Evaluación preclínica de stents de arterias coronarias

Resumen

Los nuevos diseños y materiales de stents para arterias coronarias deben probarse antes de su uso clínico en modelos preclínicos relevantes. En este trabajo describimos un modelo de aorta aterosclerótica de conejo y un modelo de arteria coronaria de cerdo para la investigación de stents con análisis in vivo e histológicos.

Resumen

La enfermedad de las arterias coronarias es uno de los principales factores de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Si bien los cambios en el estilo de vida y la medicación son las piedras angulares del tratamiento, la angioplastia con balón de las arterias coronarias y la colocación de stents se realizan de forma rutinaria en pacientes con síndromes coronarios agudos y enfermedad de las arterias coronarias crónicas que permanecen sintomáticos con tratamiento médico óptico. En las últimas décadas se han desarrollado varias generaciones de stents coronarios. La angioplastia con balón y la colocación de stents se apoyan en el uso de agentes farmacéuticos aplicados sobre los balones y la superficie del stent, ya sea para mejorar las propiedades curativas de la arteria después de la intervención o para prevenir la formación de reestenosis. Los nuevos productos deben someterse a pruebas rigurosas de seguridad y eficacia antes de ser aceptados en la práctica clínica; Por lo tanto, existe una necesidad continua de métodos preclínicos confiables y reproducibles para la evaluación de stents. Describimos aquí un modelo de arteria coronaria de cerdo, así como un modelo de conejo aterosclerótico para la investigación de stents de arterias coronarias y describimos los pasos básicos en la imagen intravascular y la histología del stent.

Introducción

La enfermedad de las arterias coronarias ateroscleróticas supone una importante carga para los sistemas sanitarios de los países de todo el mundo¹. La angioplastia con balón y la colocación de stents en las arterias coronarias se realizan de forma rutinaria en pacientes que padecen síndromes coronarios agudos, así como en pacientes sintomáticos con enfermedad arterial coronaria estable². La angioplastia con balón fue un invento revolucionario para revascularizar arterias coronarias estrechadas o incluso ocluidas. Los stents de las arterias coronarias mejoraron aún más los resultados de las intervenciones coronarias percutáneas (ICP) al prevenir el retroceso agudo de la arteria después de la angioplastia con balón³. Los resultados de las ICP mejoraron aún más con la introducción de stents liberadores de fármacos (DES) o stents recubiertos con medicación antiproliferativa para combatir la reestenosis dentro del stent (ISR), es decir, el reestrechamiento de un stent previamente desplegado. Los DES se han desarrollado aún más para tener puntales de stent más delgados pero más duraderos y polímeros biodegradables para la liberación de fármacos. Conceptualmente, la plataforma rígida del stent solo es necesaria durante unas pocas semanas o meses para evitar el retroceso de la arteria. Esto ha dado lugar a una nueva generación de dispositivos de andamios que son totalmente biodegradables. Los primeros stents y andamios biodegradables han tenido algunos contratiempos, ya que los estudios han informado de una mayor incidencia de trombosis del stent⁴. Como resultado, los stents biodegradables no se utilizan ampliamente.

Solo en los Estados Unidos se realizan casi un millón de PCI. El desarrollo de nuevos materiales y diseños de stents continuará a medida que más y más pacientes sean tratados intravascularmente. La evaluación de nuevos dispositivos requiere pruebas en un entorno biológicamente relevante, lo que requiere el uso de un modelo animal apropiado. Los modelos animales preclínicos son aún más esenciales cuando se estudian dispositivos biodegradables, ya que las propiedades de degradación de estos dispositivos pueden ser impredecibles. La evaluación debe realizarse en modelos animales grandes, en los que se puedan estudiar dispositivos lo suficientemente grandes como para ser utilizados por el paciente.

Describimos un modelo de arteria coronaria de cerdo y un modelo de aorta aterosclerótica de conejo para la evaluación preclínica del stent ^5,6. Ambos modelos pueden alojar dispositivos y equipos diseñados para uso clínico. Presentamos modalidades de imagen in vivo para la evaluación del rendimiento del stent, la trombosis del stent y la ISR. Además, mostramos métodos para el análisis histológico de tejidos plásticos incrustados, incluyendo la inmunohistología⁷.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Junta de Experimentos con Animales de Finlandia. Se utilizaron conejos blancos adultos de Nueva Zelanda (NZW) de 3,0 a 4,0 kg para el modelo de conejo aterosclerótico. Para el estudio coronario de cerdos, los animales pesaban entre 30 y 40 kg al inicio del experimento. El protocolo para el modelo aterosclerótico de conejo y el modelo de arteria coronaria de cerdo se describe por separado, seguido de la descripción de cómo se puede realizar la histología para los stents coronarios no degradables, independientemente del modelo in vivo utilizado.

1. Modelo aterosclerótico de conejo

NOTA: Para inducir cambios ateroscleróticos rápidos en la aorta, los animales se alimentan con una dieta alta en colesterol y las aortas se someten a una desendotelización antes de la implantación del stent. La colocación de stents y la toma de imágenes se realizan a través de las arterias carótidas, y los stents se procesan para la histología como se describe a continuación. La ecografía intravascular (IVUS) es más adecuada que la tomografía de coherencia óptica (OCT) para la aorta de conejo porque no es necesario el lavado arterial.

1. Dieta alta en colesterol (Figura 1)
   1. Convierta el alimento regular para conejos en alimento para conejos con alto contenido de colesterol agregando colesterol. Mezcle el colesterol en una parte de etanol y una parte de éter dietílico (250 g de colesterol por 2 L de EtOH al 96% y 2 L de éter dietílico) en un agitador magnético en un vaso de precipitados grande.
   2. Cuando el colesterol se haya disuelto, vierta la mezcla sobre 25 kg de alimento para conejos en un recipiente grande dentro de una campana. Mezcle el alimento varias veces al día durante 3-4 días hasta que la mezcla se haya secado.
   3. Esto producirá un alimento con un 1% de colesterol. Para producir un alimento con un 0,025% de colesterol, el alimento con un 1% de colesterol se mezcla con el alimento regular para conejos en una proporción de 1:40.
2. Denudación con balón de la aorta de conejo
   1. Mezcle la aspirina en el agua de bebida del conejo, comenzando 3 días antes de la lesión por denudación y continúe hasta el final del experimento (100 mg de aspirina por 1 L de agua de bebida). El agua se ofrece ad libitum.
   2. Anestesiar a los conejos con 0,3 mg/kg de medetomidina y 20 mg/kg de ketamina por vía subcutánea (s.c.). Retire el pelaje de la zona inguinal y de la zona interna del muslo de la pata trasera derecha con una maquinilla de aseo y esterilice la piel con un desinfectante a base de etanol.
   3. Administrar un antibiótico profiláctico perioperatorio (125 mg de cefuroxima s.c.).
   4. Aplique un anestésico local antes de las incisiones en la piel con 10 mg/mL de lidocaína s.c. a lo largo de la zona interna del muslo a lo largo del surco, que contiene los vasos sanguíneos principales y los nervios de la región femoral.
   5. Haga una incisión en la piel y avance con cuidado a través del tejido subcutáneo y los músculos de la pierna con tijeras de operación y tijeras de disección.
   6. Exponga la arteria femoral y sepárela de los tejidos circundantes y de la vena y el nervio.
   7. Pasar una sutura quirúrgica no reabsorbible 5-0 dos veces por debajo de la arteria en la arteria femoral proximal. Eleve la arteria cuidadosamente con la línea de sutura (no se hace ninguna ligadura, sino que la sutura quirúrgica se sujeta con un par de agujas o pinzas para mosquitos). Esta vía se utiliza para detener temporalmente el flujo sanguíneo hacia la arteria femoral.
   8. Pase una línea de sutura no reabsorbible 5-0 dos veces por debajo de la parte distal de la arteria femoral y ate firmemente una ligadura para ocluir la arteria femoral distal (por ejemplo, con un nudo de Miller).
   9. Realice una pequeña incisión o arteriotomía de 1-2 mm en la arteria con tijeras microquirúrgicas o un bisturí fino mientras un asistente sostiene y mantiene la arteria en su lugar desde las vías quirúrgicas proximales y distales.
   10. Inserte un catéter de balón de embolectomía Fogarty 3F en la arteria dirigiéndose proximalmente hacia la arteria ilíaca. Antes de la inserción, prepare el catéter de embolectomía conectándolo a una jeringa de 1 mL llena de 0,6 mL de aire (también se puede usar solución salina, pero un balón lleno de aire es más flexible). La línea quirúrgica proximal se baja para permitir el paso del catéter de embolectomía.
       NOTA: Para el procedimiento se utiliza un catéter de embolectomía Fogarty sin un lumen de alambre guía.
   11. Pase el catéter de embolectomía 30 cm dentro de la arteria (a juzgar por las marcas en el eje del catéter). Infle con la jeringa y tire del catéter inflado hasta que alcance al menos la bifurcación ilíaca, momento en el que se siente resistencia en el catéter.
   12. Desinflar el catéter de embolectomía y volver a introducirlo en la aorta. Repite el retroceso un total de tres veces.
   13. Una vez completada la denudación, retire el catéter de embolectomía y cierre la arteria femoral con la línea de sutura proximal. Por lo tanto, la arteria femoral se ocluirá después del procedimiento. Sin embargo, debido a la buena circulación colateral en la extremidad trasera del conejo, rara vez hay problemas de salud relacionados con la isquemia.
   14. Ligar el músculo que cubre la arteria femoral con suturas reabsorbibles 4-0, y la piel con una sutura intracutánea con una línea de sutura reabsorbible 4-0.
   15. Los animales son monitoreados hasta que están despiertos, alerta y bebiendo o alimentándose. Facilitar la recuperación de los conejos con el uso de una cámara climatizada con acceso a agua y heno.
   16. Administrar carprofeno después de los procedimientos quirúrgicos durante 1-3 días o más si es necesario (2 mg/kg s.c., una vez al día) para la analgesia.
3. Colocación de stents en la aorta de conejo
   1. Iniciar clopidogrel el día de la colocación del stent con una dosis de carga de 30 mg y continuar con 15 mg diarios hasta el final del experimento. Moler los comprimidos de clopidogrel en un mortero, mezclarlos con agua del grifo (5 mL de agua por un comprimido de clopidogrel de 75 mg; la dosis de carga es de 2 mL seguidos de 1 mL al día) y administrar a través de una sonda gástrica.
      NOTA: El clopidogrel no se disuelve completamente en el agua del grifo; Prepare una dosis nueva diariamente antes de medicar a los conejos. En este punto, asegúrese de que los conejos tomen aspirina diariamente después de la lesión por denudación.
   2. Anestesiar a los conejos con 0,3 mg/kg de medetomidina y 20 mg/kg de ketamina s.c.
   3. Administrar un antibiótico profiláctico perioperatorio (125 mg de cefuroxima s.c.).
   4. Retire el vello de la parte anterior del cuello con una maquinilla de afeitar y esterilice la piel con un desinfectante a base de etanol.
   5. Aplique lidocaína como anestésico local a lo largo de la línea media del cuello (3-5 mL) y haga un corte longitudinal de 4-5 cm a través de la piel.
   6. Abra el platisma cortando con tijeras de disección longitudinalmente. Coagular las arteriolas sangrantes pequeñas apretándolas con pinzas quirúrgicas o coagulándolas con un dispositivo de coagulación unipolar o bipolar.
   7. Se identifica un surco natural dentro de los músculos del cuello, entre el cual se encuentra la arteria carótida junto con el nervio vago (entre los músculos esternomastoideo y esternohioideo) (Figura 2A). Diseccionar la arteria cuidadosamente y separarla de otros tejidos. Se prefiere la arteria carótida derecha, ya que proporciona una línea de acceso más directa a la aorta descendente.
   8. Pase una línea de sutura no reabsorbible 5-0 dos veces por debajo de la parte distal de la arteria carótida y lige la arteria de forma segura. Sostenga la línea quirúrgica hacia arriba para elevar la parte distal de la arteria carótida.
   9. Pasar dos veces una vía quirúrgica no reabsorbible 5-0 por debajo de la parte proximal de la arteria carótida. Sin hacer una ligadura, use la línea quirúrgica proximal para levantar la arteria carótida y bloquear temporalmente el flujo sanguíneo a la arteria carótida en el área operativa.
   10. Realice una pequeña arteriotomía de 1-2 mm en la arteria carótida entre las líneas quirúrgicas con tijeras microquirúrgicas.
   11. Inserte una vaina introductora 5F o 6F completamente preparada en la dirección proximal.
       1. Enjuague la vaina con solución salina, inserte el dilatador en la vaina y enjuague antes de insertar la vaina en la arteria. Además, para facilitar el avance de la vaina, inserte un alambre guía corto a través del dilatador para hacer una punta cónica para la vaina.
       2. Una vez que la punta de la vaina (o más bien el dilatador) esté dentro de la arteria carótida, baje la línea quirúrgica proximal para permitir que la vaina pase a la arteria.
   12. Avance la vaina 2-3 cm en la arteria carótida.
   13. Retire el obturador y el alambre de la vaina del introductor.
   14. Confirme la colocación de la vaina en la arteria abriendo la válvula de la vaina y dejando salir una pequeña cantidad (1-2 ml) de sangre de la vaina.
   15. Enjuague la vaina con solución salina heparinizada (5000 UI por 1000 mL, NaCl al 0,9%) y sutura para asegurarla en los paños quirúrgicos o en la piel del conejo. Heparinizar al conejo administrando heparina no fraccionada a través de la vaina (150 UI/kg).
   16. Trasladar el animal a la mesa de cateterismo si la cirugía no se realizó en la mesa del laboratorio de cateterismo.
   17. Avance un alambre guía coronario delgado (0.014 pulgadas) a través de la vaina introductora y guíelo hacia la aorta descendente bajo fluoroscopia. Avance un catéter guía 5F sobre el alambre guía.
       NOTA: Se puede usar un catéter guía con una curva si uno tiene problemas para navegar desde la arteria carótida hasta la aorta descendente.
   18. Si se utilizó un catéter guía con una punta en ángulo para acceder a la aorta descendente, cámbielo por un catéter guía recto sobre el alambre guía para administrar stents o catéteres de diagnóstico por imágenes.
   19. Adquisición de una imagen angiográfica de la aorta abdominal mediante inyección de contraste a través del catéter guía con un agente de contraste a base de yodo (250-350 mgI/mL).
   20. Seleccionar una sección adecuada entre las arterias lumbares en la aorta infrarrenal para el despliegue del stent. Despliegue el stent en una proporción de 1,1:1 (el stent está ligeramente sobredimensionado con respecto a la arteria para evitar que el stent se mueva cuando se retira el catéter con balón) en la aorta con la ayuda de un indeflactor de acuerdo con las instrucciones del fabricante del stent (todos los stents montados en catéteres con balón tendrán una tabla de tamaños suministrada con el stent). Desinflar el balón y retirar el catéter del stent (Figura 2B).
   21. Realizar una angiografía repetida con el agente de contraste para confirmar la colocación del stent.
   22. Retire la vaina introductora después de la colocación de la endoprótesis y la toma de imágenes. Cierre la arteria con la línea de sutura proximal en la arteria carótida. Esto ocluirá completamente la arteria carótida.
   23. Cierre las capas musculares del cuello (generalmente dos capas de suturas) con suturas reabsorbibles 4-0 y la piel con suturas intracutáneas reabsorbibles 4-0.
   24. Monitorizar la recuperación del animal y administrar analgésicos como se describe en la operación de denudación con balón (pasos 1.2.15-1.2.16).
4. Diagnóstico por imágenes de la aorta de conejo con IVUS
   1. Adquiera acceso vascular y coloque un catéter guía recto en la aorta descendente como se describe para la operación de colocación de stents en la aorta de conejo.
      NOTA: Las imágenes se realizan en el momento de la colocación del stent a través del mismo acceso vascular. Se puede crear un segundo punto de tiempo de imagen utilizando la arteria carótida izquierda.
   2. Hacer avanzar el catéter de diagnóstico por imágenes a través de un alambre guía hacia la aorta distal más allá del segmento del stent (o donde se colocará el stent si se realizan imágenes previas a la colocación del stent).
   3. Realice un retroceso manualmente mientras se registran los datos de IVUS o inicie el retroceso automático (consulte las instrucciones del sistema IVUS). Durante el retroceso, la unidad de imagen se mueve sobre el área objetivo automáticamente si el sistema de imagen lo habilita o manualmente tirando del catéter de imagen sobre el área de interés (el stent) mientras registra los datos de imagen.
   4. Guarde los datos de imágenes y retire el catéter de imágenes, el alambre guía y el catéter guía.
   5. Retire la funda y cierre la herida quirúrgica como se describe para el procedimiento de colocación de stent (paso 1.3).
   6. Supervise la recuperación del animal como se describió anteriormente. Administre analgésicos como se ha descrito anteriormente (pasos 1.2.15-1.2.16).
5. Perfusión y fijación de tejidos (modelo de conejo)
   1. Sacrifique a los animales bajo anestesia con ketamina y medetomidina con una inyección intravenosa (i.v.) de 20-30 mL de sulfato de magnesio saturado (MgSO₄).
   2. Perfundir con solución salina o, si recolecta muestras solo para histología con una mezcla de paraformaldehído al 1%, usando una bomba dedicada.
   3. Perfundir la aorta de conejo insertando el sistema de perfusión a través de una aguja o cánula directamente en la aorta descendente por encima del nivel de la arteria renal o insertando la aguja a través del ventrículo izquierdo del corazón y dentro de la aorta (que perfundirá todo el animal).
   4. Aplique una pinza sobre la aorta donde está la punta de la aguja o cánula para asegurarla en la aorta durante el procedimiento de perfusión.
   5. Perfundir con 1000 mL (de la aorta descendente) o 1500 mL (desde la aorta ascendente a través del ventrículo izquierdo) de solución salina o PFA al 1%.
   6. Recoja el segmento de la aorta con stent diseccionándolo cuidadosamente de los tejidos circundantes.
      NOTA: Considere la posibilidad de recolectar segmentos proximales y distales de la aorta para la histología. Además, recoja los pañuelos de seguridad necesarios.
   7. Colocar los tejidos recolectados designados para el análisis histológico en paraformaldehído al 4% durante 4 h a temperatura ambiente (RT), o durante la noche a 4 °C.
   8. Para su posterior almacenamiento, transfiera a EtOH al 50 % a 4 °C durante 24 h y luego a EtOH al 70 % a 4 °C hasta que esté preparado para la histología.

2. Modelo de arteria coronaria de cerdo

NOTA: El corazón de cerdo se asemeja anatómica y fisiológicamente al corazón humano. Las arterias coronarias también son similares: discurren epicárdicamente y forman tres ramas coronarias principales (la arteria coronaria derecha (ACD) y la arteria coronaria izquierda (ACL), que a su vez se divide en la arteria coronaria ascendente izquierda (LAD) y la arteria circunfleja izquierda (LCX)). Este es un modelo en el que se colocan stents en las arterias coronarias de cerdos nativos y se toman imágenes intravasculares con OCT. Los cerdos se ayunan durante la noche antes de la anestesia.

1. Anestesia y acceso vascular para la colocación de stents coronarios y la obtención de imágenes en cerdos
   1. Sedar a los animales con azabonona (8 mg/kg por vía intramuscular (i.m.)) y atropina (0,05 mg/kg i.m.), e inducir y continuar la anestesia con propofol intravenoso (15 mg/kg/h) y fentanilo (10 μg/kg/h). Intuble a los animales y manténgalos conectados a un respirador durante todo el procedimiento.
   2. El acceso vascular se adquiere a través de la arteria femoral derecha. Localizar la arteria femoral con la ayuda de un transductor de ultrasonido (la arteria se puede distinguir de la vena por la pulsación arterial y por la compresión con el transductor).
   3. Bajo la guía de una ecografía, avance una aguja angiográfica en la arteria femoral.
   4. Una vez dentro de la arteria, un fuerte flujo sanguíneo pulsante llegará a través de la aguja. Introduzca una guía en la arteria y retire la aguja.
   5. Avance un introductor ensamblado y enjuagado del tamaño apropiado (generalmente 5F o 6F) en la arteria sobre el cable.
      NOTA: Tenga cuidado de mantener el cable visible en todo momento, para que no se pierda en la arteria.
   6. Retire el dilatador y el alambre de la vaina del introductor.
   7. Enjuague la vaina con solución salina heparinizada (5 UI/mL).
   8. Administrar 1 mg/kg de enoxaparina i.v. una vez realizado el acceso vascular.
   9. Administrar un antibiótico profiláctico para cada procedimiento invasivo (500 mg de cefuroxima i.m.).
2. Angiografía de la arteria coronaria porcina y colocación de stents
   1. Iniciar la medicación antitrombótica el día de la colocación del stent con una dosis de carga de 300 mg de aspirina por vía oral y una dosis de carga de 600 mg de clopidogrel por vía oral. Continúe con aspirina (100 mg diarios) y clopidogrel (75 mg diarios) hasta el final del experimento.
   2. Avance un alambre guía con punta en J bajo fluoroscopia hasta la aorta ascendente.
   3. Avance un catéter guía con un ángulo apropiado sobre el alambre en J y conecte las arterias coronarias derecha e izquierda (generalmente AR1 para la arteria coronaria derecha y AR2 para la arteria coronaria izquierda).
      NOTA: El catéter guía está conectado a un adaptador en Y y a un colector con una línea para al menos el agente de contraste para minimizar el riesgo de que entre aire en el sistema de imágenes.
   4. Realizar una angiografía coronaria inyectando un agente de contraste en la arteria coronaria.
      NOTA: Las imágenes deben realizarse desde al menos dos ángulos diferentes para cada arteria coronaria. Además, administrar nitrato intracoronario antes de la toma de imágenes (50-300 μL).
   5. Pase un alambre guía coronario (0.014 pulgadas) en el segmento coronario apropiado. Colocar el stent en el RCA y en el LCX o en la arteria marginal obtusa que se origina en el LCX.
      NOTA: El DA suele tener forma cónica, y un stent podría dejarse fácilmente sobreexpandido en la parte distal o subexpandido en el borde proximal. Se debe hacer una consideración cuidadosa de qué arterias coronarias se utilizan. Utilice el software de análisis de estenosis de la unidad de rayos X o las imágenes intravasculares para ayudar a elegir un buen segmento arterial y que coincida con el tamaño del stent.
   6. Avance el stent sobre el alambre guía y despliéguelo con un desinflador de acuerdo con las instrucciones del fabricante hasta una relación stent/arteria de 1,1:1, sobredimensionando ligeramente el stent en comparación con el diámetro de referencia de la arteria.
   7. Realizar la angiografía y las imágenes intravasculares repetidas si corresponde.
   8. Retire el equipo de cateterismo.
   9. Retire la vaina introductora y aplique presión en el lugar de la punción, ya sea manualmente o con la ayuda de un dispositivo de compresión femoral.
      NOTA: Los dispositivos de cierre vascular generalmente no funcionan bien en los cerdos debido a las diferencias en la anatomía de la pata trasera del cerdo en comparación con el hombre y al tamaño relativamente pequeño de la arteria femoral.
3. Imágenes por OCT de las arterias coronarias
   1. Realizar imágenes de OCT antes y después de la colocación del stent y durante el seguimiento. Para iniciar la toma de imágenes de OCT, adquiera acceso vascular, conecte la arteria coronaria objetivo con un catéter guía y avance distalmente un cable guía coronario en la arteria objetivo.
   2. Conecte el catéter de imágenes OCT a la base del sistema de imágenes.
      NOTA: Siga las instrucciones del sistema de diagnóstico por imágenes, ya que varían entre los fabricantes, así como entre las diferentes generaciones de catéteres de diagnóstico por imágenes.
   3. Cree un nuevo paciente para la grabación con el código de identificación de su elección.
   4. Enjuague la luz del catéter de diagnóstico por imágenes con un agente de contraste.
      NOTA: Las imágenes se pueden realizar con lavado con solución salina, pero pueden requerir cambios en la configuración de imagen del sistema para obtener resultados precisos.
   5. Inserte el sistema de monorraíl del catéter de imágenes sobre el alambre guía y avance los marcadores de imágenes del catéter hasta la ubicación de imagen deseada.
      NOTA: Asegúrese siempre de que el alambre guía avance lo suficiente en la arteria; No permita que los catéteres (imagenología, balón, stent) pasen más allá de la punta del alambre guía.
   6. Realizar imágenes. Incluir todo el stent, así como los vasos de referencia distal y proximal en el pullback.
      1. Enjuague la luz del catéter de diagnóstico por imágenes con un agente de contraste.
      2. Inicie la secuencia de retroceso automático.
      3. Enjuague la arteria coronaria con un bolo grande de agente de contraste a través del catéter guía (250-350 mgI/mL).
4. Perfusión y fijación de tejidos (modelo porcino)
   1. Bajo anestesia, el cerdo se sacrifica con un bolo intravenoso de 50-100 mL de cloruro de potasio saturado (KCl).
   2. Perfundir con solución salina o, si recolecta muestras solo para histología con una mezcla de paraformaldehído al 1%, usando una bomba dedicada.
   3. Perfunda todo el corazón del cerdo colocando una cánula o aguja conectada a la bomba de perfusión sin apretar en la aorta ascendente.
   4. Coloque una pinza fuera de la aorta para cerrar la aorta alrededor de la aguja/cánula.
      NOTA: Asegúrese de que las cúspides de la válvula aórtica estén abiertas para permitir que el líquido de perfusión fluya hacia las arterias coronarias.
   5. Perfundir con 750-1000 mL de líquido de perfusión elegido.
   6. Recoja los segmentos con stent de la arteria coronaria mediante una disección cuidadosa de los tejidos circundantes.
      NOTA: Considere la posibilidad de recolectar segmentos proximales y distales de la arteria coronaria para la histología. Además, recoja los pañuelos de seguridad necesarios.
   7. Colocar los tejidos recolectados designados para el análisis histológico en paraformaldehído al 4% durante 4 h a RT, o durante la noche a 4 °C.
   8. Para su posterior almacenamiento, transfiera a EtOH al 50 % a 4 °C durante 24 h y luego a EtOH al 70 % a 4 °C hasta que esté preparado para la histología.

3. Histología del stent

NOTA: La histología del stent de los stents metálicos no degradables requiere el uso de un sistema de inclusión de plástico y el corte de la muestra con un micrótomo especializado. El sistema de inclusión está disponible comercialmente, pero para permitir la inmunohistología basada en anticuerpos, es necesario realizar algunas modificaciones en el protocolo. El protocolo de inclusión es el mismo para todas las muestras, independientemente del modelo animal utilizado. Utilice un sistema de incrustación de plástico para el proceso de incrustación. Trabaje dentro de una capucha para todos los procedimientos de inclusión e histología.

1. Deshidratar las muestras de la solución de EtOH a xileno.
2. Siga el protocolo para el sistema de incrustación, con la excepción del uso de una solución básica desestabilizada a partir del segundo paso previo a la infiltración.
   NOTA: La solución básica se desestabiliza drenando a través del óxido de amonio.
3. Combine los líquidos de polimerización en frascos de muestra de plástico con los segmentos con stents.
   NOTA: Las arterias con stent se pueden fijar en su posición insertando una pequeña aguja a través del exterior del recipiente.
4. Aplicar vacío sobre las muestras durante 10-15 min y dejar polimerizar a 4 °C durante al menos 48 h.
5. Corta los bordes del bloque de plástico (especialmente si usas un molde cilíndrico) para crear superficies rectas. Esto permitirá una fijación segura al micrótomo.
6. Cortar con un micrótomo específico en secciones de 5-7 μm.
7. Dejar las secciones recién cortadas en EtOH al 50% durante 5-10 min.
8. Recoja las secciones del EtOH en portaobjetos de microscopía estándar (dos o tres secciones por portaobjetos).
9. Cubrir con dos o tres gotas de solución de Haupt y cubrir con una película de plástico. Coloque una capa de papel encima de la película de plástico y coloque un portaobjetos de vidrio vacío encima del papel.
10. Aplique presión sobre el portaobjetos durante al menos 24 h a 42 °C colocando los portaobjetos en un pequeño tornillo de banco de mesa mientras se acolchan con capas de papel.
11. Guarde las diapositivas en RT.
12. Antes de la tinción histológica, retire la resina plástica incubando los portaobjetos en metacrilato de metilo durante 24-48 h.
13. Claro en xileno (2 x 10 min de incubación) antes del procedimiento histológico o inmunohistológico estándar ^7,8.

Resultados

El éxito de la expansión del stent debe confirmarse con angiografía e, idealmente, con imágenes intravasculares (Figura 3A,B). El modelo de arteria coronaria de cerdo permite múltiples sesiones de imagen, y la OCT se puede utilizar para crear datos de seguimiento con imágenes frecuentes. La ISR y la expansión del stent, así como las posibles fracturas del puntal, pueden evaluarse fácilmente a partir de imágenes angiográficas y de ...

Discusión

Si bien la generación actual de stents coronarios liberadores de fármacos ha demostrado sus méritos, se están desarrollando nuevos dispositivos para adaptarse mejor a las necesidades de los pacientes y los profesionales de la salud. La primera ronda de andamios coronarios totalmente biodegradables se enfrentó a varios desafíos, lo que subraya aún más la importancia de probar nuevos dispositivos en modelos biológicamente relevantes⁹. Los modelos presentado...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiographic puncture needle	Cordis	12-004943
Aspirin Cardio 100 mg	Bayer
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Plavix	Sanofi		Clopidogrel
Coronary stent (bare metal, drug eluting, biodegradable)			Stent should be selected according to the study plan. Stent length 18-25mm and diameter 2.5-3.5mm
Domitor	Orion		medetomide
Dragonfly Optis OCT catheter	Abbott	C408646	Use catheter compatible with available imaging system
Enoxaparine	Sanofi		Clexane
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-M
Fentanyl	Biocodex
Guide wire, coronary	Cordis	507114
Guide wire, J tip	Cordis	502717
Guiding catheter AR1	Cordis	670-110-00
Guiding catheter AR2	Cordis	670-112-00
Guiding catheter straight	Cordis	55626090
Indeflator	Medtronic	AC3200	Indeflator for stent balloon inflation and deflation
Introducer sheath 5F	Cordis	504605P
Introducer Sheath 6F	Cordis	504606X
Ketalar	Pfizer		Ketamine
Microsurgical set	Mediq	FBL-SET	S&T , basic lab set for example
Paraformaldehyde	VWR	VWRRC28794.295	Prepare 1% and 4% solutions
Propofol	B. Braun
Suture	OneMed	JOH8685H	5-0, nonresorbable
Suture	OneMed	JOHFH1642H	4-0 resorbable
Technovit 9100	Kulzer
Ultrasound with linear transducer	Philips
Vacuum chamber	SP Bel-Art	F42043-0000
X-Ray contrast agent	Iomeron
Xylene	Sigma-Aldrich	534056