌍의 바늘 드라이버 또는 모기 집게로 고정됩니다). 이 선은 대퇴 동맥으로 들어가는 혈류를 일시적으로 멈추는 데 사용됩니다.
   8. 대퇴 동맥의 원위부 아래에 5-0 비흡수성 봉합선을 두 번 통과시키고 대퇴 원위 동맥을 폐색하기 위해 결찰을 단단히 묶습니다(예: 밀러 매듭으로).
   9. 미세 수술 가위나 미세한 메스로 동맥에 1-2mm의 작은 절개 또는 동맥 절개술을 하고 동맥을 보조자에 의해 근위부 및 원위 수술 라인에서 지지하고 제자리에 고정합니다.
   10. Fogarty 3F 색전절제술 풍선 카테터를 장골동맥 쪽으로 근위적으로 향하는 동맥에 삽입합니다. 삽입하기 전에 0.6mL의 공기로 채워진 1mL 주사기에 연결하여 색전절제술 카테터를 준비합니다(식염수도 사용할 수 있지만 공기가 채워진 풍선이 더 적합합니다). 색전절제술 카테터가 통과할 수 있도록 근위 수술 라인이 내려갑니다.
       참고: 가이드 와이어 루멘이 없는 Fogarty 색전절제술 카테터가 시술에 사용됩니다.
   11. 색전절제술 카테터를 동맥 안으로 30cm 통과시킵니다(카테터 샤프트의 표시로 판단). 주사기로 팽창시키고 팽창된 카테터가 최소한 장골 분기점에 도달할 때까지 당기면 카테터에 저항이 느껴집니다.
   12. 색전절제술 카테터를 수축시키고 대동맥으로 다시 주입합니다. 풀백을 총 3회 반복합니다.
   13. 박리가 완료된 후 색전절제술 카테터를 빼내고 근위부 봉합선으로 대퇴동맥을 닫습니다. 따라서 대퇴 동맥은 시술 후에 폐색됩니다. 그러나 토끼의 뒷다리에서 좋은 담보 순환으로 인해 허혈과 관련된 건강 문제는 거의 없습니다.
   14. 대퇴 동맥을 덮고 있는 근육을 4-0 흡수성 봉합사로 결찰하고, 4-0 흡수성 봉합선 봉합선으로 피내 봉합사로 피부를 결찰합니다.
   15. 동물들은 깨어 있고, 깨어 있고, 물을 마시거나 먹이를 줄 때까지 모니터링됩니다. 물과 건초에 접근 할 수있는 가열 된 챔버를 사용하여 토끼의 회복을 촉진하십시오.
   16. 수술 후 진통제를 위해 1-3일 또는 필요한 경우 그 이상(2mg/kg s.c., 1일 1회) 카프로펜을 투여합니다.
3. 토끼 대동맥의 스텐트 삽입술
   1. 스텐트 시술 당일에 30mg의 로딩 용량으로 클로피도그렐을 시작하고 실험이 끝날 때까지 매일 15mg을 계속합니다. 클로피도그렐 정제를 절구에 분쇄하고 수돗물(75mg 클로피도그렐 정제 1정당 물 5mL, 로딩 용량은 2mL 후 매일 1mL)에 섞어 위관을 통해 투여합니다.
      참고: 클로피도그렐은 수돗물에 완전히 녹지 않습니다. 토끼에게 약을 먹이기 전에 매일 새로운 복용량을 만드십시오. 이 시점에서, 토끼가 탈락 부상 후 매일 아스피린을 투여하고 있는지 확인하십시오.
   2. 0.3 mg/kg 메데토미딘과 20 mg/kg 케타민 s.c.로 토끼를 마취합니다.
   3. 수술 전후 예방적 항생제(세푸록심 s.c. 125mg)를 투여합니다.
   4. 면도 클리퍼로 목 앞쪽의 털을 제거하고 에탄올 성분의 소독제로 피부를 살균합니다.
   5. 목 정중선을 따라 국소 마취제로 리도카인을 바르고(3-5mL) 피부를 세로로 4-5cm 정도 자릅니다.
   6. 해부 가위로 세로로 절단하여 platysma를 엽니다. 수술용 핀셋으로 짜거나 단극성 또는 양극성 응고 장치로 응고하여 작은 출혈 세동맥을 응고시킵니다.
   7. 목의 근육 내에서 자연적인 홈이 확인되며, 그 사이에는 미주신경과 함께 경동맥이 있습니다(흉골유방근과 흉골근 사이). 동맥을 조심스럽게 절개하여 다른 조직과 분리하십시오. 우측 경동맥은 하행 대동맥에 보다 직접적으로 접근할 수 있는 통로를 제공하기 때문에 선호됩니다.
   8. 경동맥의 원위부 아래에 5-0 비흡수성 봉합선을 두 번 통과시키고 동맥을 단단히 결찰합니다. 경동맥의 원위부를 들어 올리기 위해 수술 라인을 위로 잡습니다.
   9. 경동맥의 근위부 아래에 5-0 비흡수성 수술 라인을 두 번 통과시킵니다. 결찰을 하지 않고 근위 수술 라인을 사용하여 경동맥을 들어 올려 수술 부위의 경동맥으로 가는 혈류를 일시적으로 차단합니다.
   10. 미세 수술 가위로 수술 라인 사이의 경동맥에 1-2mm의 작은 동맥 절개술을 만듭니다.
   11. 완전히 준비된 5F 또는 6F 도입부 덮개를 근위 방향으로 삽입합니다.
       1. 식염수로 덮개를 세척하고 확장기를 덮개에 삽입하고 덮개를 동맥에 삽입하기 전에 플러시하십시오. 또한 피복의 전진을 용이하게 하려면 확장기를 통해 짧은 가이드 와이어를 삽입하여 피복에 테이퍼 팁을 만듭니다.
       2. 칼집의 끝(또는 확장기)이 경동맥 내부에 있으면 근위 수술 라인을 내려 칼집이 동맥으로 통과할 수 있도록 합니다.
   12. 칼집을 경동맥으로 2-3cm 전진시킵니다.
   13. 도입기 피복에서 폐쇄기와 와이어를 제거합니다.
   14. 시스 밸브를 열고 칼집에서 소량(1-2mL)의 혈액을 배출하여 동맥에 칼집의 위치를 확인합니다.
   15. 칼집을 헤파린 식염수(1000mL당 5000IU, 0.9% NaCl)로 세척하고 봉합하여 수술용 커튼이나 토끼 피부에 고정합니다. 칼집을 통해 분획되지 않은 헤파린을 투여하여 토끼를 헤파린화합니다(150 IU/kg).
   16. 카테터 삽입 실험실의 테이블에서 수술을 수행하지 않은 경우 동물을 카테터 삽입 테이블로 이동합니다.
   17. 도입부 덮개를 통해 얇은 관상동맥 가이드 와이어(0.014인치)를 전진시키고 형광투시법에서 하행 대동맥으로 안내합니다. 5F 가이드 카테터를 가이드와이어 위로 전진시킵니다.
       참고: 구부러진 가이드 카테터는 경동맥에서 하행 대동맥으로 이동하는 데 문제가 있는 경우 사용할 수 있습니다.
   18. 하행 대동맥에 접근하기 위해 끝이 각진 가이드 카테터를 사용한 경우, 스텐트 또는 이미징 카테터를 전달하기 위해 가이드 와이어 위의 직선 가이드 카테터로 변경합니다.
   19. 요오드 기반 조영제(250-350 mgI/mL)가 포함된 가이드 카테터를 통해 조영제 주입으로 복부 대동맥의 혈관 조영술 이미지를 획득합니다.
   20. 스텐트 배치를 위해 대동맥 내측의 요추 동맥 사이에 적절한 절편을 선택합니다. 스텐트 제조업체의 지침에 따라 수축 장치를 사용하여 스텐트를 1.1:1 비율(풍선 카테터를 빼낼 때 스텐트가 움직이는 것을 방지하기 위해 스텐트가 동맥에 약간 큼)으로 스텐트를 대동맥에 배치합니다(풍선 카테터에 장착된 모든 스텐트에는 스텐트와 함께 제공되는 크기 차트가 있음). 풍선의 공기를 빼고 스텐트 카테터를 빼냅니다(그림 2B).
   21. 조영제로 반복 혈관 조영술을 수행하여 스텐트 배치를 확인합니다.
   22. 스텐트 시술 및 이미징 후 도입부 덮개를 제거합니다. 경동맥의 근위 봉합선이 있는 동맥을 닫습니다. 이렇게 하면 경동맥이 완전히 막힙니다.
   23. 4-0 흡수성 봉합사로 목의 근육층(보통 2층의 봉합사)을 봉합하고 흡수성 4-0 피내 봉합사로 피부를 봉합합니다.
   24. 동물의 회복을 모니터링하고 풍선 제거 작업(단계 1.2.15-1.2.16)에 설명된 대로 진통제를 투여합니다.
4. IVUS를 이용한 토끼 대동맥 이미징
   1. 혈관 접근을 획득하고 토끼 대동맥에 대한 스텐트 삽입술에 대해 설명한 대로 하행 대동맥에 직선 안내 카테터를 배치합니다.
      참고: 이미징은 동일한 혈관 접근을 통해 스텐트 시술 시 수행됩니다. 두 번째 이미징 시점은 좌측 경동맥을 활용하여 생성할 수 있습니다.
   2. 가이드 와이어를 통해 이미징 카테터를 스텐트 분절 너머의 원위 대동맥(또는 스텐트 삽입 전 이미징이 수행되는 경우 스텐트가 배치되는 위치)으로 전진시킵니다.
   3. IVUS 데이터가 기록되는 동안 수동으로 풀백을 수행하거나 자동 풀백을 시작합니다(IVUS 시스템 지침 참조). 풀백 동안, 이미징 장치는 이미징 시스템에 의해 활성화된 경우 자동으로 대상 영역 위로 이동하거나 이미징 데이터를 기록하는 동안 관심 영역(스텐트) 위로 이미징 카테터를 수동으로 당겨 이동합니다.
   4. 이미징 데이터를 저장하고 이미징 카테터, 가이드 와이어 및 가이드 카테터를 제거합니다.
   5. 외피를 제거하고 스텐트 시술에 대해 설명된 대로 수술 상처를 봉합합니다(1.3단계).
   6. 앞에서 설명한 대로 동물의 회복을 모니터링합니다. 앞서 설명한 대로 진통제를 투여합니다(단계 1.2.15-1.2.16).
5. 조직 관류 및 고정(토끼 모델)
   1. 케타민-메데토미딘 마취 상태에서 포화 황산마그네슘(MgSO₄)을 20-30mL 정맥 주사(IV) 주사하여 동물을 희생시킵니다.
   2. 식염수로 관류하거나 전용 펌프를 사용하여 1% 파라포름알데히드 혼합물로 조직학만을 위해 샘플을 수집하는 경우.
   3. 바늘이나 캐뉼라를 통해 관류 시스템을 신장 동맥 수준 위의 하행 대동맥에 직접 삽입하거나 심장의 좌심을 통해 대동맥에 바늘을 삽입하여 토끼 대동맥을 관류합니다(전체 동물을 관류합니다).
   4. 관류 절차 중에 바늘이나 캐뉼라의 끝이 대동맥에 고정되는 대동맥에 클램프를 적용합니다.
   5. 1000mL(하행 대동맥에서) 또는 1500mL(상행 대동맥에서 좌심실을 통해)의 식염수 또는 1% PFA로 관류합니다.
   6. 주변 조직을 조심스럽게 절개하여 대동맥의 스텐트 부분을 수집합니다.
      참고: 조직학을 위해 대동맥의 근위부 및 원위부 분절을 수집하는 것을 고려하십시오. 또한 필요한 안전 티슈를 모두 수집하십시오.
   7. 조직학적 분석을 위해 지정된 수집된 조직을 4% 파라포름알데히드에 넣고 실온(RT)에서 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 놓습니다.
   8. 추가 보관을 위해 4°C에서 24시간 동안 50% EtOH로 전환한 다음 조직학을 위해 준비될 때까지 4°C에서 70% EtOH로 전환합니다.

2. 돼지 관상 동맥 모델

참고: 돼지의 심장은 해부학적으로나 생리학적으로 인간의 심장과 유사합니다. 관상동맥도 비슷합니다-그들은 심외막으로 달리며 3개의 주요 관상동맥 분지(우측 관상동맥(RCA)와 좌측 관상동맥(LCA)을 형성하며, 이는 좌측 상행 관상동맥(LAD)과 좌측 외곽동맥(LCX)으로 더 나뉩니다. 다음은 토착 돼지 관상동맥에 스텐트 삽입술을 시행하고 OCT를 이용한 혈관 내 영상 촬영을 실시한 모델입니다. 돼지는 마취 전에 밤새 금식을 합니다.

1. 돼지 관상동맥 스텐트 삽입 및 이미징을 위한 마취 및 혈관 접근(Anesthesia and vascular access for pig coronary stenting and imaging)
   1. 아자페론(8mg/kg, 근육주사(i.m.))과 아트로핀(0.05mg/kg, i.m.)으로 동물을 진정시키고 프로포폴(15mg/kg/h) 및 펜타닐(10μg/kg/h)로 마취를 유도하고 마취를 계속합니다. 동물에게 삽관을 하고 절차가 진행되는 동안 인공호흡기를 계속 착용하십시오.
   2. 혈관 접근은 오른쪽 대퇴 동맥을 통해 획득됩니다. 초음파 변환기의 도움으로 대퇴 동맥을 찾습니다(동맥은 동맥 맥동과 변환기로 압축하여 정맥과 구별할 수 있음).
   3. 초음파 안내에 따라 혈관 조영 바늘을 대퇴 동맥으로 전진시킵니다.
   4. 동맥 안으로 들어가면 바늘을 통해 강하게 맥동하는 혈류가 들어옵니다. 가이드와이어를 동맥으로 밀어 넣고 바늘을 제거합니다.
   5. 적절한 크기(일반적으로 5F 또는 6F)의 조립되고 플러시된 주입기를 와이어를 통해 동맥으로 전진시킵니다.
      알림: 동맥에서 손실되지 않도록 와이어가 항상 보이도록 주의하십시오.
   6. 도입기 덮개에서 확장기와 와이어를 제거합니다.
   7. 헤파린 식염수(5 IU/mL)로 덮개를 씻어냅니다.
   8. 혈관 접근이 완료되면 1mg/kg enoxaparin i.v.를 투여합니다.
   9. 모든 침습적 절차에 대해 예방적 항생제를 투여합니다(세푸록심 500mg i.m.).
2. 돼지 관상동맥 혈관 조영술 및 스텐트 시술
   1. 스텐트 시술 당일에 아스피린 300mg/os(po)의 로딩 용량과 600mg의 클로피도그렐 po의 로딩 용량으로 항혈전제를 시작하십시오. 실험이 끝날 때까지 아스피린(매일 100mg)과 클로피도그렐(매일 75mg)을 계속 복용합니다.
   2. 형광투시법 하에서 J-tipped 가이드 와이어를 상행 대동맥으로 전진시킵니다.
   3. J-와이어 위로 적절한 각도로 안내 카테터를 전진시키고 좌우 관상동맥(일반적으로 우측 관상동맥의 경우 AR1, 좌측 관상동맥의 경우 AR2)을 맞물립니다.
      참고: 안내 카테터는 Y 어댑터와 매니폴드에 연결되어 있으며, 공기가 이미징 시스템으로 유입되는 위험을 최소화하기 위해 최소한 조영제를 위한 라인이 있습니다.
   4. 관상동맥에 조영제를 주입하여 관상동맥 조영술을 수행합니다.
      참고: 영상 촬영은 각 관상동맥에 대해 최소 두 가지 다른 각도에서 수행해야 합니다. 또한 이미징 전에 관상동맥내 질산염을 투여합니다(50-300 μL).
   5. 관상동맥 가이드 와이어(0.014인치)를 적절한 관상동맥 세그먼트에 통과시킵니다. 스텐트를 RCA와 LCX 또는 LCX에서 유래한 둔한 가장자리 동맥에 삽입합니다.
      참고: LAD는 모양이 가늘어지는 경우가 많으며, 스텐트는 원위부에서 과도하게 확장되거나 근위 가장자리에서 과소 확장될 수 있습니다. 어떤 관상동맥을 사용하는지 신중하게 고려해야 합니다. X-ray 장치의 협착 분석 소프트웨어 또는 혈관 내 이미징을 사용하여 양호한 동맥 세그먼트를 선택하고 스텐트의 크기에 맞게 조정할 수 있습니다.
   6. 스텐트를 가이드 와이어 위로 전진시키고 제조업체의 지침에 따라 인디플레이트를 사용하여 동맥의 기준 직경에 비해 스텐트를 약간 크게 1.1:1 스텐트 대 동맥 비율로 배치합니다.
   7. 적절한 경우 반복적인 혈관 조영술 및 혈관 내 영상을 수행합니다.
   8. 카테터 삽입 장비를 제거합니다.
   9. 도입부 덮개를 제거하고 수동으로 또는 대퇴 압박 장치를 사용하여 천자 부위에 압력을 가합니다.
      참고: 혈관 폐쇄 장치는 일반적으로 돼지와 사람의 뒷다리 해부학적 구조가 다르고 대퇴 동맥의 상대적으로 작은 크기로 인해 돼지에서 잘 작동하지 않습니다.
3. 관상동맥의 OCT 영상
   1. 스텐트 시술 전후와 후속 조치 중에 OCT 이미징을 수행합니다. OCT 이미징을 시작하려면 혈관 접근을 확보하고, 가이드 카테터로 표적 관상동맥을 맞물리고, 관상동맥 가이드 와이어를 표적 동맥에서 원위부로 전진시킵니다.
   2. OCT 이미징 카테터를 이미징 시스템의 도크에 연결합니다.
      참고: 이미징 시스템의 지침은 제조업체와 이미징 카테터의 세대에 따라 다르므로 따르십시오.
   3. 선택한 ID 코드를 사용하여 기록에 대한 새 환자 를 만듭니다.
   4. 조영제로 이미징 카테터 내강을 세척합니다.
      참고: 식염수 플러싱으로 이미징을 수행할 수 있지만 정확한 결과를 위해 시스템의 이미지 설정을 변경해야 할 수 있습니다.
   5. 가이드 와이어 위에 이미징 카테터 모노레일 시스템을 삽입하고 카테터 이미징 마커를 원하는 이미징 위치로 전진시킵니다.
      알림: 항상 가이드 와이어가 동맥 안으로 충분히 멀리 전진하는지 확인하십시오. 카테터(영상, 풍선, 스텐트)가 가이드 와이어 끝을 벗어나지 않도록 하십시오.
   6. 이미징을 수행합니다. 풀백에 전체 스텐트와 원위 및 근위 참조 혈관을 포함합니다.
      1. 조영제로 이미징 카테터 내강을 세척합니다.
      2. 자동 풀백 시퀀스를 시작합니다.
      3. 가이드 카테터(250-350 mgI/mL)를 통해 큰 조영제 덩어리로 관상 동맥을 세척합니다.
4. 조직 관류 및 고정(돼지 모델)
   1. 마취 상태에서 돼지는 포화 염화칼륨(KCl)의 50-100mL iv bolus로 희생됩니다.
   2. 식염수로 관류하거나 전용 펌프를 사용하여 1% 파라포름알데히드 혼합물로 조직학만을 위해 샘플을 수집하는 경우.
   3. 관류 펌프에 부착된 캐뉼라 또는 바늘을 상행 대동맥에 느슨하게 삽입하여 돼지 심장 전체를 관류합니다.
   4. 대동맥 바깥쪽에 클램프를 놓아 바늘/캐뉼라 주위의 대동맥을 닫습니다.
      알림: 관류 액체가 관상 동맥으로 흐를 수 있도록 대동맥 판막의 교두가 열려 있는지 확인합니다.
   5. 선택한 관류 액체 750-1000mL로 관류합니다.
   6. 관상동맥의 스텐트 절편을 주변 조직으로부터 조심스럽게 절개하여 수집합니다.
      참고: 조직학을 위해 관상동맥의 근위부 및 원위부 분절을 수집하는 것을 고려하십시오. 또한 필요한 안전 티슈를 모두 수집하십시오.
   7. 조직학적 분석을 위해 지정된 수집된 조직을 4% 파라포름알데히드에 RT에서 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 놓습니다.
   8. 추가 보관을 위해 4°C에서 24시간 동안 50% EtOH로 전환한 다음 조직학을 위해 준비될 때까지 4°C에서 70% EtOH로 전환합니다.

3. 스텐트 조직학

참고: 분해되지 않는 금속 스텐트의 스텐트 조직학은 플라스틱 임베딩 시스템과 특수 마이크로톰을 사용한 샘플 절편을 사용해야 합니다. 임베딩 시스템은 상업적으로 이용 가능하지만 항체 기반 면역조직학을 허용하려면 프로토콜에 몇 가지 수정이 필요합니다. Embedding 프로토콜은 사용된 동물 모델에 관계없이 모든 샘플에 대해 동일합니다. 임베딩 프로세스를 위해 플라스틱 임베딩 시스템을 사용하십시오. 모든 포매 및 조직학 절차를 위해 후드 내부에서 작업하십시오.

1. EtOH 용액의 시료를 자일렌으로 탈수합니다.
2. 두 번째 침투 전 단계부터 시작하는 불안정한 기본 솔루션을 사용하는 것을 제외하고 임베딩 시스템에 대한 프로토콜을 따릅니다.
   참고: 염기성 용액은 산화암모늄을 통해 배출하여 불안정화됩니다.
3. 플라스틱 샘플 용기에 담긴 중합 액체를 스텐트 세그먼트와 결합합니다.
   참고: 스텐트 동맥은 용기 외부를 통해 작은 바늘을 삽입하여 제자리에 고정할 수 있습니다.
4. 10-15분 동안 샘플에 진공을 적용하고 4°C에서 최소 48시간 동안 중합하도록 둡니다.
5. 플라스틱 블록의 가장자리를 잘라내고(특히 원통형 주형을 사용하는 경우) 직선 표면을 만듭니다. 이렇게 하면 마이크로톰에 안전하게 부착할 수 있습니다.
6. 전용 마이크로톰으로 5-7 μm 절편으로 자릅니다.
7. 갓 자른 부분을 50% EtOH에 5-10분 동안 그대로 둡니다.
8. EtOH의 절편을 표준 현미경 슬라이드(슬라이드당 2개 또는 3개의 절편)로 수집합니다.
9. Haupt의 용액을 두세 방울 떨어뜨리고 플라스틱 필름으로 덮습니다. 플라스틱 필름 위에 종이 한 층을 놓고 종이 위에 빈 유리 프리 슬라이드 를 놓습니다.
10. 42°C에서 최소 24시간 동안 슬라이드에 압력을 가하면 종이를 여러 겹 덧대고 작은 탁상용 바이스에 슬라이드를 놓아 압력을 가합니다.
11. RT에 슬라이드를 저장합니다.
12. 조직학적 염색 전에 슬라이드를 메틸 메타크릴레이트에서 24-48시간 동안 배양하여 플라스틱 기반 수지를 제거합니다.
13. 표준 조직학적 또는 면역조직학적 절차 전에 크실렌(2 x 10분 배양)에서 맑음 ^7,8.

결과

성공적인 스텐트 확장은 혈관 조영술로 확인해야 하며, 이상적으로는 혈관 내 영상으로 확인해야 합니다(그림 3A,B). 돼지 관상동맥 모델은 여러 이미징 세션을 허용하며, OCT는 잦은 이미징으로 후속 데이터를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. ISR 및 스텐트 확장, 스트럿 골절 가능성은 혈관 조영술 및 OCT 영상에서 쉽게 평가할 수 있습니?...

토론

현재 세대의 약물 용출 관상동맥 스텐트가 그 장점을 입증하고 있지만, 환자와 의료 전문가의 요구에 더 잘 부합하는 새로운 장치가 개발되고 있습니다. 완전히 생분해되는 관상동맥 골격의 첫 번째 라운드는 몇 가지 문제에 부딪혔으며, 이는 생물학적으로 관련된 모델에서 새로운 장치를 테스트하는 것의 중요성을 더욱 강조합니다⁹. 여기에 제시된 모?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiographic puncture needle	Cordis	12-004943
Aspirin Cardio 100 mg	Bayer
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Plavix	Sanofi		Clopidogrel
Coronary stent (bare metal, drug eluting, biodegradable)			Stent should be selected according to the study plan. Stent length 18-25mm and diameter 2.5-3.5mm
Domitor	Orion		medetomide
Dragonfly Optis OCT catheter	Abbott	C408646	Use catheter compatible with available imaging system
Enoxaparine	Sanofi		Clexane
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-M
Fentanyl	Biocodex
Guide wire, coronary	Cordis	507114
Guide wire, J tip	Cordis	502717
Guiding catheter AR1	Cordis	670-110-00
Guiding catheter AR2	Cordis	670-112-00
Guiding catheter straight	Cordis	55626090
Indeflator	Medtronic	AC3200	Indeflator for stent balloon inflation and deflation
Introducer sheath 5F	Cordis	504605P
Introducer Sheath 6F	Cordis	504606X
Ketalar	Pfizer		Ketamine
Microsurgical set	Mediq	FBL-SET	S&T , basic lab set for example
Paraformaldehyde	VWR	VWRRC28794.295	Prepare 1% and 4% solutions
Propofol	B. Braun
Suture	OneMed	JOH8685H	5-0, nonresorbable
Suture	OneMed	JOHFH1642H	4-0 resorbable
Technovit 9100	Kulzer
Ultrasound with linear transducer	Philips
Vacuum chamber	SP Bel-Art	F42043-0000
X-Ray contrast agent	Iomeron
Xylene	Sigma-Aldrich	534056