Valutazione preclinica degli stent coronarici

Riepilogo

I nuovi design e materiali degli stent coronarici devono essere testati prima dell'uso clinico in modelli preclinici pertinenti. Qui descriviamo un modello di aorta di coniglio aterosclerotica e un modello di arteria coronarica di maiale per la ricerca di stent con analisi in vivo e istologiche.

Abstract

La malattia coronarica è uno dei principali fattori che contribuiscono alla morbilità e alla mortalità in tutto il mondo. Mentre i cambiamenti dello stile di vita e i farmaci sono i capisaldi del trattamento, l'angioplastica con palloncino coronarico e lo stent vengono eseguiti di routine su pazienti con sindromi coronariche acute e malattia coronarica cronica che rimangono sintomatici con il trattamento medico ottico. Negli ultimi decenni sono state sviluppate diverse generazioni di stent coronarici. L'angioplastica con palloncino e lo stent sono supportati dall'uso di agenti farmaceutici applicati sui palloncini e sulla superficie dello stent, sia per migliorare le proprietà di guarigione dell'arteria dopo l'intervento sia per prevenire la formazione di restenosi. I nuovi dispositivi devono essere rigorosamente testati per verificarne la sicurezza e l'efficacia prima di essere accettati nella pratica clinica; Pertanto, vi è una continua necessità di metodi preclinici affidabili e riproducibili per la valutazione dello stent. Descriviamo qui un modello di arteria coronarica di maiale e un modello di coniglio aterosclerotico per la ricerca sullo stent dell'arteria coronarica e descriviamo le fasi di base dell'imaging intravascolare e dell'istologia dello stent.

Introduzione

La coronaropatia aterosclerotica causa un onere significativo sui sistemi sanitari dei paesi di tutto il mondo¹. L'angioplastica con palloncino coronarico e lo stent vengono eseguiti di routine su pazienti affetti da sindromi coronariche acute e su pazienti sintomatici con malattia coronarica stabile². L'angioplastica con palloncino è stata un'invenzione rivoluzionaria per rivascolarizzare le arterie coronarie ristrette o addirittura occluse. Gli stent coronarici hanno ulteriormente migliorato i risultati degli interventi coronarici percutanei (PCI) prevenendo il rinculo acuto dell'arteria dopo l'angioplastica con palloncino³. I risultati dei PCI sono stati ulteriormente migliorati con l'introduzione di stent a rilascio di farmaco (DES) o stent rivestiti con farmaci antiproliferativi per combattere la restenosi intra-stent (ISR), il restringimento di uno stent precedentemente dispiegato. I DES sono stati ulteriormente sviluppati per avere montanti per stent più sottili ma più durevoli e polimeri biodegradabili per il rilascio di farmaci. Concettualmente, la piattaforma rigida dello stent è necessaria solo per alcune settimane o mesi per prevenire il rinculo dell'arteria. Ciò ha portato a una nuova generazione di dispositivi per ponteggi completamente biodegradabili. I primi stent e scaffold biodegradabili hanno incontrato alcune battute d'arresto, poiché gli studi hanno riportato un aumento dell'incidenza di trombosi dello stent⁴. Di conseguenza, gli stent biodegradabili non sono ampiamente utilizzati.

Quasi un milione di PCI vengono eseguiti ogni anno solo negli Stati Uniti. Lo sviluppo di nuovi materiali e design per gli stent continuerà man mano che sempre più pazienti vengono trattati per via intravascolare. La valutazione di nuovi dispositivi richiede test in un ambiente biologicamente rilevante, che richiede l'uso di un modello animale appropriato. I modelli animali preclinici sono ancora più essenziali quando si studiano dispositivi biodegradabili, poiché le proprietà di degradazione di questi dispositivi potrebbero essere imprevedibili. La valutazione deve essere eseguita in modelli animali di grandi dimensioni, in cui possono essere studiati dispositivi sufficientemente grandi da essere destinati all'uso da parte del paziente.

Descriviamo qui un modello di arteria coronarica di maiale e un modello di aorta di coniglio aterosclerotico per la valutazione preclinica dello stent ^5,6. Entrambi i modelli possono ospitare dispositivi e apparecchiature progettate per uso clinico. Presentiamo modalità di imaging in vivo per la valutazione delle prestazioni dello stent, della trombosi dello stent e dell'ISR. Inoltre, mostriamo metodi per l'analisi istologica di tessuti plastici incorporati, tra cui l'immunoistologia⁷.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Animal Experiment Board in Finlandia. Per il modello di coniglio aterosclerotico sono stati utilizzati conigli adulti di 3,0-4,0 kg di New Zealand White (NZW). Per lo studio coronarico del maiale, gli animali pesavano 30-40 kg all'inizio dell'esperimento. Il protocollo per il modello aterosclerotico di coniglio e il modello di arteria coronarica di maiale è descritto separatamente, seguito dalla descrizione di come l'istologia può essere eseguita per gli stent coronarici non degradabili, indipendentemente dal modello in vivo utilizzato.

1. Modello aterosclerotico di coniglio

NOTA: Per indurre rapidi cambiamenti aterosclerotici nell'aorta, gli animali vengono alimentati con una dieta ricca di colesterolo e le aorte subiscono la de-endotelizzazione prima dell'impianto dello stent. Lo stent e l'imaging vengono eseguiti attraverso le arterie carotidi e gli stent vengono processati per l'istologia come descritto di seguito. L'ecografia intravascolare (IVUS) è più adatta della tomografia a coerenza ottica (OCT) per l'aorta di coniglio perché non è necessario il lavaggio arterioso.

1. Dieta ad alto contenuto di colesterolo (Figura 1)
   1. Converti il normale mangime per conigli in mangime ad alto contenuto di colesterolo aggiungendo colesterolo. Mescolare il colesterolo in una parte di etanolo e in una parte di etere etilico (250 g di colesterolo in 2 L di EtOH al 96% e 2 L di etere etilico) su un agitatore magnetico in un grande becher.
   2. Quando il colesterolo si sarà sciolto, versare il composto su 25 kg di mangime per conigli in una bacinella capiente all'interno di una cappa. Mescolare il mangime più volte al giorno per 3-4 giorni fino a quando la miscela non si sarà asciugata.
   3. Questo produrrà un mangime con colesterolo dell'1%. Per produrre un mangime con colesterolo allo 0,025%, il mangime con colesterolo all'1% viene mescolato al normale mangime per conigli in un rapporto 1:40.
2. Denudazione con palloncino dell'aorta di coniglio
   1. Mescolare l'aspirina nell'acqua potabile del coniglio, iniziando 3 giorni prima della lesione da denudazione e continuando fino alla fine dell'esperimento (100 mg di aspirina per 1 litro di acqua potabile). L'acqua è offerta ad libitum.
   2. Anestetizzare i conigli con 0,3 mg/kg di medetomidina e 20 mg/kg di ketamina per via sottocutanea (s.c.). Rimuovere il pelo dalla zona inguinale e dall'interno coscia della zampa posteriore destra con un tosaerba e sterilizzare la pelle con un disinfettante a base di etanolo.
   3. Somministrare un antibiotico profilattico perioperatorio (125 mg di cefuroxima s.c.).
   4. Applicare un anestetico locale prima delle incisioni cutanee con 10 mg/mL di lidocaina s.c. lungo l'area interna della coscia lungo il solco, che contiene i principali vasi sanguigni e nervi nella regione femorale.
   5. Praticare un'incisione cutanea e avanzare con cautela attraverso il tessuto sottocutaneo e i muscoli delle gambe con le forbici operative e le forbici da dissezione.
   6. Esporre l'arteria femorale e separarla dai tessuti circostanti, dalla vena e dal nervo.
   7. Passare due volte una sutura chirurgica 5-0 non riassorbibile sotto l'arteria nell'arteria femorale prossimale. Sollevare l'arteria con attenzione con la linea di sutura (non viene eseguita alcuna legatura, piuttosto la sutura chirurgica viene tenuta con un paio di trascinatori di aghi o pinze per zanzare). Questa linea viene utilizzata per interrompere temporaneamente il flusso sanguigno nell'arteria femorale.
   8. Passare una linea di sutura non riassorbibile 5-0 due volte sotto la parte distale dell'arteria femorale e legare saldamente una legatura per occludere l'arteria femorale distale (ad esempio, con un nodo di Miller).
   9. Praticare una piccola incisione di 1-2 mm o un'arteriotomia nell'arteria con forbici microchirurgiche o un bisturi sottile mentre l'arteria è supportata e tenuta in posizione dalle linee chirurgiche prossimali e distali da un assistente.
   10. Inserire un catetere a palloncino per embolectomia Fogarty 3F nell'arteria dirigendosi prossimalmente verso l'arteria iliaca. Prima dell'inserimento, preparare il catetere per embolectomia collegandolo a una siringa da 1 ml riempita con 0,6 ml di aria (è possibile utilizzare anche soluzione fisiologica, ma un palloncino riempito d'aria è più conforme). La linea chirurgica prossimale viene abbassata per consentire il passaggio del catetere per embolectomia.
       NOTA: Per la procedura viene utilizzato un catetere per embolectomia Fogarty senza lume del filo guida.
   11. Passare il catetere per embolectomia per 30 cm nell'arteria (a giudicare dai segni sullo stelo del catetere). Gonfiare con la siringa e tirare il catetere gonfiato fino a raggiungere almeno la biforcazione iliaca, a quel punto si avverte resistenza sul catetere.
   12. Sgonfiare il catetere per embolectomia e reintrodurlo nell'aorta. Ripetere la tirata indietro per un totale di tre volte.
   13. Al termine della denudazione, estrarre il catetere per embolectomia e chiudere l'arteria femorale con la linea di sutura prossimale. L'arteria femorale sarà quindi occlusa dopo la procedura. Tuttavia, a causa della buona circolazione collaterale nell'arto posteriore del coniglio, raramente ci sono problemi di salute legati all'ischemia.
   14. Legare il muscolo che ricopre l'arteria femorale con suture riassorbibili 4-0 e la pelle con una sutura intracutanea con una linea di sutura riassorbibile 4-0.
   15. Gli animali vengono monitorati fino a quando non sono svegli, vigili e bevono o si nutrono. Facilita il recupero dei conigli con l'uso di una camera riscaldata con accesso all'acqua e al fieno.
   16. Somministrare carprofene dopo le procedure chirurgiche per 1-3 giorni o più a lungo se necessario (2 mg/kg s.c., una volta al giorno) per l'analgesia.
3. Stent dell'aorta del coniglio
   1. Iniziare con clopidogrel il giorno dello stent con una dose di carico di 30 mg e continuare con 15 mg al giorno fino alla fine dell'esperimento. Macinare le compresse di clopidogrel in un mortaio, mescolarle in acqua di rubinetto (5 ml di acqua per una compressa di clopidogrel da 75 mg; la dose di carico è di 2 ml seguita da 1 ml al giorno) e somministrare tramite un sondino gastrico.
      NOTA: Il clopidogrel non si dissolve completamente nell'acqua del rubinetto; Prepara una dose fresca ogni giorno prima di medicare i conigli. A questo punto, assicurati che i conigli assumano quotidianamente aspirina dopo la lesione da denudazione.
   2. Anestetizzare i conigli con 0,3 mg/kg di medetomidina e 20 mg/kg di ketamina s.c.
   3. Somministrare un antibiotico profilattico perioperatorio (125 mg di cefuroxima s.c.).
   4. Rimuovere i peli dalla parte anteriore del collo con un tagliacapelli da barba e sterilizzare la pelle con un disinfettante a base di etanolo.
   5. Applicare la lidocaina come anestetico locale lungo la linea mediana del collo (3-5 ml) e praticare un taglio longitudinale di 4-5 cm attraverso la pelle.
   6. Aprire il platisma tagliandolo longitudinalmente con le forbici da dissezione. Coagulare le piccole arteriole sanguinanti schiacciandole con una pinzetta chirurgica o coagulando con un dispositivo di coagulazione unipolare o bipolare.
   7. All'interno dei muscoli del collo viene identificato un solco naturale, tra il quale si possono trovare l'arteria carotide insieme al nervo vago (tra i muscoli sternomastoideo e sternoioide) (Figura 2A). Sezionare attentamente l'arteria e separarla dagli altri tessuti. L'arteria carotide destra è preferita in quanto fornisce una linea di accesso più diretta all'aorta discendente.
   8. Passare due volte una linea di sutura 5-0 non riassorbibile sotto la parte distale dell'arteria carotide e legare saldamente l'arteria. Tenere la linea chirurgica verso l'alto per sollevare la parte distale dell'arteria carotide.
   9. Passare una linea chirurgica 5-0 non riassorbibile due volte sotto la parte prossimale dell'arteria carotide. Senza eseguire una legatura, utilizzare la linea chirurgica prossimale per sollevare l'arteria carotide per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno all'arteria carotide nell'area operativa.
   10. Praticare una piccola arteriotomia di 1-2 mm nell'arteria carotide tra le linee chirurgiche con le forbici microchirurgiche.
   11. Inserire una guaina introduttrice 5F o 6F completamente preparata nella direzione prossimale.
       1. Sciacquare la guaina con soluzione fisiologica, inserire il dilatatore nella guaina e sciacquare prima di inserire la guaina nell'arteria. Inoltre, per facilitare l'avanzamento della guaina, inserire un filo guida corto attraverso il dilatatore per realizzare una punta affusolata per la guaina.
       2. Una volta che la punta della guaina (o meglio il dilatatore) si trova all'interno dell'arteria carotide, abbassare la linea chirurgica prossimale per permettere alla guaina di passare nell'arteria.
   12. Far avanzare la guaina di 2-3 cm nell'arteria carotide.
   13. Rimuovere l'otturatore e il filo dalla guaina dell'introduttore.
   14. Confermare il posizionamento della guaina nell'arteria aprendo la valvola della guaina e facendo uscire una piccola quantità (1-2 ml) di sangue dalla guaina.
   15. Sciacquare la guaina con soluzione fisiologica eparinizzata (5000 UI per 1000 mL, 0,9% NaCl) e suturarla per fissarla nei teli chirurgici o nella pelle del coniglio. Eparinizzare il coniglio somministrando eparina non frazionata attraverso la guaina (150 UI/kg).
   16. Spostare l'animale sul tavolo di cateterizzazione se l'intervento non è stato eseguito sul tavolo del laboratorio di cateterismo.
   17. Far avanzare un sottile filo guida coronarico (0,014 pollici) attraverso la guaina introduttrice e guidarlo nell'aorta discendente sotto fluoroscopia. Far avanzare un catetere guida 5F sul filo guida.
       NOTA: Un catetere guida con una curva può essere utilizzato se si hanno difficoltà a navigare dall'arteria carotide all'aorta discendente.
   18. Se è stato utilizzato un catetere guida con punta angolata per accedere all'aorta discendente, sostituirlo con un catetere guida dritto sopra il filo guida per erogare stent o cateteri per imaging.
   19. Acquisire un'immagine angiografica dell'aorta addominale mediante iniezione di contrasto attraverso il catetere guida con un mezzo di contrasto a base di iodio (250-350 mgI/mL).
   20. Selezionare una sezione adatta tra le arterie lombari nell'aorta infrarenale per il posizionamento dello stent. Distribuire lo stent con un rapporto 1,1:1 (lo stent è leggermente sovradimensionato rispetto all'arteria per evitare che lo stent si muova quando il catetere a palloncino viene ritirato) nell'aorta con l'aiuto di un indeflatore secondo le istruzioni del produttore dello stent (tutti gli stent montati su cateteri a palloncino avranno una tabella delle taglie fornita con lo stent). Sgonfiare il palloncino ed estrarre il catetere stent (Figura 2B).
   21. Eseguire un'angiografia ripetuta con l'agente di contrasto per confermare il posizionamento dello stent.
   22. Rimuovere la guaina dell'introduttore dopo lo stent e l'imaging. Chiudere l'arteria con la linea di sutura prossimale nell'arteria carotide. Questo occluderà completamente l'arteria carotide.
   23. Chiudere gli strati muscolari del collo (di solito due strati di suture) con suture riassorbibili 4-0 e la pelle con suture intracutanee riassorbibili 4-0.
   24. Monitorare il recupero dell'animale e somministrare analgesici come descritto nell'operazione di denudazione con palloncino (passaggi 1.2.15-1.2.16).
4. Imaging dell'aorta di coniglio con IVUS
   1. Acquisire l'accesso vascolare e posizionare un catetere guida dritto nell'aorta discendente come descritto per l'operazione di stent per l'aorta di coniglio.
      NOTA: L'imaging viene eseguito al momento dello stent tramite lo stesso accesso vascolare. Un secondo punto temporale di imaging può essere creato utilizzando l'arteria carotide sinistra.
   2. Far avanzare il catetere per imaging su un filo guida nell'aorta distale oltre il segmento con stent (o dove verrà posizionato lo stent se viene eseguita l'imaging pre-stent).
   3. Eseguire un pullback manualmente durante la registrazione dei dati IVUS o avviare il pullback automatico (vedere le istruzioni per il sistema IVUS). Durante il pullback, l'unità di imaging si sposta automaticamente sull'area target se abilitata dal sistema di imaging o manualmente tirando il catetere di imaging sull'area di interesse (lo stent) durante la registrazione dei dati di imaging.
   4. Salvare i dati di imaging e rimuovere il catetere di imaging, il filo guida e il catetere guida.
   5. Rimuovere la guaina e chiudere la ferita chirurgica come descritto per la procedura di stent (passaggio 1.3).
   6. Monitorare il recupero dell'animale come descritto in precedenza. Somministrare analgesici come descritto in precedenza (passaggi 1.2.15-1.2.16).
5. Perfusione e fissazione tissutale (modello di coniglio)
   1. Sacrificare gli animali durante l'anestesia ketamina-medetomidina con un'iniezione endovenosa di 20-30 ml di solfato di magnesio saturo (MgSO₄).
   2. Effettuare la perfusione con soluzione fisiologica, o se si raccolgono campioni solo per istologia con miscela di paraformaldeide all'1%, utilizzando una pompa dedicata.
   3. Perfondere l'aorta di coniglio inserendo il sistema di perfusione tramite un ago o una cannula direttamente nell'aorta discendente sopra il livello dell'arteria renale o inserendo l'ago attraverso il ventricolo sinistro del cuore e nell'aorta (che perfonderà l'intero animale).
   4. Applicare un morsetto sull'aorta dove si trova la punta dell'ago o della cannula per fissarlo nell'aorta durante la procedura di perfusione.
   5. Perfondere con 1000 mL (dall'aorta discendente) o 1500 mL (dall'aorta ascendente attraverso il ventricolo sinistro) di soluzione fisiologica o PFA all'1%.
   6. Raccogliere il segmento con stent dell'aorta sezionando attentamente dai tessuti circostanti.
      NOTA: Prendere in considerazione la raccolta di segmenti prossimali e distali dell'aorta per l'istologia. Inoltre, raccogli tutti i fazzoletti di sicurezza necessari.
   7. Immergere i tessuti raccolti e utilizzati per l'analisi istologica in paraformaldeide al 4% per 4 ore a temperatura ambiente (RT) o per una notte a 4 °C.
   8. Per un'ulteriore conservazione, trasferire al 50% di EtOH a 4 °C per 24 ore e poi al 70% di EtOH a 4 °C fino a quando non si prepara per l'istologia.

2. Modello di arteria coronarica di maiale

NOTA: Il cuore di maiale assomiglia anatomicamente e fisiologicamente al cuore umano. Anche le arterie coronarie sono simili: corrono epicardicamente e formano tre rami coronarici principali (l'arteria coronaria destra (RCA) e l'arteria coronaria sinistra (LCA), che si divide ulteriormente nell'arteria coronaria ascendente sinistra (LAD) e nell'arteria circonflessa sinistra (LCX)). Ecco un modello con stent eseguito alle arterie coronarie native del maiale e imaging intravascolare eseguito con OCT. I suini vengono digiunati durante la notte prima dell'anestesia.

1. Anestesia e accesso vascolare per lo stent coronarico e l'imaging del maiale
   1. Sedare gli animali con azaperone (8 mg/kg per via intramuscolare) e atropina (0,05 mg/kg i.m.) e indurre e continuare l'anestesia con propofol per via endovenosa (15 mg/kg/h) e fentanil (10 μg/kg/h). Intubare gli animali e tenerli su un ventilatore durante le procedure.
   2. L'accesso vascolare viene acquisito attraverso l'arteria femorale destra. Localizzare l'arteria femorale con l'ausilio di un trasduttore a ultrasuoni (l'arteria può essere distinta dalla vena dalla pulsazione arteriosa e dalla compressione con il trasduttore).
   3. Sotto guida ecografica, far avanzare un ago angiografico nell'arteria femorale.
   4. Una volta all'interno dell'arteria, un forte flusso sanguigno pulsante passerà attraverso l'ago. Far avanzare un filo guida nell'arteria e rimuovere l'ago.
   5. Far avanzare un introduttore assemblato e lavato di dimensioni adeguate (tipicamente 5F o 6F) nell'arteria sopra il filo.
      NOTA: Fare attenzione a mantenere il filo sempre visibile, in modo che non si perda nell'arteria.
   6. Rimuovere il dilatatore e il filo dalla guaina dell'introduttore.
   7. Sciacquare la guaina con soluzione fisiologica eparinizzata (5 UI/mL).
   8. Somministrare 1 mg/kg di enoxaparina e.v. una volta effettuato l'accesso vascolare.
   9. Somministrare un antibiotico profilattico per ogni procedura invasiva (500 mg di cefuroxima e.m.).
2. Angiografia e stent dell'arteria coronarica di maiale
   1. Iniziare il farmaco antitrombotico il giorno dello stent con una dose di carico di 300 mg di aspirina per os (po) e una dose di carico di 600 mg di clopidogrel po. Continuare con aspirina (100 mg al giorno) e clopidogrel (75 mg al giorno) fino alla fine dell'esperimento.
   2. Far avanzare un filo guida con punta a J in fluoroscopia fino all'aorta ascendente.
   3. Far avanzare un catetere guida con un angolo appropriato sul filo J e impegnare le arterie coronarie destra e sinistra (in genere AR1 per l'arteria coronaria destra e AR2 per l'arteria coronaria sinistra).
      NOTA: Il catetere guida è collegato a un adattatore a Y e a un collettore con una linea per almeno l'agente di contrasto per ridurre al minimo il rischio che l'aria entri nel sistema di imaging.
   4. Eseguire l'angiografia coronarica iniettando un mezzo di contrasto nell'arteria coronaria.
      NOTA: L'imaging deve essere eseguito da almeno due angolazioni diverse per ciascuna arteria coronaria. Inoltre, somministrare nitrato intracoronarico prima dell'imaging (50-300 μL).
   5. Far passare un filo guida coronarico (0,014 pollici) nel segmento coronarico appropriato. Posizionare lo stent nell'RCA e nell'LCX o nell'arteria marginale ottusa originata dall'LCX.
      NOTA: Il LAD è spesso di forma affusolata e uno stent potrebbe facilmente essere lasciato eccessivamente espanso nella parte distale o sottoespanso nel bordo prossimale. È necessario fare un'attenta considerazione di quali arterie coronarie vengono utilizzate. Utilizzare il software di analisi della stenosi dell'unità a raggi X o l'imaging intravascolare per scegliere un buon segmento arterioso e abbinare le dimensioni dello stent.
   6. Far avanzare lo stent sul filo guida e distribuirlo con un indeflatore secondo le istruzioni del produttore per un rapporto stent/arteria di 1,1:1, sovradimensionando leggermente lo stent rispetto al diametro di riferimento dell'arteria.
   7. Eseguire l'angiografia ripetuta e l'imaging intravascolare, se appropriato.
   8. Rimuovere l'apparecchiatura di cateterizzazione.
   9. Rimuovere la guaina introduttiva e applicare pressione sul sito di puntura manualmente o con l'ausilio di un dispositivo di compressione femorale.
      NOTA: I dispositivi di chiusura vascolare generalmente non funzionano bene nei suini a causa delle differenze nell'anatomia della zampa posteriore del maiale rispetto all'uomo e delle dimensioni relativamente piccole dell'arteria femorale.
3. Imaging OCT delle arterie coronarie
   1. Eseguire l'imaging OCT prima e dopo l'applicazione dello stent e durante il follow-up. Per avviare l'imaging OCT, acquisire l'accesso vascolare, impegnare l'arteria coronaria bersaglio con un catetere guida e far avanzare un filo guida coronarico distalmente nell'arteria bersaglio.
   2. Collegare il catetere di imaging OCT al dock del sistema di imaging.
      NOTA: Seguire le istruzioni del sistema di imaging in quanto variano tra i produttori e tra le diverse generazioni di cateteri per imaging.
   3. Creare un nuovo paziente per la registrazione con un codice ID a scelta.
   4. Lavare il lume del catetere di imaging con un mezzo di contrasto.
      NOTA: L'imaging può essere eseguito con il lavaggio con soluzione fisiologica, ma potrebbe richiedere la modifica delle impostazioni dell'immagine del sistema per ottenere risultati accurati.
   5. Inserire il sistema di catetere monorotaia sul filo guida e far avanzare i marcatori di imaging del catetere nella posizione di imaging desiderata.
      NOTA: Assicurarsi sempre che il filo guida avanzi abbastanza all'interno dell'arteria; Non lasciare che i cateteri (imaging, palloncino, stent) passino oltre la punta del filo guida.
   6. Eseguire l'imaging. Includere l'intero stent e i vasi di riferimento distali e prossimali nel pullback.
      1. Lavare il lume del catetere di imaging con un mezzo di contrasto.
      2. Avviare la sequenza di pullback automatico.
      3. Lavare l'arteria coronaria con un grande bolo di mezzo di contrasto attraverso il catetere guida (250-350 mgI/mL).
4. Perfusione e fissazione tissutale (modello suino)
   1. In anestesia, il maiale viene sacrificato con un bolo e.v. da 50-100 ml di cloruro di potassio saturo (KCl).
   2. Effettuare la perfusione con soluzione fisiologica, o se si raccolgono campioni solo per istologia con miscela di paraformaldeide all'1%, utilizzando una pompa dedicata.
   3. Perfondere l'intero cuore di maiale inserendo una cannula o un ago attaccato alla pompa di perfusione liberamente nell'aorta ascendente.
   4. Posizionare un morsetto all'esterno dell'aorta per chiudere l'aorta attorno all'ago/cannula.
      NOTA: Assicurarsi che le cuspidi della valvola aortica siano aperte per consentire al liquido di perfusione di fluire nelle arterie coronarie.
   5. Perfondere con 750-1000 mL di liquido di perfusione scelto.
   6. Raccogliere i segmenti con stent dell'arteria coronaria sezionandoli attentamente dai tessuti circostanti.
      NOTA: Prendere in considerazione la raccolta di segmenti prossimali e distali dell'arteria coronaria per l'istologia. Inoltre, raccogliere i fazzoletti di sicurezza necessari.
   7. Immergere i tessuti raccolti e destinati all'analisi istologica in paraformaldeide al 4% per 4 ore a RT o per una notte a 4 °C.
   8. Per un'ulteriore conservazione, trasferire al 50% di EtOH a 4 °C per 24 ore e poi al 70% di EtOH a 4 °C fino a quando non si prepara per l'istologia.

3. Istologia dello stent

NOTA: L'istologia dello stent da stent metallici non degradabili richiede l'uso di un sistema di inclusione in plastica e il sezionamento del campione con un microtomo specializzato. Il sistema di inclusione è disponibile in commercio, ma per consentire l'immunoistologia basata su anticorpi, è necessario apportare alcune modifiche al protocollo. Il protocollo di inclusione è lo stesso per tutti i campioni, indipendentemente dal modello animale utilizzato. Utilizzare un sistema di inclusione in plastica per il processo di inclusione. Lavora all'interno di una cappa per tutte le procedure di inclusione e istologia.

1. Disidratare i campioni dalla soluzione di EtOH in xilene.
2. Seguire il protocollo per il sistema di inclusione, ad eccezione dell'utilizzo di una soluzione basica destabilizzata a partire dalla seconda fase di pre-infiltrazione.
   NOTA: La soluzione basica viene destabilizzata mediante drenaggio attraverso l'ossido di ammonio.
3. Combinare i liquidi di polimerizzazione in barattoli di plastica per campioni con i segmenti con stent.
   NOTA: Le arterie con stent possono essere fissate in posizione inserendo un piccolo ago attraverso l'esterno del contenitore.
4. Applicare il vuoto sui campioni per 10-15 minuti e lasciare polimerizzare a 4 °C per almeno 48 ore.
5. Segare i bordi del blocco di plastica (soprattutto se si utilizza uno stampo cilindrico) per creare superfici diritte. Ciò consentirà un fissaggio sicuro al microtomo.
6. Tagliare con un microtomo dedicato in sezioni di 5-7 μm.
7. Lasciare le sezioni appena tagliate in EtOH al 50% per 5-10 minuti.
8. Raccogliere le sezioni dall'EtOH su vetrini per microscopia standard (due o tre sezioni per vetrino).
9. Coprire con due o tre gocce di soluzione di Haupt e coprire con una pellicola di plastica. Posizionare uno strato di carta sopra la pellicola di plastica e posizionare un vetrino vuoto sopra la carta.
10. Esercitare pressione sul vetrino per almeno 24 ore a 42 °C posizionando i vetrini in una piccola morsa da tavolo mentre sono imbottiti con strati di carta.
11. Conservare le diapositive su RT.
12. Prima della colorazione istologica, rimuovere la resina a base plastica incubando i vetrini in metacrilato di metile per 24-48 ore.
13. Chiaro in xilene (2 x 10 minuti di incubazione) prima della procedura istologica o immunoistologica standard ^7,8.

Risultati

Il successo dell'espansione dello stent deve essere confermato con l'angiografia e, idealmente, con l'imaging intravascolare (Figura 3A, B). Il modello dell'arteria coronarica di maiale consente più sessioni di imaging e l'OCT può essere utilizzato per creare dati di follow-up con imaging frequente. L'ISR e l'espansione dello stent e le possibili fratture del montante possono essere facilmente valutate dall'imaging angiografico e OCT. L'im...

Discussione

Mentre l'attuale generazione di stent coronarici a rilascio di farmaco ha dimostrato i suoi meriti, sono in fase di sviluppo nuovi dispositivi per soddisfare meglio le esigenze dei pazienti e degli operatori sanitari. Il primo ciclo di scaffold coronarici completamente biodegradabili ha affrontato diverse sfide, il che sottolinea ulteriormente l'importanza di testare nuovi dispositivi in modelli biologicamente rilevanti⁹. I modelli qui presentati offrono due opzio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiographic puncture needle	Cordis	12-004943
Aspirin Cardio 100 mg	Bayer
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Plavix	Sanofi		Clopidogrel
Coronary stent (bare metal, drug eluting, biodegradable)			Stent should be selected according to the study plan. Stent length 18-25mm and diameter 2.5-3.5mm
Domitor	Orion		medetomide
Dragonfly Optis OCT catheter	Abbott	C408646	Use catheter compatible with available imaging system
Enoxaparine	Sanofi		Clexane
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221-M
Fentanyl	Biocodex
Guide wire, coronary	Cordis	507114
Guide wire, J tip	Cordis	502717
Guiding catheter AR1	Cordis	670-110-00
Guiding catheter AR2	Cordis	670-112-00
Guiding catheter straight	Cordis	55626090
Indeflator	Medtronic	AC3200	Indeflator for stent balloon inflation and deflation
Introducer sheath 5F	Cordis	504605P
Introducer Sheath 6F	Cordis	504606X
Ketalar	Pfizer		Ketamine
Microsurgical set	Mediq	FBL-SET	S&T , basic lab set for example
Paraformaldehyde	VWR	VWRRC28794.295	Prepare 1% and 4% solutions
Propofol	B. Braun
Suture	OneMed	JOH8685H	5-0, nonresorbable
Suture	OneMed	JOHFH1642H	4-0 resorbable
Technovit 9100	Kulzer
Ultrasound with linear transducer	Philips
Vacuum chamber	SP Bel-Art	F42043-0000
X-Ray contrast agent	Iomeron
Xylene	Sigma-Aldrich	534056