内皮细胞转吞测定作为 体外 模型评估内部血-视网膜屏障通透性

摘要

该协议说明了 体外 内皮细胞转吞测定作为评估内部血 - 视网膜屏障通透性的模型，通过测量人视网膜微血管内皮细胞在洞穴介导的跨细胞运输过程中跨细胞运输辣根过氧化物酶的能力。

摘要

血液 - 视网膜屏障（BRB）的功能障碍有助于几种血管性眼病的病理生理学，通常导致视网膜水肿和随后的视力丧失。内部血视网膜屏障（iBRB）主要由生理条件下通透性较低的视网膜血管内皮组成。这种低通透性的特征受到严格调节，并通过相邻视网膜微血管内皮细胞之间的低细胞旁转运速率以及通过它们的跨细胞转运（转胞作用）来维持。视网膜跨细胞屏障通透性的评估可能为iBRB在健康和疾病中的完整性提供基本见解。在这项研究中，我们描述了一种内皮细胞（EC）转吞测定，作为使用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）评估iBRB通透性的 体外 模型。该测定分别评估了HRMEC在受体和洞穴介导的跨细胞运输过程中运输转铁蛋白和辣根过氧化物酶（HRP）的能力。将培养在多孔膜上的完全融合的HRMEC与荧光标记的转铁蛋白（网格蛋白依赖性转胞作用）或HRP（洞穴介导的转胞作用）一起孵育，以测量转移到底室的转铁蛋白或HRP的水平，指示EC单层的转吞水平。Wnt信号传导是一种已知的调节iBRB的途径，被调节以证明洞穴介导的基于HRP的转吞测定方法。此处描述的EC转吞测定可为研究血管病理学中EC通透性和iBRB完整性的分子调节因子以及筛选药物递送系统提供有用的工具。

引言

人类视网膜是人体中能量需求最高的组织之一。神经视网膜的正常运作需要有效的氧气和营养物质供应以及其他潜在有害分子的限制通量来保护视网膜环境，这是通过血液 - 视网膜屏障（BRB^）介导的1。与中枢神经系统中的血脑屏障（BBB）类似，BRB在眼睛中充当选择性屏障，调节离子，水，氨基酸和糖进出视网膜的运动。BRB还通过防止暴露于循环因子（如免疫细胞，抗体和有害病原体）来维持视网膜稳态及其免疫特权²。BRB 功能障碍有助于多种血管性眼病的病理生理学，例如糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性 （AMD）、早产儿视网膜病变 （ROP）、视网膜静脉阻塞和葡萄膜炎，导致血管源性水肿和随后的视力丧失³，^4，5。

BRB由两个独立的屏障组成，分别用于两个不同的眼血管网络:视网膜脉管系统和视网膜下方的开窗脉络膜毛细血管。内部BRB（iBRB）主要由视网膜微血管系统衬里的视网膜微血管内皮细胞（RMEC）组成，其滋养视网膜内部神经元层。另一方面，视网膜色素上皮形成外BRB的主要成分，位于神经感觉视网膜和脉络膜毛细血管^之间2。对于iBRB，跨RMEC的分子转运通过细胞旁和跨细胞途径发生（图1）。iBRB的高度物质选择性取决于（i）连接蛋白复合物的存在，这些复合物限制了相邻内皮细胞（ECs）之间的细胞旁转运，以及（ii）内皮细胞内保持低跨细胞转运速率的洞穴介质，转运蛋白和受体的低表达水平¹，⁶，^7，8.调节细胞旁通量的连接复合物由紧密连接（claudins，occludins），粘附连接（VE cadherins）和间隙连接（连接蛋白）组成，允许水和小的水溶性化合物通过。虽然小的亲脂性分子被动地扩散到RMEC的内部，但较大的亲脂性和亲水性分子的运动受到ATP驱动的跨内皮途径的调节，包括囊泡运输和膜转运蛋白^5，9。

水疱转胞作用可分为洞穴蛋白介导的洞穴转胞作用、网格蛋白依赖性（和受体介导的）转胞作用和网格蛋白依赖性巨胞细胞增多症（图 2）。这些囊泡转运过程涉及不同大小的囊泡，其中巨松体最大（范围为200-500nm），洞穴最小（平均为50-100nm），而网格蛋白包被的囊泡范围为70-150nm¹⁰。洞穴是带有蛋白质外壳的烧瓶形富含脂质的质膜内陷，主要由洞穴蛋白-1组成，其通过其洞穴蛋白支架结构域结合脂质膜胆固醇和其他结构和信号蛋白¹¹。洞穴与外周附着的洞穴一起工作，以促进质膜¹²处的洞穴稳定。洞穴膜还可能携带其他分子的受体，如胰岛素、白蛋白和循环脂蛋白，包括高密度脂蛋白 （HDL） 和低密度脂蛋白 （LDL），以帮助它们在内皮细胞中移动¹³。在发育过程中，功能性BRB的形成取决于EC转吞作用^的抑制8。因此，在生理条件下，成熟的视网膜内皮相对于其他内皮细胞具有相对较低的洞穴、洞穴蛋白-1 和白蛋白受体水平，这有助于其屏障特性^4，9。

由于iBRB分解是许多病理性眼病的主要标志，因此开发评估体内和体外视网膜血管通透性的方法至关重要。这些方法有助于提供对BRB完整性受损机制的可能见解，并评估潜在治疗靶点的疗效。目前的体内成像或定量血管渗漏测定通常采用荧光（荧光素钠和葡聚糖）、比色法（埃文斯蓝染料和辣根过氧化物酶[HRP]底物）或放射性示踪剂¹⁴，以通过显微镜成像或分离的组织裂解物检测从脉管系统外渗到周围视网膜组织中。用于量化血管完整性的理想示踪剂应该是惰性的，并且足够大，以便在限制在健康和完整的毛细血管内时自由渗透受损血管。在活眼底荧光素血管造影（FFA）或分离视网膜平面支架中使用荧光素钠或异硫氰酸荧光素偶联葡聚糖（FITC-葡聚糖）的方法广泛用于定量体内或离体视网膜外渗。FITC-葡聚糖的优点是具有不同的分子量范围，范围为4-70 kDa，用于大小选择性研究¹⁵，^16，17。FITC白蛋白（~68 kDa）是一种替代的大尺寸蛋白质示踪剂，与血管渗漏研究具有生物学相关性¹⁸。埃文斯蓝染料，心内注射¹⁹，眶后或通过尾静脉20，也依赖于其与内源性白蛋白的结合形成一个大分子，该分子可以通过大多数分光光度法检测或不太常见的荧光显微镜在平面安装^20，21中进行定量。然而，这些定量或光成像方法通常不能区分细胞旁转运和经内皮转运。对于通过转吞囊泡的超微结构可视化对转吞作用进行特异性分析，通常使用诸如HRP之类的示踪分子来定位内皮细胞内的转吞囊泡，可以在电子显微镜^{下观察到22}，^23，24（图3A-C）。

开发和使用体外iBRB模型来评估内皮细胞通透性可以提供稳健和高通量的评估，以补充体内实验，并有助于研究血管渗漏的分子调节因子。评估紧密连接的细胞旁转运和完整性的常用测定包括跨内皮电阻（TEER），离子电导的量度（图4）²，^25，以及使用小分子量荧光示踪剂的体外血管渗漏测定²⁶。此外，基于转铁蛋白的转胞作用测定建模BBB已被用于探索网格蛋白依赖性转吞²⁷。尽管如此，体外评估BRB和更具体地说，视网膜EC洞穴转吞作用的测定是有限的。

在这项研究中，我们描述了使用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）作为 体外 模型的EC转吞测定，以确定iBRB通透性和EC转吞作用。该测定依赖于HRMEC分别通过受体介导或洞穴依赖性转吞途径转运转铁蛋白或HRP的能力（图2）。将培养至在顶室（即滤芯）中完全汇合的HRMEC与荧光偶联转铁蛋白（Cy3-Tf）或HRP一起孵育，以测量对应于仅通过EC转吞作用转移到底室的转铁蛋白或HRP水平的荧光强度。通过测量TEER可以确认细胞单层的汇合度，表明紧密的连接完整性²⁵。为了证明TEER和转胞测定技术，使用了已知的血管通透性和EC转吞作用的分子调节剂，包括血管内皮生长因子（VEGF）²⁸ 和Wnt信号传导（Wnt配体:Wnt3a和Norrin）²⁹。

研究方案

所有动物实验均由波士顿儿童医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，用于生成光学显微镜和EM图像（图3）。 体内 研究的方案可以从Wang等人那里获得²⁴。所有涉及人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的实验均获得波士顿儿童医院机构生物安全委员会（IBC）的批准。

1. 试剂的制备

1. 用于包衣组织培养皿的溶液:通过将 1 mL 明胶储备溶液 （40%-50%） 溶解在 500 mL 无菌组织培养级 1x PBS （pH = 7.4） 中来制备 0.1% 明胶溶液。通过0.22μm过滤器过滤溶液。将0.1%明胶溶液储存在2-8°C。 它可以在无菌条件下在所述温度下无限期地储存。
2. 生长培养基:根据制造商的说明（材料表），通过将 EGM 补充剂溶解到内皮细胞生长基础培养基 （EBM） 中，制备 500 mL 内皮细胞生长完全培养基 （EGM）。将生长培养基分装到50mL管中，并将管储存在4°C。 生长培养基的保质期在4°C下为12个月。
3. 胰蛋白酶溶液:对于0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，将储备小瓶中的试样等分到50mL管中，并储存在4°C（最多2周）或-20°C（长达24个月）。

2. 培养HRMEC

1. 初始细胞培养
   1. 在层流罩下用5mL的0.1%明胶溶液涂覆细胞培养培养皿（直径100mmx 20mm高度），并在室温（RT）下将它们在罩中不受干扰30分钟以获得均匀的涂层。
      注意:培养皿的明胶涂层可增强细胞附着。或者，也可以使用明胶包衣的T75培养瓶。
   2. 在接种细胞之前，使用真空泵吸出明胶溶液。所用吸气器的真空压力高达 724 mmHg。
      注意:吸液必须在接种细胞之前立即进行，以防止涂层溶液变干。
   3. 通过使用37°C的水浴或向小瓶中加入温热的生长培养基来解冻冷冻的HRMECs（来自液氮储存）。解冻后，将细胞悬液转移到 9 mL 生长培养基中（假设解冻的 HRMEC 小瓶为 1 mL）。
      注:HRMEC是商业获得的（材料表）。添加到细胞中的生长培养基在使用前应始终预热至37°C。
   4. 在室温下以200× g 旋转细胞5分钟，并小心吸出上清液以避免去除细胞沉淀。
   5. 将细胞沉淀重悬于10mL生长培养基中，并将所得悬浮液转移到明胶包被的培养皿上。将细胞保持在37°C和5%CO₂的培养箱中。通常，HRMEC在72小时后融合70%-80%。
      注意:生长培养基每隔一天更换一次。
2. HRMEC在渗透膜插入物上的传代培养
   1. 准备细胞培养过滤器插入物（6.5 mm插入物，具有0.4μm孔径聚碳酸酯膜，放置在24孔板中），通过在层流罩下用200μL0.1%明胶溶液涂覆每个插入物（顶端室）30分钟来接种HRMEC。确保溶液覆盖过滤器插件的整个底面。
      注意:每个孔都有一个由多孔膜隔开的顶端和基底外侧室。
   2. 从培养箱中取出带有培养的HRMEC（步骤2.1.5）的培养皿并吸出生长培养基。在层流罩下用 10 mL 的 1x PBS 轻轻冲洗细胞 2 倍，以去除潜在的漂浮/死细胞。
   3. 用0.5-1mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液解离细胞，并将培养皿置于培养箱（37°C和5%CO₂）中5分钟。
   4. 通过加入 4.5-9 mL 生长培养基淬灭胰蛋白酶活性，并使用 10 mL 移液器将细胞悬液转移到 15 mL 管中。
   5. 在室温下以200× g 旋转细胞5分钟，小心地除去上清液，并将沉淀重悬于3mL生长培养基中。
   6. 使用手动血细胞计数器或自动细胞计数器和种子计数细胞数，密度为4 x 10 每个过滤器插入物4个细胞（即1.25 x 10^5个细胞/ cm²）。每个插入片段的细胞悬液体积为 250 μL。
   7. 从含有渗透性插入物的孔中吸出涂层溶液，每个插入物（顶端室）转移 250 μL 细胞悬液。仅将培养基（即没有细胞）添加到其中一个插入物中，该插入物将用作TEER测量的"空白对照"。同时，在基底外侧室中每孔加入 750 μL 培养基。
   8. 将带有渗透性插入物的24孔板在培养箱（37°C和5%CO₂）中保持7-12天，直到培养的细胞完全汇合并达到所需的TEER值~20 Ω·cm² 。
   9. 每隔一天更换一次生长培养基。在更换培养基期间，小心吸出培养基以最大程度地减少细胞单层的破坏，并分别向顶端和基底外侧室中每孔添加 250 μL 和 750 μL 新鲜培养基。
      注意:孔的顶端和基底外侧室均更换生长培养基。

3. TEER 测量（图 4）

1. 在细胞接种后第14天（步骤2.2.9.），使用上皮伏欧姆表（EVOM）电阻（ER）系统（材料表）测量HRMEC的TEER，如下所示。
2. 对 ER 系统进行预充电，并使用 STX04 测试电极检查仪表功能。如果需要，请校准。
3. 将电极连接到仪表并通过首先将其浸泡在70%乙醇中15-20分钟，然后将其短暂浸入细胞培养EGM生长培养基中来平衡电极。
4. 同时，将含有细胞的24孔板保持在室温的层流罩中15-20分钟以进行温度平衡。
   注意:TEER 测量受温度影响，因此平衡步骤至关重要。
5. 对于TEER测量，将新鲜生长培养基添加到孔的顶端（250μL）和基底外侧（750μL）室中。
6. 通过小心地浸入电极进行TEER测量，使较短的尖端在插入物中，较长的尖端接触孔的底部。首先测量空白控件上的电阻。对于每个插入物，一式三份测量TEER。
   注意:为了在测量之间冲洗电极，使用培养基。确保电极与插件底部成 90° 角，以获得稳定的读数。
7. 使用公式计算单层上的电阻（单位为 Ω·cm 2），TEER = 净电阻 （^Ω） x 滤芯表面积 （cm²）;在这里，净电阻是每个孔（带细胞的生长培养基）和空白孔（仅生长培养基）的电阻之间的差异。
8. 仅在TEER值达到~20 Ω·cm²后对细胞进行进一步处理。如果未达到所需的TEER水平，请将板保存在培养箱中，并在第二天测量TEER。
   注意:HRMEC汇合性也可以通过具有典型鹅卵石形态的细胞形状形态学检查（在显微镜下）和/或通过单独免疫组织化学染色的细胞连接蛋白的存在来验证。

4. 转吞试验

1. 使用Cy3标记的转铁蛋白进行Clathrin介导 的体外 转吞试验（图5）
   1. 在达到TEER值约20 Ω·cm 2的汇合时，血清在37°C和5%CO₂下在EBM（血清还原培养基）中使用0.5%FBS在两个腔室（顶端室:250μL和基底外侧室:750μL）中剥夺细胞24小时，然后再用配体处理。在整个测定过程中使用血清减少的EBM。
   2. 将细胞（使用步骤4.1.1中的血清还原培养基）在顶端室中与荧光（花青3）标记的转铁蛋白配体（Cy3-Tf）（终浓度为40μg/ mL）在37°C下孵育60分钟。
      注意:含有Cy3-Tf的板应避光，以避免Cy3-Tf的光漂白，方法是将铝箔包裹在铝箔中，并在关灯的细胞培养罩中进行实验。
   3. 1小时后，将板放在冰上，并在室温下用血清还原培养基顶端和基底外侧洗涤单层4x（每次洗涤3-5分钟），以除去游离的未结合Cy3-Tf。
      注意:洗涤对于去除游离示踪分子并准确读取转吞作用至关重要，而不会从细胞旁途径泄漏。
   4. 将新鲜血清还原培养基（如步骤4.1.1.1）加入到含有细胞的彻底洗涤的过滤器插入物中，并将插入物转移到含有预热血清还原培养基的24孔板的新鲜孔中。
   5. 将细胞在培养箱（37°C和5%CO₂）中再孵育90分钟，然后从基底外侧室收集培养基。
   6. 使用荧光检测器记录来自基底外侧室的溶液的荧光强度。以相对荧光单位（RFU）测量的荧光强度水平表示通过网格蛋白依赖性转吞作用跨HRMEC单层的Cy3-Tf复合物的量。
2. 使用HRP进行洞穴介导 的体外 转吞试验（图6）
   1. 在TEER值达到约20 Ω·cm 2的完全汇合时，在处理前使用含0.5%FBS的EBM培养基（血清还原培养基）在37°C和5%CO²下剥夺细胞24小时（如步骤4.1.1）。在整个测定过程中使用血清还原EBM培养基。
   2. 用所需的处理和载体对照处理顶端室中的细胞。
      注意:在这里，我们使用Wnt调节剂作为示例来证明HRMEC中Wnt信号通路对洞穴介导的转吞作用的调节:人重组Norrin和Wnt抑制剂XAV939。在典型的实验中，将细胞在培养箱（37°C和5%CO₂）中处理24小时，浓度如下:诺林（125ng / mL），诺林（125ng / mL）+ XAV939（10μM）和载体对照溶液。此外，还使用了Wnt3a条件培养基（由L Wnt-3A细胞产生）。
   3. 将细胞在顶端室中用HRP（5mg / mL）在37°C孵育15分钟。
   4. 之后，将24孔板放在冰上，并用P缓冲液（10mM HEPES pH = 7.4，1mM丙酮酸钠，10mM葡萄糖，3mM CaCl₂，145mM NaCl）密集洗涤顶端和基底外侧室6x，以去除游离细胞外HRP。
      注意:洗涤对于去除游离示踪分子并准确读取转吞作用至关重要，而不会从细胞旁途径泄漏。
   5. 向顶室中加入新鲜的血清还原培养基（如步骤4.1.1.），并将插入物转移到含有预热培养基的新鲜孔中。
   6. 将单层在培养箱中在37°C和5%CO₂ 下再孵育90分钟，然后从基底外侧室收集培养基。
   7. 按照制造商的说明向收集的培养基中加入 100 μL HRP 荧光过氧化物酶底物（材料表），并在室温下孵育 10 分钟，然后用 100 μL 停止溶液停止反应。
   8. 使用荧光酶标仪检测培养基中HRP底物反应产物的水平。测量 420 nm 发射波长（325 nm 激发）和相对荧光单位 （RFU） 下的荧光强度。这些值表示通过洞穴介导的转吞作用跨HRMEC层的HRP转胞水平。
      注意:此处使用的荧光产品（材料表）不进行光漂白。不需要光保护以防止光漂白。

结果

视网膜血管内皮的EM图像显示体内内皮细胞中的转细胞囊泡转运和海绵囊泡。
EC转吞可以在体内视网膜横截面内可视化，深棕色沉淀物在光学显微镜下反射含HRP的血管（图3A），并使用透射电子显微镜（TEM）作为指示含HRP的跨胞细胞囊泡的电子致密沉淀物（图3B，C），从而证明EC在iBRB上?...

讨论

BRB在视网膜健康和疾病中起着至关重要的作用。评估血管通透性的体外技术已被证明是屏障（BRB/BBB）发育和功能研究中的关键工具。这里描述的程序可用于研究EC转吞作用的分子机制或评估影响BRB通透性的相关分子调节剂。体外EC转吞测定与体内测定或用于评估血管通透性的技术相比具有多种优势。它们以高通量快速执行，可用于分析具有遗传和药理调节的特定信号通路的许?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinet	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	1286
Cell culture petridish	Nest Biotechnology	704001
Centrifuge	Eppendorf	5702
Centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc.	352097
Centrifuge tubes (50 mL)	Denville Scientific Inc.	C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin	Jackson ImmunoResearch	AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)	Lonza Bioscience	CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements	Lonza Bioscience	CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)	Millipore	MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)	Lonza Bioscience	CC-4102B
Gelatin	Sigma-Aldrich	G7765
Hemocytometer (2-chip)	Bulldog Bio	DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)	Sigma-Aldrich	P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)	Cell Systems	ACBRI 181
Incubator	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	3110
L cells (for Control-conditioned medium)	ATCC	CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)	ATCC	CRL-2647
Light microscope	Leica	DMi1
Multimode Plate Reader	EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)	GIBCO	10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit	Thermo Fisher Scientific	15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)	R&D Systems	3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)	R&D Systems	293-VE
Syringe filter (0.22 µm)	Millipore	SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)	Corning Inc.	CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)	GIBCO	25-200-072
Water bath	Precision, Thermo Fisher Scientific	51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)	Selleckchem	S1180