Saggio di transcitosi delle cellule endoteliali come modello in vitro per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna

Riepilogo

Questo protocollo illustra un test di transcitosi delle cellule endoteliali in vitro come modello per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna misurando la capacità delle cellule endoteliali microvascolari retiniche umane di trasportare la perossidasi di rafano attraverso le cellule nei processi di trasporto transcellulare mediati da caveole.

Abstract

La disfunzione della barriera emato-retinica (BRB) contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie vascolari dell'occhio, spesso con conseguente edema retinico e conseguente perdita della vista. La barriera emato-retinica interna (iBRB) è composta principalmente da endotelio vascolare retinico con bassa permeabilità in condizioni fisiologiche. Questa caratteristica di bassa permeabilità è strettamente regolata e mantenuta da bassi tassi di trasporto paracellulare tra cellule endoteliali microvascolari retiniche adiacenti, nonché trasporto transcellulare (transcitosi) attraverso di esse. La valutazione della permeabilità della barriera transcellulare retinica può fornire informazioni fondamentali sull'integrità dell'iBRB in salute e malattia. In questo studio, descriviamo un test di transcitosi delle cellule endoteliali (EC), come modello in vitro per valutare la permeabilità all'iBRB, utilizzando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC). Questo test valuta la capacità degli HRMEC di trasportare la transferrina e la perossidasi di rafano (HRP) nei processi di trasporto transcellulare mediati dal recettore e dalle caveole, rispettivamente. Gli HRMEC completamente confluenti coltivati su membrana porosa sono stati incubati con transferrina marcata con fluorescenza (transcitosi clatrin-dipendente) o HRP (transcitosi mediata da caveole) per misurare i livelli di transferrina o HRP trasferiti nella camera inferiore, indicativi dei livelli di transcitosi attraverso il monostrato EC. La segnalazione Wnt, una via nota che regola l'iBRB, è stata modulata per dimostrare il metodo di analisi della transcitosi basato su HRP mediato da caveolae. Il test di transcitosi EC qui descritto può fornire uno strumento utile per studiare i regolatori molecolari della permeabilità EC e dell'integrità di iBRB nelle patologie vascolari e per lo screening dei sistemi di somministrazione dei farmaci.

Introduzione

La retina umana è uno dei tessuti più esigenti in termini di energia nel corpo. Il corretto funzionamento della retina neurale richiede un efficiente apporto di ossigeno e sostanze nutritive insieme a un flusso limitato di altre molecole potenzialmente dannose per proteggere l'ambiente retinico, che è mediato attraverso la barriera emato-retinica (BRB)¹. Simile alla barriera emato-encefalica (BBB) nel sistema nervoso centrale, il BRB agisce come una barriera selettiva nell'occhio, regolando il movimento di ioni, acqua, aminoacidi e zucchero dentro e fuori dalla retina. BRB mantiene anche l'omeostasi retinica e il suo privilegio immunitario prevenendo l'esposizione a fattori circolatori come cellule immunitarie, anticorpi e agenti patogeni nocivi². La disfunzione BRB contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie vascolari dell'occhio, come la retinopatia diabetica, la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la retinopatia della prematurità (ROP), l'occlusione venosa retinica e l'uveite, con conseguente edema vasogenico e conseguente perdita della vista ^3,4,5.

Il BRB è costituito da due barriere separate per due distinte reti vascolari oculari, rispettivamente: la vascolarizzazione retinica e il coriocapillare fenestrato sotto la retina. Il BRB interno (iBRB) è composto principalmente da cellule endoteliali microvascolari retiniche (RMEC) che rivestono la microvascolarizzazione retinica, che nutre gli strati neuronali retinici interni. D'altra parte, l'epitelio pigmentato retinico costituisce il componente principale del BRB esterno, che si trova tra la retina neurosensoriale e il coriocapillare². Per l'iBRB, il trasporto molecolare attraverso le RMEC avviene attraverso entrambe le vie paracellulari e transcellulari (Figura 1). L'alto grado di selettività della sostanza attraverso l'iBRB si basa su (i) la presenza di complessi proteici giunzionali che limitano il trasporto paracellulare tra cellule endoteliali adiacenti (ECs) e (ii) bassi livelli di espressione di mediatori, trasportatori e recettori delle caveole all'interno delle cellule endoteliali che mantengono bassi tassi di trasporto transcellulare 1,6,7,8 . I complessi giunzionali che regolano il flusso paracellulare sono composti da giunzioni strette (claudine, occludine), giunzioni aderenti (caderine VE) e giunzioni gap (connessine), consentendo il passaggio di acqua e piccoli composti idrosolubili. Mentre le piccole molecole lipofile si diffondono passivamente attraverso l'interno delle RMEC, il movimento delle molecole lipofile e idrofile più grandi è regolato da vie transendoteliali guidate dall'ATP, tra cui il trasporto vescicolare e i trasportatori di membrana ^5,9.

La transcitosi vescicolare può essere classificata come transcitosi caveolare mediata da caveolina, transcitosi clatrin-dipendente (e mediata dal recettore) e macropinocitosi indipendente dalla clatrina (Figura 2). Questi processi di trasporto vescicolare coinvolgono vescicole di dimensioni diverse, con i macropinosomi che sono i più grandi (che vanno da 200-500 nm) e le caveole che sono le più piccole (in media 50-100 nm), mentre le vescicole rivestite di clatrina vanno da 70-150 nm¹⁰. Le caveole sono invaginazioni della membrana plasmatica ricche di lipidi a forma di fiaschetta con un rivestimento proteico, composto principalmente da caveolina-1 che lega il colesterolo della membrana lipidica e altre proteine strutturali e di segnalazione attraverso il loro dominio di impalcatura caveolina¹¹. Le caveoline lavorano insieme alla cavina attaccata perifericamente per promuovere la stabilizzazione delle caveole sulla membrana plasmatica¹². Le membrane caveolari possono anche trasportare recettori per altre molecole come insulina, albumina e lipoproteine circolanti tra cui lipoproteine ad alta densità (HDL) e lipoproteine a bassa densità (LDL) per aiutare il loro movimento attraverso le cellule endoteliali¹³. Durante lo sviluppo, la formazione di BRB funzionale dipende dalla soppressione della transcitosi EC⁸. L'endotelio retinico maturo, quindi, ha livelli relativamente bassi di caveole, caveolina-1 e recettori dell'albumina rispetto ad altre cellule endoteliali in condizioni fisiologiche, contribuendo alle sue proprietà barriera ^4,9.

Poiché la degradazione dell'iBRB è un importante segno distintivo di molte condizioni patologiche dell'occhio, è essenziale sviluppare metodi per valutare la permeabilità vascolare retinica in vivo e in vitro. Questi metodi aiutano a fornire probabili approfondimenti sui meccanismi di integrità della BRB compromessa e a valutare l'efficacia di potenziali bersagli terapeutici. Gli attuali saggi di imaging in vivo o di perdita vascolare quantitativa impiegano tipicamente fluorescenti (fluoresceina di sodio e destrano), colorimetrici (substrato di colorante blu di Evans e perossidasi di rafano [HRP]) o traccianti radioattivi¹⁴ per rilevare lo stravaso dalla vascolarizzazione nei tessuti retinici circostanti con imaging al microscopio o in lisato tissutale isolato. Un tracciante ideale per quantificare l'integrità vascolare dovrebbe essere inerte e abbastanza grande da permeare liberamente i vasi compromessi mentre è confinato all'interno di capillari sani e intatti. I metodi che impiegano fluoresceina di sodio o destrano coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC-destrano) nell'angiografia con fluoresceina del fondo vivo (FFA) o in supporti piatti retinici isolati sono ampiamente utilizzati per quantificare lo stravaso retinico in vivo o ex vivo. Il fitc-destrano ha il vantaggio di essere disponibile in diversi pesi molecolari che vanno da 4-70 kDa per studi selettivi di dimensioni^15,16,17. L'albumina FITC (~68 kDa) è un tracciante proteico alternativo di grandi dimensioni di rilevanza biologica per gli studi di perdita vascolare¹⁸. Il colorante Evans Blue, iniettato per via intracardica¹⁹, retroorbitalmente o attraverso la vena caudale 20, si basa anche sul suo legame con l'albumina endogena per formare una grande molecola che può essere quantificata principalmente mediante rilevazione spettrofotometrica o, meno comunemente, microscopia a fluorescenza in supporti piatti^20,21. Queste metodologie quantitative o di imaging della luce, tuttavia, spesso non distinguono il trasporto paracellulare dal trasporto trans-endoteliale. Per l'analisi specifica della transcitosi con visualizzazione ultrastrutturale delle vescicole transcitose, molecole traccianti come HRP sono tipicamente utilizzate per localizzare vescicole transcitose all'interno di cellule endoteliali che possono essere osservate al microscopio elettronico^22,23,24 (Figura 3A-C).

Lo sviluppo e l'uso di modelli iBRB in vitro per valutare la permeabilità delle cellule endoteliali potrebbe fornire una valutazione robusta e ad alto rendimento per integrare gli esperimenti in vivo e aiutare lo studio dei regolatori molecolari della perdita vascolare. I saggi comunemente usati per valutare il trasporto paracellulare e l'integrità delle giunzioni strette includono la resistenza elettrica transendoteliale (TEER), una misura della conduttanza ionica (Figura 4)^2,25 e il saggio di perdita vascolare in vitro utilizzando traccianti fluorescenti a piccolo peso molecolare ²⁶. Inoltre, i saggi di transcitosi basati sulla transferrina che modellano la BBB sono stati utilizzati per esplorare la transcitosi²⁷ clatrina-dipendente. Nonostante ciò, i saggi per valutare la BRB e, più specificamente, la transcitosi caveolare EC retinica in vitro sono limitati.

In questo studio, descriviamo un test di transcitosi EC utilizzando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) come modello in vitro per determinare la permeabilità iBRB e la transcitosi EC. Questo test si basa sulla capacità degli HRMEC di trasportare la transferrina o la HRP attraverso le vie di transcitosi mediate dal recettore o caveolae-dipendenti, rispettivamente (Figura 2). Gli HRMEC coltivati fino alla piena confluenza nella camera apicale (cioè inserto filtrante) sono stati incubati con transferrina coniugata fluorescente (Cy3-Tf) o HRP per misurare l'intensità della fluorescenza corrispondente ai livelli di transferrina o HRP trasferiti alla camera inferiore esclusivamente attraverso la transcitosi EC. La confluenza del monostrato cellulare può essere confermata misurando TEER, indicando l'integrità della giunzione stretta²⁵. Per dimostrare la tecnica di saggio TEER e transcitosi, sono stati utilizzati modulatori molecolari noti della permeabilità vascolare e della transcitosi EC, incluso il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)²⁸ e quelli nella segnalazione Wnt (ligandi Wnt: Wnt3a e Norrin)²⁹.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Boston Children's Hospital per la generazione di microscopia ottica e immagini EM (Figura 3). I protocolli per gli studi in vivo possono essere ottenuti da Wang et al.24. Tutti gli esperimenti che coinvolgono cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Committee (IBC) del Boston Children's Hospital.

1. Preparazione dei reagenti

1. Soluzione per il rivestimento di un piatto di coltura tissutale: preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% sciogliendo 1 mL di soluzione madre di gelatina (40% -50%) in 500 ml di coltura tissutale sterile grado 1x PBS (pH = 7,4). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare la soluzione di gelatina allo 0,1% a 2-8°C. Può essere conservato alla suddetta temperatura per un tempo indefinito in condizioni sterili.
2. Terreno di coltura: preparare 500 ml di terreno completo di crescita delle cellule endoteliali (EGM) sciogliendo gli integratori di EGM nel mezzo basale di crescita delle cellule endoteliali (EBM) secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Aliquote terreno di crescita in provette da 50 mL e conservare le provette a 4 °C. La durata di conservazione del terreno di coltura è di 12 mesi a 4 °C.
3. Soluzione di tripsina: per la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%, aliquote dal flaconcino in provette da 50 mL e conservare a 4 °C (fino a 2 settimane) o -20 °C (fino a 24 mesi).

2. Coltura degli HRMEC

1. Coltura cellulare iniziale
   1. Rivestire le piastre di Petri per colture cellulari (diametro 100 mm x altezza 20 mm) con 5 ml di soluzione di gelatina allo 0,1% sotto una cappa a flusso laminare e tenerle indisturbate nella cappa per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) per un rivestimento uniforme.
      NOTA: Il rivestimento gelatinoso dei piatti migliora l'attaccamento cellulare. In alternativa, è possibile utilizzare anche palloni di coltura T75 rivestiti di gelatina.
   2. Prima di seminare le cellule, aspirare la soluzione di gelatina usando una pompa per vuoto. La pressione del vuoto dell'aspiratore utilizzato era fino a 724 mmHg.
      NOTA: L'aspirazione deve essere eseguita immediatamente prima della semina delle celle per evitare l'essiccazione della soluzione di rivestimento.
   3. Scongelare un flaconcino congelato di HRMEC (da conservare in azoto liquido) usando un bagnomaria a 37 °C o aggiungendo un mezzo di crescita caldo nel flaconcino. Una volta scongelata, trasferire la sospensione cellulare a 9 ml di terreno di coltura (supponendo che il flaconcino scongelato degli HRMEC sia di 1 ml).
      NOTA: Gli HRMEC sono stati ottenuti commercialmente (Tabella dei materiali). Il terreno di coltura aggiunto alle cellule deve essere sempre preriscaldato a 37 °C prima dell'uso.
   4. Ruotare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT e aspirare attentamente il surnatante per evitare di rimuovere il pellet cellulare.
   5. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno di coltura e trasferire la sospensione risultante su una capsula di Petri rivestita di gelatina. Mantenere le celle nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO₂. In genere, gli HRMEC sono confluenti al 70% -80% dopo 72 ore.
      NOTA: il mezzo di crescita viene cambiato a giorni alterni.
2. Sottocoltura di HRMEC su inserti a membrana permeabile
   1. Preparare inserti filtranti per colture cellulari (inserti da 6,5 mm con membrana in policarbonato da 0,4 μm di dimensione dei pori, posti in una piastra a 24 pozzetti) per la semina degli HRMEC rivestendo ciascun inserto (camera apicale) con 200 μL di soluzione di gelatina allo 0,1% per 30 minuti sotto una cappa a flusso laminare. Assicurarsi che la soluzione copra l'intera superficie inferiore dell'inserto filtrante.
      NOTA: Ogni pozzetto ha una camera apicale e basolaterale separata da una membrana porosa.
   2. Estrarre la capsula di Petri con HRMEC coltivati (passo 2.1.5.) dall'incubatore e aspirare il terreno di coltura. Risciacquare delicatamente le cellule 2x con 10 ml di 1x PBS sotto una cappa a flusso laminare per eliminare potenziali cellule galleggianti / morte.
   3. Dissociare le cellule con 0,5-1 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% e posizionare la capsula di Petri nell'incubatore (37 °C e 5% CO₂) per 5 minuti.
   4. Spegnere l'attività della tripsina aggiungendo 4,5-9 ml di terreno di coltura e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta da 10 ml.
   5. Ruotare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT, rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di terreno di crescita.
   6. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro manuale o un contatore automatico di cellule e seme a una densità di 4 x 10⁴ cellule per inserto del filtro (cioè 1,25 x 10⁵ celle / cm²). Il volume della sospensione cellulare per ciascun inserto è di 250 μL.
   7. Aspirare la soluzione di rivestimento dai pozzetti contenenti inserti permeabili e trasferire 250 μL della sospensione cellulare per inserto (camera apicale). Aggiungere solo il mezzo (cioè senza celle) a uno degli inserti, che verrà utilizzato come "controllo vuoto" per la misurazione TEER. Contemporaneamente, aggiungere anche 750 μL di mezzo per pozzetto, nelle camere basolaterali.
   8. Conservare la piastra a 24 pozzetti con inserti permeabili nell'incubatore (37 °C e 5% di CO 2) per 7-12 giorni fino a quando le cellule in coltura diventano completamente confluenti e si raggiunge il valore TEER desiderato di ~20 Ω·cm₂.
   9. Cambia il mezzo di crescita a giorni alterni. Durante il cambio del fluido, aspirare con attenzione il mezzo per ridurre al minimo la rottura del monostrato cellulare e aggiungere 250 μL e 750 μL di terreno fresco per pozzetto rispettivamente alle camere apicale e basolaterale.
      NOTA: Il mezzo di crescita viene modificato sia per le camere apicali che basolaterali dei pozzetti.

3. Misurazioni TEER (Figura 4)

1. Il giorno 14 post semina delle celle (fase 2.2.9.), misurare il TEER per HRMEC utilizzando un sistema epiteliale volt-ohm meter (EVOM) di resistenza elettrica (ER) (Table of Materials) come segue.
2. Precaricare il sistema ER e controllare la funzionalità del misuratore utilizzando l'elettrodo di prova STX04. Calibrare, se necessario.
3. Collegare l'elettrodo al misuratore ed equilibrare l'elettrodo immergendolo prima in etanolo al 70% per 15-20 minuti e poi immergendolo brevemente nel terreno di coltura cellulare EGM.
4. Nel frattempo, tenere la piastra a 24 pozzetti contenente celle nella cappa a flusso laminare a RT per 15-20 minuti per l'equilibrio della temperatura.
   NOTA: le misurazioni TEER sono influenzate dalla temperatura, quindi la fase di equilibrio è essenziale.
5. Per la misurazione TEER, aggiungere terreno di coltura fresco sia alle camere apicali (250 μL) che basolaterali (750 μL) dei pozzetti.
6. Eseguire la misurazione TEER immergendo attentamente l'elettrodo in modo che la punta più corta si trovi nell'inserto e la punta più lunga tocchi il fondo del pozzetto. Misurare prima la resistenza attraverso il controllo vuoto. Per ogni inserto, misurare TEER in triplice copia.
   NOTA: Per il risciacquo dell'elettrodo tra le misurazioni, vengono utilizzati terreni di coltura. Assicurarsi che l'elettrodo sia tenuto con un angolo di 90° rispetto alla parte inferiore dell'inserto per letture stabili.
7. Calcolare la resistenza elettrica (in Ω·cm 2) attraverso il monostrato utilizzando la formula, TEER = resistenza netta (Ω) x superficie dell'inserto filtrante (cm²); Qui, la resistenza netta è la differenza tra la resistenza di ciascun pozzetto (mezzo di crescita con celle) e il pozzo bianco (solo mezzo di crescita).
8. Effettuare un ulteriore trattamento delle cellule solo dopo che il valore TEER raggiunge ~20 Ω·cm². Se il livello TEER desiderato non viene raggiunto, tenere la piastra nell'incubatore e misurare il TEER il giorno successivo.
   NOTA: La confluenza HRMEC può anche essere validata mediante esame morfologico della forma cellulare (al microscopio) con morfologia tipica del ciottolo e/o dalla presenza di proteine di giunzione cellulare con colorazione immunoistochimica separata.

4. Saggio di transcitosi

1. Saggio di transcitosi in vitro mediata da clatrina mediante transferrina marcata con Cy3 (Figura 5)
   1. Al raggiungimento della confluenza con valori di TEER intorno a 20 Ω·cm 2, il siero priva le cellule per 24 ore a 37 °C e il 5% di CO₂ utilizzando lo 0,5% di FBS in EBM (mezzo ridotto dal siero) in entrambe le camere (camera apicale: 250 μL e camera basolaterale: 750 μL) prima del trattamento con il ligando. Durante il test è stata utilizzata EBM a siero ridotto.
   2. Incubare le cellule (utilizzando il mezzo ridotto dal siero nella fase 4.1.1.) nella camera apicale con ligando della transferrina (Cy3-Tf) marcato con fluorescenza (cianina 3) (concentrazione finale di 40 μg/ml) per 60 minuti a 37 °C.
      NOTA: Le piastre contenenti Cy3-Tf devono essere protette dalla luce per evitare lo sbiancamento fotografico del Cy3-Tf avvolgendovi un foglio di alluminio ed eseguendo l'esperimento in una cappa di coltura cellulare con le luci spente.
   3. Dopo 1 ora, posizionare la piastra sul ghiaccio e lavare il monostrato apicalmente e basolateralmente 4 volte (3-5 minuti per lavaggio) con il mezzo ridotto dal siero a RT per rimuovere il Cy3-Tf libero non legato.
      NOTA: Il lavaggio è essenziale per rimuovere le molecole traccianti libere e consentire una lettura accurata della transcitosi senza potenziali perdite dalla via paracellulare.
   4. Aggiungere il mezzo fresco ridotto dal siero (come al punto 4.1.1.) agli inserti filtranti accuratamente lavati contenenti cellule e trasferire gli inserti in pozzetti freschi della piastra a 24 pozzetti contenente il mezzo preriscaldato ridotto dal siero.
   5. Incubare le cellule per altri 90 minuti nell'incubatore (37 °C e 5% di CO₂), quindi raccogliere il terreno dalla camera basolaterale.
   6. Registrare l'intensità di fluorescenza della soluzione dalla camera basolaterale utilizzando un rilevatore di fluorescenza. I livelli di intensità di fluorescenza, misurati come unità fluorescenti relative (RFU), indicano la quantità di complesso Cy3-Tf transcitoso attraverso il monostrato HRMEC tramite transcitosi clatrin-dipendente.
2. Saggio di transcitosi in vitro mediato da caveole mediante HRP (Figura 6)
   1. Al raggiungimento della piena confluenza con valori di TEER intorno a 20 Ω·cm 2, il siero priva le cellule per 24 ore a 37 °C e al 5% di CO₂ utilizzando terreno EBM contenente FBS allo 0,5% (terreno ridotto dal siero) prima del trattamento (come nella fase 4.1.1.). Il mezzo EBM ridotto dal siero è stato utilizzato durante l'intero test.
   2. Trattare le cellule nella camera apicale con i trattamenti desiderati e i controlli del veicolo.
      NOTA: Qui, abbiamo usato i modulatori Wnt come esempio per dimostrare la regolazione della transcitosi mediata da caveole mediante la via di segnalazione Wnt negli HRMEC: Norrin ricombinante umano e inibitore Wnt XAV939. In un esperimento tipico, le cellule sono state trattate per 24 ore in un incubatore (37 °C e 5% CO₂) con le seguenti concentrazioni: Norrin (125 ng/mL), Norrin (125 ng/mL) + XAV939 (10 μM) e soluzione di controllo del veicolo. Inoltre, è stato utilizzato anche un mezzo condizionato da Wnt3a (prodotto da cellule L Wnt-3A).
   3. Incubare le cellule nella camera apicale con HRP (5 mg/ml) per 15 minuti a 37 °C.
   4. Successivamente, posizionare la piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio e lavare intensamente le camere apicali e basolaterali 6 volte con tampone P (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM piruvato di sodio, 10 mM glucosio, 3 mM CaCl₂, 145 mM NaCl) per rimuovere l'HRP extracellulare libero.
      NOTA: Il lavaggio è essenziale per rimuovere le molecole traccianti libere e consentire una lettura accurata della transcitosi senza potenziali perdite dalla via paracellulare.
   5. Aggiungere il mezzo fresco ridotto dal siero (come al punto 4.1.1.) nella camera apicale e trasferire gli inserti in un pozzetto fresco contenente mezzi preriscaldati.
   6. Incubare il monostrato per altri 90 minuti nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO₂ prima di prelevare il mezzo dalla camera basolaterale.
   7. Al mezzo raccolto, aggiungere 100 μL di substrato fluorogenico della perossidasi HRP (tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore e incubare a RT per 10 minuti prima di interrompere la reazione con 100 μL di soluzione Stop.
   8. Rilevare i livelli di prodotto di reazione del substrato HRP nel fluido utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. Misurare l'intensità di fluorescenza alla lunghezza d'onda di emissione di 420 nm (con eccitazione di 325 nm) e come unità fluorescenti relative (RFU). I valori indicano il livello di HRP transcitoso attraverso lo strato HRMEC attraverso la transcitosi mediata da caveole.
      NOTA: Il prodotto fluorescente qui utilizzato (Tabella dei materiali) non fotocandeggia. Non è necessaria una protezione leggera contro il fotosbiancamento.

Risultati

Le immagini EM dell'endotelio vascolare retinico mostrano il trasporto vescicolare transcitotico e le vescicole caveolari nelle cellule endoteliali in vivo.
La transcitosi EC può essere visualizzata in vivo all'interno di sezioni trasversali retiniche con precipitato marrone scuro che riflette i vasi sanguigni contenenti HRP al microscopio ottico (Figura 3A) e come precipitato denso di elettroni indicativo di vescicole transcitotiche contenenti HRP ...

Discussione

BRB svolge un ruolo essenziale nella salute e nella malattia della retina. Le tecniche in vitro che valutano la permeabilità vascolare si sono dimostrate strumenti cruciali negli studi riguardanti lo sviluppo e la funzione della barriera (BRB/BBB). La procedura qui descritta potrebbe essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della transcitosi EC o valutare i relativi modulatori molecolari che influenzano la permeabilità BRB. In vitro I saggi di transcitosi EC presentano moltepli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinet	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	1286
Cell culture petridish	Nest Biotechnology	704001
Centrifuge	Eppendorf	5702
Centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc.	352097
Centrifuge tubes (50 mL)	Denville Scientific Inc.	C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin	Jackson ImmunoResearch	AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)	Lonza Bioscience	CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements	Lonza Bioscience	CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)	Millipore	MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)	Lonza Bioscience	CC-4102B
Gelatin	Sigma-Aldrich	G7765
Hemocytometer (2-chip)	Bulldog Bio	DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)	Sigma-Aldrich	P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)	Cell Systems	ACBRI 181
Incubator	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	3110
L cells (for Control-conditioned medium)	ATCC	CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)	ATCC	CRL-2647
Light microscope	Leica	DMi1
Multimode Plate Reader	EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)	GIBCO	10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit	Thermo Fisher Scientific	15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)	R&D Systems	3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)	R&D Systems	293-VE
Syringe filter (0.22 µm)	Millipore	SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)	Corning Inc.	CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)	GIBCO	25-200-072
Water bath	Precision, Thermo Fisher Scientific	51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)	Selleckchem	S1180