JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول مقايسة عبر الخلايا البطانية في المختبر كنموذج لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الداخلي للشبكية عن طريق قياس قدرة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية على نقل بيروكسيديز الفجل عبر الخلايا في عمليات النقل عبر الخلايا بوساطة الكهف.

Abstract

يساهم خلل الحاجز الدموي الشبكي (BRB) في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين الوعائية ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى وذمة شبكية العين وفقدان البصر اللاحق. يتكون الحاجز الدموي الداخلي للشبكية (iBRB) بشكل أساسي من بطانة وعائية شبكية العين ذات نفاذية منخفضة في ظل الظروف الفسيولوجية. يتم تنظيم هذه الميزة من النفاذية المنخفضة بإحكام والحفاظ عليها من خلال معدلات منخفضة من النقل شبه الخلوي بين الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المجاورة للشبكية ، وكذلك النقل عبر الخلايا (transcytosis) من خلالها. قد يوفر تقييم نفاذية الحاجز عبر الخلوي في الشبكية رؤى أساسية حول سلامة iBRB في الصحة والمرض. في هذه الدراسة ، نصف فحص الخلايا البطانية (EC) ، كنموذج في المختبر لتقييم نفاذية iBRB ، باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية (HRMECs). يقيم هذا الفحص قدرة HRMECs على نقل الترانسفيرين وبيروكسيديز الفجل (HRP) في عمليات النقل عبر الخلايا بوساطة المستقبلات والكهف ، على التوالي. تم احتضان مركبات HRMECs المتقاربة بالكامل المستزرعة على غشاء مسامي مع ترانسفيرين موسوم بالفلورسنت (transcytosis المعتمد على clathrin) أو HRP (transcytosis بوساطة الكهف) لقياس مستويات الترانسفيرين أو HRP المنقولة إلى الغرفة السفلية ، مما يدل على مستويات transcytosis عبر الطبقة الأحادية EC. تم تعديل إشارات Wnt ، وهي مسار معروف ينظم iBRB ، لإظهار طريقة فحص transcytosis القائمة على HRP بوساطة الكهف. قد يوفر فحص EC transcytosis الموصوف هنا أداة مفيدة للتحقيق في المنظمين الجزيئيين لنفاذية EC وسلامة iBRB في أمراض الأوعية الدموية ولفحص أنظمة توصيل الأدوية.

Introduction

شبكية العين البشرية هي واحدة من أعلى الأنسجة التي تتطلب الطاقة في الجسم. يتطلب الأداء السليم للشبكية العصبية إمدادات فعالة من الأكسجين والمواد المغذية إلى جانب تدفق مقيد من الجزيئات الأخرى التي يحتمل أن تكون ضارة لحماية بيئة الشبكية ، والتي يتم توسطها عبر حاجز الدم والشبكية (BRB)1. على غرار الحاجز الدموي الدماغي (BBB) في الجهاز العصبي المركزي ، يعمل BRB كحاجز انتقائي في العين ، حيث ينظم حركة الأيونات والماء والأحماض الأمينية والسكر داخل وخارج شبكية العين. يحافظ BRB أيضا على توازن الشبكية وامتيازه المناعي من خلال منع التعرض لعوامل الدورة الدموية مثل الخلايا المناعية والأجسام المضادة ومسببات الأمراض الضارة2. يساهم خلل BRB في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين الوعائية ، مثل اعتلال الشبكية السكري ، والتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، واعتلال الشبكية الخداجي (ROP) ، وانسداد الوريد الشبكي ، والتهاب القزحية ، مما يؤدي إلى وذمة وعائية المنشأ وفقدان البصر اللاحق3،4،5.

يتكون BRB من حاجزين منفصلين لشبكتين وعائيتين عينيتين متميزتين ، على التوالي: الأوعية الدموية الشبكية و choriocapillaris المعششة تحت شبكية العين. يتكون BRB الداخلي (iBRB) في المقام الأول من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الشبكية (RMECs) التي تبطن الأوعية الدموية الدقيقة في الشبكية ، والتي تغذي الطبقات العصبية الداخلية للشبكية. من ناحية أخرى ، تشكل ظهارة صبغة الشبكية المكون الرئيسي ل BRB الخارجي ، والذي يقع بين شبكية العين الحسية العصبية و choriocapillaris2. بالنسبة ل iBRB ، يحدث النقل الجزيئي عبر RMECs من خلال كل من الطرق شبه الخلوية وعبر الخلوية (الشكل 1). تعتمد الدرجة العالية من انتقائية المواد عبر iBRB على (i) وجود مجمعات البروتين الموصلة التي تقيد النقل شبه الخلوي بين الخلايا البطانية المجاورة (ECs) ، و (ii) مستويات التعبير المنخفضة لوسطاء الكهف والناقلات والمستقبلات داخل الخلايا البطانية التي تحافظ على معدلات منخفضة من النقل عبر الخلايا1،6،7،8 . تتكون مجمعات الوصلات التي تنظم التدفق شبه الخلوي من تقاطعات ضيقة (كلودين ، أوكلودين) ، تلتصق بالتقاطعات (كادهيرين VE) ، وتقاطعات الفجوة (connexins) ، مما يسمح بمرور الماء والمركبات الصغيرة القابلة للذوبان في الماء. في حين تنتشر الجزيئات الصغيرة المحبة للدهون بشكل سلبي عبر المناطق الداخلية من RMECs ، يتم تنظيم حركة الجزيئات الأكبر محبة للدهون والمحبة للماء من خلال مسارات عبر البطانية مدفوعة ب ATP بما في ذلك النقل الحويصلي وناقلات الغشاء 5,9.

يمكن تصنيف الترانسسيتوسيس الحويصلي على أنه ترانسكيتوسيس كهفي بوساطة الكافولين، وترانسكتوري كنزية كليبرات العين المعتمد على الكلاثرين (وبوساطة المستقبلات)، وندرة الخلايا الكبيرة المستقلة عن الكلاثرين (الشكل 2). تتضمن عمليات النقل الحويصلي هذه حويصلات مختلفة الحجم ، حيث تكون الماكروبينوسومات هي الأكبر (تتراوح من 200-500 نانومتر) وتكون الكهف هي الأصغر (بمتوسط 50-100 نانومتر) ، في حين تتراوح الحويصلات المغلفة بالكلاثرين من 70-150 نانومتر10. Caveolae هي غزوات غشاء بلازما غنية بالدهون على شكل قارورة مع معطف بروتين ، يتكون في المقام الأول من caveolin-1 الذي يربط الكوليسترول الغشائي الدهني والبروتينات الهيكلية والإشارات الأخرى عبر مجال سقالات الكهف11. تعمل الكافيولين جنبا إلى جنب مع الكافين المتصل محيطيا لتعزيز استقرار الكهف في غشاء البلازما12. قد تحمل الأغشية الكهفية أيضا مستقبلات لجزيئات أخرى مثل الأنسولين والألبومين والبروتينات الدهنية المتداولة بما في ذلك البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) والبروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) للمساعدة في حركتها عبر الخلايا البطانية13. أثناء التطوير ، يعتمد تكوين BRB الوظيفي على قمع EC transcytosis8. وبالتالي ، فإن بطانة الشبكية الناضجة تحتوي على مستويات منخفضة نسبيا من مستقبلات الكافولا والكافولين-1 والألبومين فيما يتعلق بالخلايا البطانية الأخرى في ظل الظروف الفسيولوجية ، مما يساهم في خصائصها الحاجزة 4,9.

نظرا لأن انهيار iBRB هو السمة المميزة الرئيسية للعديد من حالات العين المرضية ، فمن الضروري تطوير طرق لتقييم نفاذية الأوعية الدموية في شبكية العين في الجسم الحي وفي المختبر. تساعد هذه الأساليب على توفير رؤى محتملة حول آليات سلامة BRB المعرضة للخطر وتقييم فعالية الأهداف العلاجية المحتملة. عادة ما تستخدم فحوصات التصوير الحالية في الجسم الحي أو فحوصات تسرب الأوعية الدموية الكمية الفلورسنت (فلوريسين الصوديوم والدكستان) ، أو قياس الألوان (صبغة إيفانز الزرقاء وركيزة بيروكسيديز الفجل [HRP]) ، أو المقتفيات الإشعاعية14 للكشف عن الإسراف من الأوعية الدموية إلى أنسجة الشبكية المحيطة باستخدام التصوير المجهري أو في محللات الأنسجة المعزولة. يجب أن يكون المقتفي المثالي لقياس سلامة الأوعية الدموية خاملا وكبيرا بما يكفي لتخلل الأوعية المعرضة للخطر بحرية أثناء حبسه داخل الشعيرات الدموية السليمة والسليمة. تستخدم الطرق التي تستخدم فلوريسين الصوديوم أو الفلوريسين إيزوثيوسيانات ديكستران المقترن (FITC-dextran) في تصوير الأوعية الدموية الحية للقاع (FFA) أو حوامل الشبكية المسطحة المعزولة على نطاق واسع لقياس إسراف الشبكية في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق. يتميز FITC-dextran بأنه متاح في أوزان جزيئية مختلفة تتراوح من 4-70 kDa للدراسات الانتقائية للحجم15،16،17. FITC-albumin (~ 68 kDa) هو متتبع بروتين بديل كبير الحجم ذو صلة بيولوجية بدراسات تسرب الأوعية الدموية18. تعتمد صبغة إيفانز بلو ، التي يتم حقنها داخل القلب19 ، أو في المدار الرجعي ، أو من خلال الوريد الذيل 20 ، أيضا على ارتباطها بالألبومين الداخلي المنشأ لتشكيل جزيء كبير يمكن تحديده كميا عن طريق الكشف عن الطيف الضوئي في الغالب أو ، بشكل أقل شيوعا ، المجهر الفلوري في حوامل مسطحة20،21. ومع ذلك، فإن منهجيات التصوير الكمي أو الضوئي هذه غالبا ما لا تميز النقل شبه الخلوي عن النقل عبر البطانة. بالنسبة للتحليل المحدد لانتقال الخلايا مع التصور فوق الهيكلي للحويصلات المتحولة عبر الخلايا ، تستخدم جزيئات التتبع مثل HRP عادة لتحديد موقع الحويصلات المتحولة داخل الخلايا البطانية التي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الإلكتروني 22،23،24 (الشكل 3A-C).

يمكن أن يوفر تطوير واستخدام نماذج iBRB في المختبر لتقييم نفاذية الخلايا البطانية تقييما قويا وعالي الإنتاجية لاستكمال التجارب في الجسم الحي والمساعدة في التحقيق في المنظمين الجزيئيين لتسرب الأوعية الدموية. تشمل المقايسات الشائعة الاستخدام لتقييم النقل شبه الخلوي وسلامة التقاطعات الضيقة المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER) ، وهو مقياس للتوصيل الأيوني (الشكل 4) 2,25 ، واختبار تسرب الأوعية الدموية في المختبر باستخدام مقتفيات الفلورسنت الصغيرة ذات الوزن الجزيئي26. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام اختبارات transcytosis القائمة على الترانسفيرين نمذجة BBB لاستكشاف transcytosis المعتمد على clathrin27. على الرغم من ذلك ، فإن الفحوصات لتقييم BRB ، وبشكل أكثر تحديدا ، transcytosis الكهفية EC شبكية العين في المختبر محدودة.

في هذه الدراسة ، نصف فحص EC transcytosis باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية (HRMECs) كنموذج في المختبر لتحديد نفاذية iBRB و EC transcytosis. يعتمد هذا الفحص على قدرة HRMECs على نقل الترانسفيرين أو HRP عبر مسارات transcytosis التي تتوسط فيها المستقبلات أو المعتمدة على الكهف ، على التوالي (الشكل 2). تم احتضان HRMECs المستزرعة إلى الالتقاء الكامل في الغرفة القمية (أي إدراج المرشح) مع الترانسفيرين المترافق مع الفلورسنت (Cy3-Tf) أو HRP لقياس شدة التألق المقابلة لمستويات الترانسفيرين أو HRP المنقولة إلى الغرفة السفلية من خلال EC transcytosis فقط. يمكن تأكيد التقاء الطبقة الأحادية للخلية عن طريق قياس TEER ، مما يشير إلى سلامة التقاطع الضيق25. لإثبات تقنية اختبار TEER و transcytosis ، تم استخدام المعدلات الجزيئية المعروفة لنفاذية الأوعية الدموية و transcytosis EC ، بما في ذلك عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)28 وتلك الموجودة في إشارات Wnt (روابط Wnt: Wnt3a و Norrin)29.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في مستشفى بوسطن للأطفال لتوليد المجهر الضوئي وصور EM (الشكل 3). يمكن الحصول على بروتوكولات للدراسات في الجسم الحي من Wang et al.24. تمت الموافقة على جميع التجارب التي تنطوي على الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية (HRMECs) من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) في مستشفى بوسطن للأطفال.

1. إعداد الكواشف

  1. حل لطلاء طبق زراعة الأنسجة: تحضير محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ عن طريق إذابة 1 مل من محلول مخزون الجيلاتين (40٪ -50٪) في 500 مل من زراعة الأنسجة المعقمة الصف 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4). تصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يخزن محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ على درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. يمكن تخزينه في درجة الحرارة المذكورة لفترة غير محددة في حالة معقمة.
  2. متوسط النمو: تحضير 500 مل من الوسط الكامل لنمو الخلايا البطانية (EGM) عن طريق إذابة مكملات EGM في الوسط القاعدي لنمو الخلايا البطانية (EBM) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). أليكوت متوسط النمو في أنابيب 50 مل وتخزين الأنابيب في 4 درجة مئوية. العمر الافتراضي لوسط النمو هو 12 شهرا عند 4 درجات مئوية.
  3. محلول التربسين: بالنسبة لمحلول التريبسين-EDTA بنسبة 0.25٪ ، قم بنقل aliquot من قارورة المخزون إلى أنابيب 50 مل وتخزينها عند 4 درجات مئوية (حتى أسبوعين) أو -20 درجة مئوية (حتى 24 شهرا).

2. زراعة الموارد البشرية

  1. زراعة الخلايا الأولية
    1. قم بتغطية أطباق بتري (قطرها 100 مم × ارتفاعها 20 مم) مع 5 مل من محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ تحت غطاء محرك السيارة الرقائقي واحتفظ بها دون إزعاج في الغطاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لطلاء موحد.
      ملاحظة: طلاء الجيلاتين للأطباق يعزز ارتباط الخلايا. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام قوارير ثقافة T75 المطلية بالجيلاتين.
    2. قبل بذر الخلايا ، قم بشفط محلول الجيلاتين باستخدام مضخة تفريغ. كان ضغط الفراغ للشفاط المستخدم يصل إلى 724 مم زئبق.
      ملاحظة: يجب أن يتم الشفط مباشرة قبل بذر الخلايا لمنع الجفاف من محلول الطلاء.
    3. قم بإذابة قارورة مجمدة من HRMECs (من التخزين في النيتروجين السائل) إما باستخدام حمام مائي عند 37 درجة مئوية أو عن طريق إضافة وسط نمو دافئ إلى القارورة. بمجرد إذابته ، انقل تعليق الخلية إلى 9 مل من وسط النمو (على افتراض أن القارورة المذابة من HRMECs هي 1 مل).
      ملاحظة: تم الحصول على مراكز إدارة الموارد البشرية تجاريا (جدول المواد). يجب دائما تسخين وسط النمو المضاف إلى الخلايا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    4. قم بتدوير الخلايا عند 200 × g لمدة 5 دقائق في RT وقم بشفط السوبرناتانت بعناية لتجنب إزالة حبيبات الخلية.
    5. أعد تعليق حبيبة الخلية في 10 مل من وسط النمو وانقل التعليق الناتج إلى طبق بتري مغطى بالجيلاتين. حافظ على الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. عادة ما تكون HRMECs ملتقية بنسبة 70٪ -80٪ بعد 72 ساعة.
      ملاحظة: يتم تغيير وسيط النمو كل يومين.
  2. الزراعة الفرعية ل HRMECs على إدخالات غشاء نفاذية
    1. قم بإعداد إدخالات مرشح زراعة الخلايا (إدراج 6.5 مم مع غشاء بولي كربونات بحجم 0.4 ميكرومتر بحجم المسام ، يوضع في صفيحة من 24 بئرا) لبذر HRMECs عن طريق طلاء كل إدراج (غرفة قمي) ب 200 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.1٪ لمدة 30 دقيقة تحت غطاء تدفق صفائحي. تأكد من أن المحلول يغطي السطح السفلي بالكامل لإدراج الفلتر.
      ملاحظة: يحتوي كل بئر على غرفة قمية وبازوجانبية مفصولة بغشاء مسامي.
    2. أخرج طبق بتري مع HRMECs المستزرعة (الخطوة 2.1.5) من الحاضنة واستطلع وسائط النمو. شطف بلطف الخلايا 2x مع 10 مل من 1x PBS تحت غطاء تدفق الصفيحة للتخلص من الخلايا العائمة / الميتة المحتملة.
    3. افصل الخلايا بمحلول 0.5-1 مل من محلول التريبسين-EDTA بنسبة 0.25٪ وضع طبق بتري في الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) لمدة 5 دقائق.
    4. قم بإخماد نشاط التربسين عن طريق إضافة 4.5-9 مل من وسائط النمو ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 10 مل.
    5. قم بتدوير الخلايا عند 200 × g لمدة 5 دقائق في RT ، وقم بإزالة supernatant بعناية ، وأعد تعليق الكريات في 3 مل من وسائط النمو.
    6. احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس خلايا الدم اليدوي أو عداد الخلايا الآلي والبذور بكثافة 4 × 104 خلايا لكل إدراج مرشح (أي 1.25 × 105 خلايا / سم2). حجم تعليق الخلية لكل إدراج هو 250 ميكرولتر.
    7. شفط محلول الطلاء من الآبار التي تحتوي على إدخالات نفاذة ونقل 250 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل إدراج (الغرفة القمي). أضف وسيطا فقط (أي بدون خلايا) إلى إحدى الإدخالات ، والتي سيتم استخدامها ك "عنصر تحكم فارغ" لقياس TER. في الوقت نفسه ، أضف أيضا 750 ميكرولتر من الوسط لكل بئر ، في الغرف القاعدية.
    8. احتفظ بالصفيحة المكونة من 24 بئرا مع إدخالات نفاذة في الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 7-12 يوما حتى تصبح الخلايا المستزرعة ملتقية تماما ويتم تحقيق قيمة TEER المطلوبة من ~ 20 Ω · سم2.
    9. تغيير وسط النمو كل يومين. أثناء تغيير الوسائط ، قم بشفط الوسائط بعناية لتقليل اضطراب الطبقة الأحادية للخلية وإضافة 250 ميكرولتر و 750 ميكرولتر من الوسائط الجديدة لكل بئر إلى الغرف القمية والقاعدية ، على التوالي.
      ملاحظة: يتم تغيير وسط النمو لكل من الغرف القمية والقاعدية في الآبار.

3. قياسات TEER (الشكل 4)

  1. في اليوم 14 بعد بذر الخلايا (الخطوة 2.2.9) ، قم بقياس TEER ل HRMECs باستخدام نظام المقاومة الكهربائية (ER) الظهاري فولت أوم متر (EVOM) (جدول المواد) على النحو التالي.
  2. اشحن نظام التقارير الإلكترونية مسبقا وتحقق من وظيفة العداد باستخدام قطب الاختبار STX04. معايرة، إذا لزم الأمر.
  3. قم بتوصيل القطب بالعداد وقم بموازنة القطب عن طريق نقعه أولا في 70٪ من الإيثانول لمدة 15-20 دقيقة ثم غمره لفترة وجيزة في وسط نمو EGM لزراعة الخلايا.
  4. في غضون ذلك ، احتفظ بلوحة 24 بئرا المحتوية على الخلية في غطاء التدفق الرقائقي في RT لمدة 15-20 دقيقة لتحقيق توازن درجة الحرارة.
    ملاحظة: تتأثر قياسات TEER بدرجة الحرارة ، لذا فإن خطوة التوازن ضرورية.
  5. لقياس TEER ، أضف وسط نمو جديد إلى كل من الغرف القمية (250 ميكرولتر) والقاعدية (750 ميكرولتر) للآبار.
  6. قم بإجراء قياس TEER عن طريق غمر القطب بعناية بحيث يكون الطرف الأقصر في الإدراج ويلامس الطرف الأطول قاع البئر. قم بقياس المقاومة عبر عنصر التحكم الفارغ أولا. لكل إدراج، قم بقياس TEER في ثلاثة أجزاء.
    ملاحظة: لشطف القطب الكهربائي بين القياسات، يتم استخدام وسائط الاستزراع. تأكد من تثبيت القطب الكهربائي بزاوية 90 درجة في الجزء السفلي من الإدراج للحصول على قراءات مستقرة.
  7. حساب المقاومة الكهربائية (Ω · سم 2) عبر الطبقة الأحادية باستخدام الصيغة ، TEER = صافي المقاومة (Ω) × مساحة سطح إدراج المرشح (سم2) ؛ هنا ، المقاومة الصافية هي الفرق بين مقاومة كل بئر (وسط نمو مع خلايا) والبئر الفارغ (وسط نمو فقط).
  8. قم بإجراء مزيد من المعالجة للخلايا فقط بعد أن تصل قيمة TEER إلى ~ 20 Ω · سم2. إذا لم يتم الوصول إلى مستوى TEER المطلوب ، فاحتفظ باللوحة في الحاضنة وقم بقياس TEER في اليوم التالي.
    ملاحظة: يمكن أيضا التحقق من صحة التقاء HRMEC عن طريق الفحص المورفولوجي لشكل الخلية (تحت المجهر) مع مورفولوجيا الحصى النموذجية و / أو عن طريق وجود بروتينات تقاطع الخلية مع تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية بشكل منفصل.

4. فحص ترانسكيتوسيس

  1. فحص ترانسكتوري عبر الخلايا بوساطة كلاثرين في المختبر باستخدام ترانسفيرين موسومة ب Cy3 (الشكل 5)
    1. عند الوصول إلى الالتقاء مع قيم TEER حوالي 20 Ω · سم 2 ، يحرم المصل الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 باستخدام 0.5٪ FBS في EBM (وسط مختزل بالمصل) في كلا الغرفتين (الغرفة القمي: 250 ميكرولتر والغرفة القاعدية: 750 ميكرولتر) قبل العلاج بالرباط. تم استخدام EBM المخفض في المصل طوال فترة الفحص.
    2. احتضن الخلايا (باستخدام الوسط المختزل بالمصل في الخطوة 4.1.1.) في الغرفة القمية باستخدام ليغاند ترانسفيرين الموسومة بالفلورسنت (السيانين 3) (Cy3-Tf) (التركيز النهائي ل 40 ميكروغرام / مل) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب حماية الألواح التي تحتوي على Cy3-Tf من الضوء لتجنب التبييض الضوئي ل Cy3-Tf عن طريق لفها برقائق الألومنيوم وإجراء التجربة في غطاء محرك السيارة المزروع للخلايا مع إطفاء الأنوار.
    3. بعد 1 ساعة ، ضع الطبق على الثلج واغسل الطبقة الأحادية بشكل حسي وعرضي 4x (3-5 دقائق لكل غسلة) مع الوسط المخفض للمصل في RT لإزالة Cy3-TF المجاني غير المقيد.
      ملاحظة: الغسيل ضروري لإزالة جزيئات التتبع الحرة والسماح بقراءة دقيقة لانتقال الخلايا دون تسرب محتمل من الطريق شبه الخلوي.
    4. أضف وسيطا طازجا مخفضا للأمصال (كما هو الحال في الخطوة 4.1.1) إلى إدخالات المرشح المغسولة جيدا التي تحتوي على خلايا وانقل الإدخالات إلى آبار جديدة في الصفيحة المكونة من 24 بئرا تحتوي على وسط مخفض للمصل تم تسخينه مسبقا.
    5. احتضن الخلايا لمدة 90 دقيقة أخرى في الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) ، ثم اجمع الوسط من الغرفة القاعدية.
    6. سجل شدة التألق للمحلول من الغرفة القاعدية باستخدام كاشف التألق. تشير مستويات كثافة التألق ، التي تقاس كوحدات فلورسنت نسبية (RFU) ، إلى كمية مركب Cy3-Tf المتحولة عبر الطبقة الأحادية HRMEC عبر ترانسكسيتوسيس المعتمد على كلاثرين.
  2. فحص كثرة الخلايا بوساطة الكهف في المختبر باستخدام HRP (الشكل 6)
    1. عند الوصول إلى الالتقاء الكامل مع قيم TEER حول 20 Ω · سم 2 ، يحرم المصل الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 باستخدام 0.5٪ من وسط EBM المحتوي على FBS (وسط منخفض المصل) قبل العلاج (كما هو الحال في الخطوة 4.1.1). تم استخدام وسيط EBM المخفض في المصل طوال الفحص بأكمله.
    2. عالج الخلايا في الغرفة القمية بالعلاجات المطلوبة وضوابط السيارة.
      ملاحظة: هنا ، استخدمنا معدلات Wnt كمثال لإثبات تنظيم transcytosis بوساطة caveolae بواسطة مسار إشارات Wnt في HRMECs: Norrin المؤتلف البشري ومثبط Wnt XAV939. في تجربة نموذجية ، تمت معالجة الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) مع التركيزات التالية: Norrin (125 ng/mL) ، Norrin (125 ng/mL) + XAV939 (10 μM) ، ومحلول التحكم في المركبات. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الوسط المشروط Wnt3a (المنتج من خلايا L Wnt-3A).
    3. احتضن الخلايا في الغرفة القمية باستخدام HRP (5 مجم / مل) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. بعد ذلك ، ضع الصفيحة المكونة من 24 بئرا على الجليد واغسل الغرف القمية والقاعدية بشكل مكثف 6x باستخدام المخزن المؤقت P (10 mM HEPES pH = 7.4 ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، 10 mM glucose ، 3 mM CaCl2 ، 145 mM NaCl) من أجل إزالة HRP الحر خارج الخلية.
      ملاحظة: الغسيل ضروري لإزالة جزيئات التتبع الحرة والسماح بقراءة دقيقة لانتقال الخلايا دون تسرب محتمل من الطريق شبه الخلوي.
    5. أضف وسيطا جديدا مخفضا للأمصال (كما هو الحال في الخطوة 4.1.1) إلى الغرفة القمية وانقل الإدخالات إلى بئر طازجة تحتوي على وسائط تم تسخينها مسبقا.
    6. احتضن الطبقة الأحادية لمدة 90 دقيقة إضافية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قبل جمع الوسط من الغرفة القاعدية.
    7. إلى الوسط الذي تم جمعه ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة البيروكسيديز الفلوروجينية HRP (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واحتضنها في RT لمدة 10 دقائق قبل إيقاف التفاعل باستخدام 100 ميكرولتر من محلول Stop.
    8. اكتشف مستويات منتج تفاعل الركيزة HRP في الوسائط باستخدام قارئ لوحة التألق. قياس شدة التألق عند الطول الموجي للانبعاث 420 نانومتر (مع إثارة 325 نانومتر) وكوحدات فلورسنت نسبية (RFU). تشير القيم إلى مستوى HRP transcytossed عبر طبقة HRMEC من خلال ترانسكيتوسيس بوساطة الكهف.
      ملاحظة: منتج الفلورسنت المستخدم هنا (جدول المواد) لا يبيض ضوئيا. ليست هناك حاجة إلى حماية الضوء ضد التبييض الضوئي.

النتائج

تظهر صور EM للبطانة الوعائية الشبكية النقل الحويصلي عبر الخلوي والحويصلات الكهفية في الخلايا البطانية في الجسم الحي.
يمكن تصور ترانسسيتوسيس EC في الجسم الحي داخل المقاطع العرضية للشبكية مع راسب بني داكن يعكس الأوعية الدموية المحتوية على HRP تحت المجهر...

Discussion

يلعب BRB دورا أساسيا في صحة الشبكية ومرضها. أثبتت التقنيات المخبرية التي تقيم نفاذية الأوعية الدموية أنها أدوات حاسمة في الدراسات المتعلقة بتطوير الحاجز (BRB / BBB) ووظيفته. يمكن استخدام الإجراء الموصوف هنا لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء ترانسسيتوزيس EC أو تقييم المعدلات الجزيئية ذ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح أو مصلحة مالية للإفصاح عنها.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 EY028100 و EY024963 و EY031765) إلى JC. تم دعم ZW من قبل مؤسسة Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Biological Safety Cabinet Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific1286
Cell culture petridish Nest Biotechnology704001
Centrifuge Eppendorf5702
Centrifuge tubes (15 mL)Corning Inc.352097
Centrifuge tubes (50 mL)Denville Scientific Inc.C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin Jackson ImmunoResearchAB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza BioscienceCC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplementsLonza BioscienceCC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)MilliporeMERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)Lonza BioscienceCC-4102B
GelatinSigma-AldrichG7765
Hemocytometer (2-chip)Bulldog BioDHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)Sigma-AldrichP8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)Cell SystemsACBRI 181
IncubatorThermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific3110
L cells (for Control-conditioned medium)ATCCCRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)ATCCCRL-2647
Light microscopeLeicaDMi1
Multimode Plate ReaderEnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)GIBCO10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kitThermo Fisher Scientific15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)R&D Systems3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)R&D Systems293-VE
Syringe filter (0.22 µm)MilliporeSLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)Corning Inc.CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)GIBCO25-200-072
Water bathPrecision, Thermo Fisher Scientific51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)SelleckchemS1180

References

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184 Wnt

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved