Доклиническая оценка стентов коронарных артерий

Резюме

Новые конструкции и материалы стентов коронарных артерий должны быть протестированы перед клиническим использованием в соответствующих доклинических моделях. Здесь мы описываем модель атеросклеротической аорты кролика и модель коронарной артерии свиньи для исследования стента с in vivo и гистологических анализов.

Аннотация

Ишемическая болезнь сердца является одним из основных факторов заболеваемости и смертности во всем мире. В то время как изменение образа жизни и прием лекарств являются краеугольными камнями лечения, баллонная ангиопластика коронарных артерий и стентирование обычно выполняются пациентам с острым коронарным синдромом и хронической ишемической болезнью сердца, у которых сохраняются симптомы при оптическом медицинском лечении. За последние десятилетия было разработано несколько поколений коронарных стентов. Баллонная ангиопластика и стентирование поддерживаются использованием фармацевтических препаратов, наносимых на баллоны и поверхность стента, либо для улучшения заживляющих свойств артерии после вмешательства, либо для предотвращения образования рестеноза. Новые устройства должны быть тщательно протестированы на безопасность и эффективность, прежде чем они будут приняты в клиническую практику; Таким образом, существует постоянная потребность в надежных и воспроизводимых доклинических методах оценки стентов. Мы описываем здесь модель коронарной артерии свиньи, а также атеросклеротическую модель кролика для исследования стента коронарных артерий, а также описываем основные этапы внутрисосудистой визуализации и гистологии стента.

Введение

Атеросклеротическая болезнь коронарных артерий создает значительную нагрузку на системы здравоохранения стран по всему миру¹. Баллонная ангиопластика коронарных артерий и стентирование обычно выполняются пациентам с острыми коронарными синдромами, а также симптоматическим пациентам со стабильной ишемической болезнью сердца². Баллонная ангиопластика была революционным изобретением для реваскуляризации суженных или даже окклюзированных коронарных артерий. Стенты коронарных артерий еще больше улучшили результаты чрескожных коронарных вмешательств (ЧКВ), предотвратив острый откат артерии после баллонной ангиопластики³. Результаты ЧКВ были дополнительно улучшены с введением стентов с лекарственным покрытием (ДЭС) или стентов, покрытых антипролиферативными препаратами, для борьбы с рестенозом стента (ISR) - повторным сужением ранее развернутого стента. Кроме того, DES имеют более тонкие, но более прочные стент-стойки и биоразлагаемые полимеры для высвобождения лекарств. Концептуально, жесткая платформа стента требуется всего на несколько недель или месяцев, чтобы предотвратить отдачу артерии. Это привело к появлению нового поколения строительных лесов, которые являются полностью биоразлагаемыми. Ранние биоразлагаемые стенты и скаффолды столкнулись с некоторыми трудностями, поскольку исследования сообщали о повышенной частоте тромбоза стента⁴. В результате биоразлагаемые стенты не получили широкого распространения.

Только в Соединенных Штатах ежегодно проводится почти миллион ЧКВ. Разработка новых материалов и конструкций стентов будет продолжаться, поскольку все больше и больше пациентов получают внутрисосудистое лечение. Оценка новых устройств требует тестирования в биологически значимой среде, что обуславливает необходимость использования соответствующей модели животного происхождения. Доклинические животные модели еще более важны при изучении биоразлагаемых устройств, поскольку свойства деградации этих устройств могут быть непредсказуемыми. Оценка должна проводиться на больших животных моделях, на которых могут быть изучены устройства, достаточно большие, чтобы их можно было использовать пациентом.

Здесь мы описываем модель коронарной артерии свиньи и модель атеросклеротической аорты кролика для доклинической оценки стента ^5,6. В обеих моделях могут размещаться приборы и оборудование, предназначенные для клинического использования. Мы представляем методы визуализации in vivo для оценки эффективности стента, тромбоза стента и ISR. Кроме того, показаны методы гистологических анализов пластических внедренных тканей, в том числе иммуногистология⁷.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Советом по экспериментам на животных в Финляндии. Взрослые кролики новозеландской белой породы весом 3,0-4,0 кг использовались для модели атеросклеротического кролика. Для исследования коронарных артерий свиней животные весили 30-40 кг в начале эксперимента. Отдельно описан протокол для атеросклеротической модели кролика и модели коронарной артерии свиньи, за которым следует описание того, как может быть выполнена гистология для неразрушаемых коронарных стентов, независимо от используемой модели in vivo .

1. Атеросклеротическая модель кролика

Примечание: Чтобы вызвать быстрые атеросклеротические изменения в аорте, животных кормят диетой с высоким содержанием холестерина, а аорты подвергаются деэндотелизации перед имплантацией стента. Стентирование и визуализация выполняются через сонные артерии, а стенты обрабатываются для гистологии, как описано ниже. Внутрисосудистое ультразвуковое исследование (ВСУЗИ) более подходит, чем оптическая когерентная томография (ОКТ) при аорте кроликов, поскольку нет необходимости в артериальном промывании.

1. Диета с высоким содержанием холестерина (Рисунок 1)
   1. Преобразуйте обычный корм для кроликов в корм с высоким содержанием холестерина, добавив в него холестерин. Смешайте холестерин с одной частью этанола и одной частью диэтилового эфира (250 г холестерина на 2 л 96% EtOH и 2 л диэтилового эфира) на магнитной мешалке в большой мензурке.
   2. Когда холестерин растворится, высыпьте смесь на 25 кг кроличьего корма в большой таз внутри вытяжки. Перемешивайте корм несколько раз в день в течение 3-4 дней, пока смесь не высохнет.
   3. Это позволит производить корм с 1% холестерина. Чтобы сделать корм с содержанием холестерина 0,025%, корм с содержанием холестерина 1% смешивают с обычным кормом для кроликов в соотношении 1:40.
2. Баллонная денудация аорты кролика
   1. Подмешайте аспирин в питьевую воду кролика, начиная за 3 дня до денудации повреждения и продолжайте до конца эксперимента (100 мг аспирина на 1 л питьевой воды). Вода предлагается в неограниченном количестве.
   2. Обезболивайте кроликов 0,3 мг/кг медетомидина и 20 мг/кг кетамина подкожно (подкожно). Удалите шерсть из паховой области и внутренней части бедра правой задней ноги с помощью машинок для стрижки и простерилизуйте кожу дезинфицирующим средством на основе этанола.
   3. Назначают периоперационный профилактический антибиотик (125 мг цефуроксима в.к.).
   4. Перед разрезами кожи нанесите местный анестетик с 10 мг/мл лидокаина в.к. вдоль внутренней части бедра вдоль борозды, в которой проходят основные кровеносные сосуды и нервы в бедренной области.
   5. Сделайте надрез кожи и осторожно пройдитесь по подкожной клетчатке и мышцам ног с помощью операционных ножниц и ножниц для рассечения.
   6. Обнажите бедренную артерию и отделите ее от окружающих тканей, а также вены и нерва.
   7. Дважды проведите нерассасывающийся хирургический шов 5-0 под артерию в проксимальном отделе бедренной артерии. Осторожно поднимите артерию с помощью линии шва (лигатура не делается, вместо этого хирургический шов проводится с помощью пары игольчатых наконечников или москитных щипцов). Эта капельница используется для временной остановки притока крови в бедренную артерию.
   8. Дважды проведите нерассасывающуюся линию шва 5-0 под дистальным отделом бедренной артерии и надежно завяжите лигатуру для окклюзии дистального отдела бедренной артерии (например, узлом Миллера).
   9. Сделайте небольшой разрез 1-2 мм или артериотомию в артерии микрохирургическими ножницами или тонким скальпелем, при этом артерия поддерживается и удерживается на месте от проксимальной и дистальной хирургических линий ассистентом.
   10. Введите баллонный катетер для эмболэктомии Фогарти 3F в артерию, направленную проксимально к подвздошной артерии. Перед введением подготовьте катетер для эмболэктомии, подсоединив его к шприцу объемом 1 мл, наполненному 0,6 мл воздуха (также можно использовать физраствор, но более подходит баллон, наполненный воздухом). Проксимальная операционная линия опускается, чтобы обеспечить прохождение катетера для эмболэктомии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для процедуры используется катетер для эмболэктомии Фогарти без просвета направляющей проволоки.
   11. Введите катетер для эмболэктомии на 30 см в артерию (судя по маркировке на стволе катетера). Надуйте шприц и потяните надутый катетер до тех пор, пока он не достигнет по крайней мере бифуркации подвздошной кости, после чего на катетере будет ощущаться сопротивление.
   12. Сдуйте эмболэктомический катетер и снова введите его в аорту. Повторите тягу назад в общей сложности три раза.
   13. После завершения денудации извлеките катетер эмболэктомии и закройте бедренную артерию проксимальной линией шва. Таким образом, бедренная артерия будет окклюзирована после процедуры. Тем не менее, из-за хорошего коллатерального кровообращения в задней конечности кролика, редко возникают какие-либо проблемы со здоровьем, связанные с ишемией.
   14. Перевязать мышцу, покрывающую бедренную артерию, рассасывающимися швами 4-0, а кожу – внутрикожным швом с рассасывающейся линией шва 4-0.
   15. За животными следят до тех пор, пока они не проснутся, не насторожятся и не начнут пить или кормить. Облегчить оздоровление кроликов можно с помощью отапливаемой камеры с доступом воды и сена.
   16. Назначайте карпрофен после хирургических процедур в течение 1-3 дней или дольше, если это необходимо (2 мг/кг в.к., один раз в день) для обезболивания.
3. Стентирование аорты кролика
   1. Начинают применять клопидогрел в день стентирования с ударной дозы 30 мг и продолжают принимать по 15 мг ежедневно до конца эксперимента. Таблетки клопидогрела измельчить в ступке, смешать с водопроводной водой (5 мл воды на одну таблетку клопидогрела 75 мг; ударная доза составляет 2 мл, затем 1 мл в день) и ввести через желудочный зонд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клопидогрел не растворяется полностью в водопроводной воде; Ежедневно принимайте свежую дозу перед медикаментозным лечением кроликов. На этом этапе убедитесь, что кролики ежедневно получают аспирин после денудации травмы.
   2. Обезболивайте кроликов 0,3 мг/кг медетомидина и 20 мг/кг кетамина в.к.
   3. Назначают периоперационный профилактический антибиотик (125 мг цефуроксима в.к.).
   4. Удалите волосы с передней стороны шеи с помощью машинки для бритья и простерилизуйте кожу дезинфицирующим средством на основе этанола.
   5. Нанесите лидокаин в качестве местного обезболивающего средства по средней линии шеи (3-5 мл) и сделайте продольный разрез на 4-5 см через кожу.
   6. Вскрыть платизму путем разрезания ножницами для рассечения в продольном направлении. Коагулируют небольшие кровоточащие артериолы путем сдавливания хирургическим пинцетом или коагуляции с помощью униполярного или биполярного коагуляционного аппарата.
   7. В мышцах шеи определяется естественная борозда, между которой находится сонная артерия вместе с блуждающим нервом (между грудино-сосцевидной и грудиноягодной мышцами) (рисунок 2А). Тщательно рассеките артерию и отделите ее от других тканей. Правая сонная артерия предпочтительна, так как она обеспечивает более прямую линию доступа к нисходящей аорте.
   8. Дважды проведите нерассасывающуюся линию шва 5-0 под дистальную часть сонной артерии и надежно перевяжите артерию. Удерживайте операционную капельницу вверх, чтобы приподнять дистальную часть сонной артерии.
   9. Дважды проведите нерезорбируемую хирургическую капельницу 5-0 под проксимальную часть сонной артерии. Не делая лигатуру, используйте проксимальную операционную капельницу для поднятия сонной артерии, чтобы временно блокировать приток крови к сонной артерии в операционной зоне.
   10. Микрохирургическими ножницами сделайте небольшую артериотомию размером 1-2 мм в сонную артерию между операционными линиями.
   11. Вставьте полностью подготовленную интродьюсерную оболочку 5F или 6F в проксимальное направление.
       1. Промойте влагалище физиологическим раствором, вставьте расширитель в оболочку и промойте перед введением оболочки в артерию. Кроме того, чтобы облегчить продвижение ножны, вставьте короткий направляющий провод через расширитель, чтобы получился конический наконечник для ножен.
       2. Как только кончик влагалища (или, скорее, расширитель) окажется внутри сонной артерии, опустите проксимальную хирургическую линию, чтобы позволить оболочке пройти в артерию.
   12. Продвигайте влагалище на 2-3 см в сонную артерию.
   13. Извлеките обтюратор и провод из оболочки интродьюсера.
   14. Подтвердите расположение оболочки в артерии, открыв клапан оболочки и выпустив небольшое количество (1-2 мл) крови из оболочки.
   15. Промойте влагалище гепаринизированным физиологическим раствором (5000 МЕ на 1000 мл, 0,9% NaCl) и зашвы, чтобы закрепить его в хирургических простынях или коже кролика. Гепаринизировать кролика путем введения нефракционированного гепарина через оболочку (150 МЕ/кг).
   16. Переместите животное на стол для катетеризации, если операция проводилась не на столе лаборатории катетеризации.
   17. Проведите тонкий проводник коронарных артерий (0,014 дюйма) через интродьюсерную оболочку и введите его в нисходящую аорту под рентгеноскопией. Наденьте направляющий катетер 5F на проводниковую проволоку.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Направляющий катетер с изгибом можно использовать, если у вас возникают проблемы с навигацией от сонной артерии к нисходящей аорте.
   18. Если для доступа к нисходящей аорте использовался направляющий катетер с наклонным наконечником, замените его на прямой направляющий катетер над направляющей проволокой для доставки стентов или визуализирующих катетеров.
   19. Получить ангиографическое изображение брюшной аорты путем введения контрастного вещества через ведущий катетер с контрастным веществом на основе йода (250-350 мгI/мл).
   20. Выберите подходящий участок между поясничными артериями в инфраренальной аорте для установки стента. Разверните стент в соотношении 1,1:1 (стент немного увеличен по отношению к артерии, чтобы предотвратить смещение стента при извлечении баллонного катетера) в аорту с помощью индефлятора в соответствии с инструкциями производителя стента (все стенты, установленные на баллонных катетерах, будут иметь таблицу размеров, поставляемую вместе со стентом). Сдуйте баллон и извлеките катетер стента (рисунок 2B).
   21. Проведите повторную ангиографию с контрастным веществом для подтверждения установки стента.
   22. Снимите тубус интродьюсера после стентирования и визуализации. Закройте артерию проксимальной линией швов в сонной артерии. Это приведет к полной закупорке сонной артерии.
   23. Закройте мышечные слои шеи (обычно два слоя швов) рассасывающимися 4-0 рассасывающимися внутрикожными швами, а кожу – рассасывающимися 4-0 внутрикожными швами.
   24. Следите за выздоровлением животного и вводите анальгетики, как описано в операции баллонной денудации (шаги 1.2.15-1.2.16).
4. Визуализация аорты кролика с ВСУЗИ
   1. Получите сосудистый доступ и установите прямой направляющий катетер в нисходящую аорту, как описано для операции стентирования аорты кролика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация проводится во время стентирования через тот же сосудистый доступ. Вторая временная точка визуализации может быть создана с помощью левой сонной артерии.
   2. Проведите катетер визуализации по направляющему проводу в дистальный отдел аорты за пределами стентируемого сегмента (или туда, где будет размещен стент, если выполняется визуализация перед стентированием).
   3. Выполните откат либо вручную, пока данные ВСУЗИ записываются, либо запустите автоматический откат (см. инструкции к системе ВСУЗИ). Во время оттягивания устройство визуализации перемещается над целевой областью автоматически, если это разрешено системой визуализации, или вручную, если катетер визуализации натягивается на исследуемую область (стент) во время записи данных визуализации.
   4. Сохраните данные визуализации и извлеките катетер для визуализации, направляющий провод и направляющий катетер.
   5. Снимите тубус и закройте операционную рану, как описано для процедуры стентирования (шаг 1.3).
   6. Следите за восстановлением животного, как описано ранее. Применяйте анальгетики в соответствии с описанными ранее действиями (шаги 1.2.15-1.2.16).
5. Перфузия и фиксация тканей (модель кролика)
   1. Умерните животных во время кетаминовой медетомидиновой анестезии с внутривенным введением 20-30 мл насыщенного сульфата магния (MgSO₄).
   2. Перфузируйте физиологическим раствором или при сборе образцов только для гистологии с 1% смесью параформальдегида, с помощью специального насоса.
   3. Перфузируйте аорту кролика, вводя систему перфузии через иглу или канюлю непосредственно в нисходящую аорту выше уровня почечной артерии или вводя иглу через левый желудочек сердца в аорту (что приведет к перфузии всего животного).
   4. Наложите зажим на аорту, где находится кончик иглы или канюли, чтобы закрепить его в аорте во время процедуры перфузии.
   5. Перфузия с 1000 мл (из нисходящей аорты) или 1500 мл (из восходящей аорты через левый желудочек) физиологического раствора или 1% PFA.
   6. Соберите стентированный сегмент аорты путем тщательного рассечения от окружающих тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность забора проксимальных и дистальных сегментов аорты для гистологии. Кроме того, соберите все необходимые защитные салфетки.
   7. Собранные ткани, предназначенные для гистологического анализа, поместить в 4% параформальдегид на 4 ч при комнатной температуре (RT) или на ночь при 4 °C.
   8. Для дальнейшего хранения перенесите до 50% EtOH при 4 °C на 24 ч, а затем до 70% EtOH при 4 °C до подготовки к гистологии.

2. Модель коронарной артерии свиньи

ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце свиньи анатомически и физиологически напоминает человеческое сердце. Коронарные артерии также схожи – они проходят эпикардиально и образуют три основные коронарные ветви (правую коронарную артерию (RCA) и левую коронарную артерию (LCA), которая далее делится на левую восходящую коронарную артерию (LAD) и левую огибающую артерию (LCX)). Ниже приведена модель со стентированием, выполненным на нативных коронарных артериях свиньи, и внутрисосудистой визуализацией, выполненной с помощью ОКТ. Свиней голодают на ночь перед анестезией.

1. Анестезия и сосудистый доступ для стентирования и визуализации коронарных артерий у свиней
   1. Усыпляют животных азапероном (8 мг/кг внутримышечно) и атропином (0,05 мг/кг в/м), а также вводят и продолжают анестезию внутривенным введением пропофола (15 мг/кг/ч) и фентанила (10 мкг/кг/ч). Интубируйте животных и держите их на аппарате искусственной вентиляции легких на протяжении всех процедур.
   2. Сосудистый доступ осуществляется через правую бедренную артерию. Определите местоположение бедренной артерии с помощью ультразвукового датчика (артерию можно отличить от вены по артериальной пульсации и сжатию с помощью датчика).
   3. Под ультразвуковым контролем введите ангиографическую иглу в бедренную артерию.
   4. Попав внутрь артерии, через иглу будет поступать сильный пульсирующий поток крови. Введите проводник в артерию и удалите иглу.
   5. Введите собранный и промытый проводник соответствующего размера (обычно 5F или 6F) в артерию по проводу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы провод всегда был виден, чтобы он не потерялся в артерии.
   6. Извлеките расширитель и провод из оболочки интродьюсера.
   7. Промойте оболочку гепаринизированным физиологическим раствором (5 МЕ/мл).
   8. Вводите 1 мг/кг эноксапарина в/в после достижения сосудистого доступа.
   9. Назначайте профилактический антибиотик для каждой инвазивной процедуры (500 мг цефуроксима в/м).
2. Ангиография коронарных артерий свиней и стентирование
   1. Начать прием антитромботических препаратов в день стентирования с ударной дозы 300 мг аспирина per os (po) и нагрузочной дозы 600 мг клопидогрела po. Продолжайте прием аспирина (100 мг в день) и клопидогрела (75 мг в день) до конца эксперимента.
   2. Под действием рентгеноскопии проведите с J-образным наконечником направляющую проволоку к восходящей аорте.
   3. Проведите направляющий катетер под соответствующим углом над J-образной проволокой и задействуйте правую и левую коронарные артерии (обычно AR1 для правой коронарной артерии и AR2 для левой коронарной артерии).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Направляющий катетер соединен с Y-образным адаптером и коллектором с трубопроводом по крайней мере для контрастного вещества, чтобы свести к минимуму риск попадания воздуха в систему визуализации.
   4. Проводят коронарографию путем введения контрастного вещества в коронарную артерию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация должна быть выполнена, по крайней мере, с двух разных углов для каждой коронарной артерии. Кроме того, перед визуализацией следует вводить нитраты внутрикоронарных артерий (50-300 мкл).
   5. Пропустите коронарный проводниковый провод (0,014 дюйма) в соответствующий коронарный сегмент. Поместите стент в RCA и LCX или тупую маргинальную артерию, идущую от LCX.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПМЖ часто имеет сужающуюся форму, и стент может быть легко оставлен либо чрезмерно расширенным в дистальной части, либо недорасширенным на проксимальном крае. Необходимо тщательно продумать, какие коронарные артерии используются. Используйте программное обеспечение для анализа стеноза рентгеновского аппарата или внутрисосудистую визуализацию, чтобы выбрать подходящий артериальный сегмент и подобрать размер стента.
   6. Наденьте стент на направляющую проволоку и разверните с помощью индефлятора в соответствии с инструкциями производителя с соотношением стента к артерии 1,1:1, немного увеличив размер стента по сравнению с референсным диаметром артерии.
   7. При необходимости выполните повторную ангиографию и внутрисосудистую визуализацию.
   8. Снимите оборудование для катетеризации.
   9. Снимите интродьюсерную оболочку и надавите на место прокола вручную или с помощью компрессионного устройства бедренной кости.
      Устройства для закрытия сосудов, как правило, не очень хорошо работают у свиней из-за различий в анатомии задней ноги свиньи по сравнению с человеком и относительно небольшого размера бедренной артерии.
3. ОКТ-визуализация коронарных артерий
   1. Выполняйте ОКТ-томографию до и после установки стента, а также во время последующего наблюдения. Чтобы начать ОКТ-томографию, получите сосудистый доступ, задействуйте целевую коронарную артерию с помощью направляющего катетера и продвигайте коронарный проводник дистально в целевой артерии.
   2. Подсоедините катетер ОКТ-визуализации к док-станции системы визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям системы визуализации, так как они различаются у разных производителей, а также у разных поколений катетеров для визуализации.
   3. Создайте нового пациента для записи с выбранным идентификационным кодом.
   4. Промойте просвет катетера визуализации контрастным веществом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация может быть выполнена с промывкой солевым раствором, но может потребовать изменения настроек изображения системы для получения точных результатов.
   5. Вставьте монорельсовую систему катетера для визуализации через направляющую проволоку и переместите маркеры визуализации катетера в нужное место визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда следите за тем, чтобы направляющая проволока продвигалась достаточно далеко в артерию; Не допускайте выхода катетеров (визуализационных, баллонных, стентических) за кончик направляющей проволоки.
   6. Выполните визуализацию. Включите весь стент, а также дистальные и проксимальные референсные сосуды в пулбэк.
      1. Промойте просвет катетера визуализации контрастным веществом.
      2. Запустите автоматическую последовательность отката.
      3. Промыть коронарную артерию большим болюсом контрастного вещества через направляющий катетер (250-350 мгI/мл).
4. Перфузия и фиксация тканей (модель свиньи)
   1. Под наркозом свинье приносят в жертву 50-100 мл в/в болюса насыщенного хлорида калия (KCl).
   2. Перфузируйте физиологическим раствором или при сборе образцов только для гистологии с 1% смесью параформальдегида, с помощью специального насоса.
   3. Перфузируйте все сердце свиньи, поместив канюлю или иглу, прикрепленную к перфузионному насосу, в восходящую аорту.
   4. Установите зажим снаружи аорты, чтобы закрыть аорту вокруг иглы/канюли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следит за тем, чтобы створки аортального клапана были открыты, чтобы перфузионная жидкость могла поступать в коронарные артерии.
   5. Перфузируйте 750-1000 мл выбранной перфузионной жидкости.
   6. Соберите стентированные сегменты коронарной артерии путем тщательного рассечения из окружающих тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность сбора проксимальных и дистальных сегментов коронарной артерии для гистологии. Кроме того, соберите все необходимые защитные салфетки.
   7. Собранные ткани, предназначенные для гистологического анализа, поместить в 4% параформальдегид на 4 ч в режиме РТ или на ночь при 4 °С.
   8. Для дальнейшего хранения перенесите до 50% EtOH при 4 °C на 24 ч, а затем до 70% EtOH при 4 °C до подготовки к гистологии.

3. Гистология стента

ПРИМЕЧАНИЕ: Стентология из неразлагаемых металлических стентов требует использования пластиковой системы встраивания и срезов образцов с помощью специализированного микротома. Встраиваемая система коммерчески доступна, но для проведения иммуногистологии на основе антител необходимо внести некоторые изменения в протокол. Протокол встраивания одинаков для всех образцов, независимо от используемой модели животного. Используйте пластиковую систему заделки для процесса заделки. Работайте внутри капюшона для всех процедур встраивания и гистологии.

1. Обезвоживайте образцы из раствора EtOH в ксилол.
2. Следуйте протоколу для системы внедрения, за исключением использования дестабилизированного базового раствора, начиная со второго этапа предварительной инфильтрации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Основной раствор дестабилизируется путем стекания через оксид аммония.
3. Смешайте жидкости полимеризации в пластиковых банках для образцов со стентированными сегментами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стентированные артерии можно зафиксировать в нужном положении, введя маленькую иглу через внешнюю часть контейнера.
4. Нанесите вакуум на образцы на 10-15 минут и оставьте полимеризоваться при температуре 4 °C не менее чем на 48 часов.
5. Отпиливают края пластикового блока (особенно если используют цилиндрическую форму) для создания прямых поверхностей. Это позволит надежно закрепить его на микротоме.
6. Разрежьте с помощью специального микротома на участки размером 5-7 мкм.
7. Оставьте свежесрезанные срезы в 50% EtOH на 5-10 минут.
8. Соберите срезы из EtOH на стандартные предметные стекла для микроскопии (два или три среза на предметное стекло).
9. Накройте двумя-тремя каплями раствора Хаупта и накройте полиэтиленовой пленкой. Положите слой бумаги поверх полиэтиленовой пленки и положите поверх бумаги пустое стеклозащитное стекло.
10. Прижмите предметное стекло не менее чем на 24 часа при температуре 42 °C, поместив слайды в небольшие настольные тиски, набив их слоями бумаги.
11. Храните слайды в RT.
12. Перед гистологическим окрашиванием следует удалить смолу на основе пластика, инкубировав предметные стекла в метилметакрилате в течение 24-48 часов.
13. Прозрачный раствор в ксилоле (2 x 10 мин инкубация) перед стандартной гистологической или иммуногистологической процедурой ^7,8.

Результаты

Успешное расширение стента должно быть подтверждено с помощью ангиографии и, в идеале, с помощью внутрисосудистой визуализации (Рисунок 3A, B). Модель коронарной артерии свиньи позволяет проводить несколько сеансов визуализации, а ОКТ может бы...

Обсуждение

В то время как нынешнее поколение коронарных стентов с лекарственным покрытием доказало свои достоинства, разрабатываются новые устройства, чтобы лучше соответствовать потребностям пациентов и медицинских работников. Первый раунд полностью биоразлагаемых коронар...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiographic puncture needle	Cordis	12-004943
Aspirin Cardio 100 mg	Bayer
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Plavix	Sanofi		Clopidogrel
Coronary stent (bare metal, drug eluting, biodegradable)			Stent should be selected according to the study plan. Stent length 18-25mm and diameter 2.5-3.5mm
Domitor	Orion		medetomide
Dragonfly Optis OCT catheter	Abbott	C408646	Use catheter compatible with available imaging system
Enoxaparine	Sanofi		Clexane
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-M
Fentanyl	Biocodex
Guide wire, coronary	Cordis	507114
Guide wire, J tip	Cordis	502717
Guiding catheter AR1	Cordis	670-110-00
Guiding catheter AR2	Cordis	670-112-00
Guiding catheter straight	Cordis	55626090
Indeflator	Medtronic	AC3200	Indeflator for stent balloon inflation and deflation
Introducer sheath 5F	Cordis	504605P
Introducer Sheath 6F	Cordis	504606X
Ketalar	Pfizer		Ketamine
Microsurgical set	Mediq	FBL-SET	S&T , basic lab set for example
Paraformaldehyde	VWR	VWRRC28794.295	Prepare 1% and 4% solutions
Propofol	B. Braun
Suture	OneMed	JOH8685H	5-0, nonresorbable
Suture	OneMed	JOHFH1642H	4-0 resorbable
Technovit 9100	Kulzer
Ultrasound with linear transducer	Philips
Vacuum chamber	SP Bel-Art	F42043-0000
X-Ray contrast agent	Iomeron
Xylene	Sigma-Aldrich	534056