Анализ трансцитоза эндотелиальных клеток как модель in vitro для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки

Резюме

Этот протокол иллюстрирует анализ трансцитоза эндотелиальных клеток in vitro в качестве модели для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки путем измерения способности микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека транспортировать пероксидазу хрена через клетки в трансклеточных процессах трансклеточного транспорта, опосредованных кавеолами.

Аннотация

Дисфункция гемато-сетчаточного барьера (БРБ) способствует патофизиологии ряда сосудистых заболеваний глаз, нередко приводящих к отеку сетчатки и последующей потере зрения. Внутренний гемато-ретинальный барьер (iBRB) в основном состоит из эндотелия сосудов сетчатки с низкой проницаемостью в физиологических условиях. Эта особенность низкой проницаемости жестко регулируется и поддерживается низкими темпами параклеточного транспорта между соседними микрососудистыми эндотелиальными клетками сетчатки, а также трансклеточным транспортом (трансцитозом) через них. Оценка проницаемости трансклеточного барьера сетчатки может дать фундаментальное представление о целостности iBRB в здоровье и болезни. В этом исследовании мы описываем анализ трансцитоза эндотелиальных клеток (EC) в качестве модели in vitro для оценки проницаемости iBRB с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs). Этот анализ оценивает способность HRMECs транспортировать трансферрин и пероксидазу хрена (HRP) в рецептор- и кавеолах-опосредованных трансклеточных транспортных процессах соответственно. Полностью сливающиеся HRMECs, культивируемые на пористой мембране, инкубировали с флуоресцентно-меченым трансферрином (клатринозависимый трансцитоз) или HRP (кавеол-опосредованный трансцитоз) для измерения уровней трансферрина или HRP, перенесенных в нижнюю камеру, что свидетельствует об уровнях трансцитоза в монослое ЕС. Передача сигналов Wnt, известный путь, регулирующий iBRB, модулировали для демонстрации метода анализа трансцитоза на основе HRP, опосредованного кавеолами. Анализ трансцитоза EC, описанный здесь, может обеспечить полезный инструмент для исследования молекулярных регуляторов проницаемости EC и целостности iBRB при сосудистых патологиях и для скрининга систем доставки лекарств.

Введение

Человеческая сетчатка является одной из самых энергоемких тканей в организме. Правильное функционирование нервной сетчатки требует эффективного снабжения кислородом и питательными веществами наряду с ограниченным потоком других потенциально вредных молекул для защиты среды сетчатки, которая опосредована через гемато-ретинальный барьер (BRB)¹. Подобно гематоэнцефалическому барьеру (ГЭБ) в центральной нервной системе, БРБ действует как селективный барьер в глазу, регулируя движение ионов, воды, аминокислот и сахара в сетчатке и из нее. BRB также поддерживает гомеостаз сетчатки и его иммунную привилегию, предотвращая воздействие факторов кровообращения, таких как иммунные клетки, антитела и вредные патогены². Дисфункция BRB способствует патофизиологии некоторых сосудистых заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), ретинопатия недоношенных (РН), окклюзия вен сетчатки и увеит, что приводит к вазогенному отеку и последующей потере зрения ^3,4,5.

BRB состоит из двух отдельных барьеров для двух различных глазных сосудистых сетей, соответственно: сосудистой сетчатки и фенестрированного хориокапилляриса под сетчаткой. Внутренний BRB (iBRB) в основном состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки (RMECs), выстилающих микроциркулятор сетчатки, который питает внутренние нейронные слои сетчатки. С другой стороны, пигментный эпителий сетчатки образует основной компонент наружного BRB, который находится между нейросенсорной сетчаткой и хориокапиллярием². Для iBRB молекулярный транспорт через RMECs происходит как по параклеточным, так и по трансклеточным путям (рисунок 1). Высокая степень селективности вещества в iBRB зависит от (i) наличия соединительных белковых комплексов, которые ограничивают параклеточный транспорт между соседними эндотелиальными клетками (EC), и (ii) низких уровней экспрессии медиаторов, транспортеров и рецепторов caveolae в эндотелиальных клетках, которые поддерживают низкие скорости трансклеточного транспорта 1,6,7,8 . Соединительные комплексы, регулирующие параклеточный поток, состоят из плотных соединений (клаудины, окклюдины), адгезивных соединений (VE cadherins) и щелевых соединений (коннексины), что позволяет проходить воде и мелким водорастворимым соединениям. В то время как небольшие липофильные молекулы пассивно диффундируют через внутреннюю часть RMECs, движение более крупных липофильных и гидрофильных молекул регулируется АТФ-управляемыми трансэндотелиальными путями, включая везикулярный транспорт и мембранные транспортеры ^5,9.

Везикулярный трансцитоз может быть классифицирован как кавеолин-опосредованный кавеолярный трансцитоз, клатринозависимый (и рецептор-опосредованный) трансцитоз и клатрино-независимый макропиноцитоз (рисунок 2). Эти везикулярные транспортные процессы включают везикулы разного размера, причем макропиносомы являются самыми большими (в диапазоне от 200-500 нм), а кавеолы - самыми маленькими (в среднем 50-100 нм), в то время как везикулы, покрытые клатрином, варьируются от 70-150 нм¹⁰. Кавеолы представляют собой колбовидные липидные инвагинации плазматической мембраны с белковой оболочкой, в основном состоящей из кавеолина-1, который связывает холестерин липидной мембраны и другие структурные и сигнальные белки через их кавеолин-каркасный домен¹¹. Кавеолины работают вместе с периферически прикрепленным кавином, способствуя стабилизации кавеол на плазматической мембране¹². Кавеолярные мембраны также могут нести рецепторы для других молекул, таких как инсулин, альбумин и циркулирующие липопротеины, включая липопротеины высокой плотности (ЛПВП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП), чтобы помочь их движению через эндотелиальные клетки¹³. В процессе развития формирование функционального БРБ зависит от подавления ЭК трансцитоза⁸. Зрелый эндотелий сетчатки, следовательно, имеет относительно низкие уровни кавеол, кавеолин-1 и альбуминовых рецепторов по отношению к другим эндотелиальным клеткам в физиологических условиях, что способствует его барьерным свойствам ^4,9.

Поскольку разрушение iBRB является основным признаком многих патологических заболеваний глаз, важно разработать методы оценки проницаемости сосудов сетчатки in vivo и in vitro. Эти методы помогают обеспечить вероятное понимание механизмов нарушения целостности BRB и оценить эффективность потенциальных терапевтических мишеней. Текущая визуализация in vivo или количественные анализы сосудистой утечки обычно используют флуоресцентные (флуоресцеин натрия и декстран), колориметрические (краситель Evans Blue и субстрат пероксидазы хрена [HRP]) или радиоактивные индикаторы¹⁴ для обнаружения экстравазации из сосудистой системы в окружающие ткани сетчатки с помощью микроскопической визуализации или в изолированном тканевом лизате. Идеальный индикатор для количественной оценки сосудистой целостности должен быть инертным и достаточно большим, чтобы свободно проникать в скомпрометированные сосуды, находясь в пределах здоровых и неповрежденных капилляров. Методы, использующие флуоресцеин натрия или флуоресцеин изотиоцианат-конъюгированный декстран (FITC-декстран) в флуоресцеиновой ангиографии живого глазного дна (FFA) или изолированных плоских креплениях сетчатки, широко используются для количественной экстравазации сетчатки in vivo или ex vivo. FITC-декстран имеет то преимущество, что он доступен в различных молекулярных массах в диапазоне от 4 до 70 кДа для исследований с выбором размера 15,16,17. FITC-альбумин (~68 кДа) является альтернативным крупногабаритным белковым индикатором, имеющим биологическое значение для исследований сосудистой утечки¹⁸. Краситель Evans Blue, вводимый внутрисердечно¹⁹, ретроорбитально или через хвостовую вену²⁰, также полагается на его связывание с эндогенным альбумином с образованием большой молекулы, которая может быть количественно определена в основном спектрофотометрическим обнаружением или, реже, флуоресцентной микроскопией в плоских маунтах^20,21. Однако эти количественные или световые методологии визуализации часто не отличают параклеточный транспорт от трансэндотелиального транспорта. Для специфического анализа трансцитоза с ультраструктурной визуализацией трансцитозированных везикул индикаторные молекулы, такие как HRP, обычно используются для определения местоположения трансцитозированных везикул в эндотелиальных клетках, которые можно наблюдать под электронным микроскопом 22,23,24 (рисунок 3A-C).

Разработка и использование моделей in vitro iBRB для оценки проницаемости эндотелиальных клеток может обеспечить надежную и высокую оценку пропускной способности, чтобы дополнить эксперименты in vivo и помочь в исследовании молекулярных регуляторов сосудистой утечки. Обычно используемые анализы для оценки параклеточного транспорта и целостности плотных соединений включают трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), меру ионной проводимости (Фиг.4)^2,25, и анализ сосудистой утечки in vitro с использованием флуоресцентных индикаторов²⁶ с малой молекулярной массой. Кроме того, анализы трансцитоза на основе трансферрина, моделирующие ГЭБ, были использованы для изучения клатрино-зависимого трансцитоза²⁷. Несмотря на это, анализы для оценки BRB и, более конкретно, кавеолярного трансцитоза EC сетчатки in vitro ограничены.

В этом исследовании мы описываем анализ трансцитоза EC с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs) в качестве модели in vitro для определения проницаемости iBRB и трансцитоза EC. Этот анализ опирается на способность HRMECs транспортировать трансферрин или HRP через рецептор-опосредованные или кавеолы-зависимые пути трансцитоза, соответственно (рисунок 2). HRMECs, культивируемые до полного слияния в апикальной камере (т.е. фильтрующей вставке), инкубировали с флуоресцентно-конъюгированным трансферрином (Cy3-Tf) или HRP для измерения интенсивности флуоресценции, соответствующей уровням трансферрина или HRP, перенесенных в нижнюю камеру исключительно посредством трансцитоза EC. Слияние монослоя ячейки может быть подтверждено измерением TEER, указывающим на целостность плотного соединения²⁵. Для демонстрации метода анализа TEER и трансцитоза использовались известные молекулярные модуляторы проницаемости сосудов и трансцитоза EC, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)²⁸ и те, которые находятся в передаче сигналов Wnt (лиганды Wnt: Wnt3a и Norrin)²⁹.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Бостонской детской больнице для создания световой микроскопии и электромагнитных изображений (рисунок 3). Протоколы исследований in vivo можно получить из Wang et ^al.24. Все эксперименты с участием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs) были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (IBC) в Бостонской детской больнице.

1. Подготовка реагентов

1. Раствор для покрытия тканевой культуры посуды: Готовят 0,1% раствор желатина путем растворения 1 мл раствора желатина (40%-50%) в 500 мл стерильной культуры тканей 1x PBS (рН = 7,4). Процедите раствор через фильтр 0,22 мкм. Хранить 0,1% раствор желатина при температуре 2-8°C. Он может храниться при указанной температуре в течение неопределенного времени в стерильном состоянии.
2. Питательная среда: Приготовьте 500 мл полной среды роста эндотелиальных клеток (EGM) путем растворения добавок EGM в базальной среде роста эндотелиальных клеток (EBM) в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов). Питательная среда Aliquot в пробирки по 50 мл и храните трубки при 4 °C. Срок годности питательной среды составляет 12 месяцев при 4 °C.
3. Раствор трипсина: Для 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, аликвота из запасного флакона в пробирки по 50 мл и хранение при 4 °C (до 2 недель) или −20 °C (до 24 месяцев).

2. Культивирование HRMC

1. Начальная клеточная культура
   1. Покрывать клеточные культуры чашки Петри (диаметром 100 мм х высотой 20 мм) 5 мл 0,1% раствора желатина под ламинарным вытяжкой и держать их нетронутыми в вытяжке в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) для равномерного покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Желатиновое покрытие посуды усиливает прикрепление клеток. В качестве альтернативы можно также использовать колбы для культивирования T75 с желатиновым покрытием.
   2. Перед посевом клеток аспирируйте раствор желатина с помощью вакуумного насоса. Вакуумное давление используемого аспиратора составляло до 724 мм рт.ст.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация должна быть выполнена непосредственно перед посевом клеток, чтобы предотвратить высыхание раствора покрытия.
   3. Разморозьте замороженный флакон HRMECs (из хранения в жидком азоте) либо с помощью водяной бани при 37 °C, либо путем добавления теплой питательной среды во флакон. После размораживания перенесут клеточную суспензию в 9 мл питательной среды (при условии, что размороженный флакон HRMECs составляет 1 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: HRMEC были получены в коммерческих целях (Таблица материалов). Питательная среда, добавляемая в клетки, всегда должна быть предварительно разогрета до 37 °C перед использованием.
   4. Раскрутите клетки при 200 х г в течение 5 мин при RT и осторожно аспирируйте супернатант, чтобы избежать удаления гранулы клетки.
   5. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл питательной среды и переложите полученную суспензию на чашку Петри, покрытую желатином. Храните клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂. Как правило, HRMECs на 70%-80% сливаются через 72 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда роста меняется через день.
2. Субкультура HRMC на проницаемых мембранных вставках
   1. Подготовьте фильтрующие вставки для клеточных культур (вставки 6,5 мм с поликарбонатной мембраной размером 0,4 мкм, помещенные в 24-луночную пластину) для посева HRMEC путем покрытия каждой вставки (апикальной камеры) 200 мкл 0,1% раствора желатина в течение 30 мин под ламинарной проточной вытяжкой. Убедитесь, что раствор покрывает всю нижнюю поверхность фильтрующей вставки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина имеет апикальную и базолатеральную камеры, разделенные пористой мембраной.
   2. Выньте чашку Петри с культивированными HRMECs (шаг 2.1.5.) из инкубатора и аспирируйте питательную среду. Осторожно промойте клетки 2x с 10 мл 1x PBS под ламинарной проточной капюшоном, чтобы избавиться от потенциальных плавающих / мертвых клеток.
   3. Диссоциируют клетки 0,5-1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и помещают чашку Петри в инкубатор (37 °C и 5% CO₂) на 5 мин.
   4. Погасите активность трипсина путем добавления 4,5-9 мл питательной среды и перенесите клеточную суспензию в трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 10 мл.
   5. Раскрутите клетки при 200 х г в течение 5 мин при РТ, осторожно удалите надосадочный материал и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл питательной среды.
   6. Подсчитайте количество ячеек с помощью ручного гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток и посыпайте семена при плотности 4 х 10⁴ ячейки на вставку фильтра (т.е. 1,25 х 10⁵ клеток /^см2). Объем клеточной суспензии для каждой вставки составляет 250 мкл.
   7. Аспирировать раствор покрытия из скважин, содержащих проницаемые вставки, и переносить 250 мкл клеточной суспензии на вставку (апикальную камеру). Добавьте только среду (т.е. без ячеек) к одной из вкладышей, которая будет использоваться в качестве "пустого элемента управления" для измерения TEER. Одновременно добавляют также 750 мкл среды на лунку, в базолатеральные камеры.
   8. Держите 24-луночную пластину с проницаемыми вставками в инкубаторе (37 °C и 5% CO₂) в течение 7-12 дней до тех пор, пока культивируемые клетки не станут полностью сливающимися и не будет достигнуто желаемое значение TEER ~ 20 Ω ·^см2 .
   9. Меняйте питательную среду через день. Во время изменения среды тщательно аспирируйте среду, чтобы свести к минимуму разрушение монослоя клетки, и добавляйте 250 мкл и 750 мкл свежей среды на лунку в апикальную и базолатеральную камеры соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда роста изменяется как для апикальной, так и для базолатеральной камер скважин.

3. Измерения TEER (рисунок 4)

1. На 14-й день после посева ячеек (этап 2.2.9.) измерьте TEER для HRMC с использованием системы электрического сопротивления (ER) эпителиального вольтомметра (EVOM) (Таблица материалов) следующим образом.
2. Предварительно зарядите систему ER и проверьте работоспособность счетчика с помощью тестового электрода STX04. При необходимости выполните калибровку.
3. Подключите электрод к измерителю и уравновешивайте электрод, сначала замачивая его в 70% этаноле в течение 15-20 мин, а затем ненадолго погружая его в питательную среду EGM клеточной культуры.
4. В то же время держите ячейку, содержащую 24 скважины пластины, в ламинарной проточной вытяжке на RT в течение 15-20 минут для выравнивания температуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На измерения TEER влияет температура, поэтому шаг равновесия имеет важное значение.
5. Для измерения TEER добавьте свежую питательную среду как в апикальную (250 мкл), так и в базолатеральную (750 мкл) камеры скважин.
6. Выполните измерение TEER, тщательно погружая электрод таким образом, чтобы более короткий наконечник находился во вставке, а более длинный наконечник касался дна колодца. Сначала измерьте сопротивление на пустом элементе управления. Для каждой вставки измерьте TEER в трех экземплярах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для промывки электрода в промежутках между измерениями используют питательные среды. Убедитесь, что электрод удерживается под углом 90° к нижней части вставки для стабильных показаний.
7. Рассчитать электрическое сопротивление (в Ω·^см2) по всему монослою по формуле TEER = чистое сопротивление (Ω) x площадь поверхности фильтрующей вставки (^см2); здесь чистое сопротивление — это разница между сопротивлением каждой лунки (питательной среды с клетками) и пустой лунки (только питательной среды).
8. Проводят дальнейшую обработку клеток только после того, как значение TEER достигнет ~20 Ω·^см2. Если желаемый уровень TEER не достигнут, держите пластину в инкубаторе и измеряйте TEER на следующий день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние HRMEC также может быть подтверждено морфологическим исследованием формы клеток (под микроскопом) с типичной морфологией булыжника и/или наличием белков клеточного соединения с иммуногистохимическим окрашиванием отдельно.

4. Анализ трансцитоза

1. Анализ трансцитоза in vitro, опосредованный клатрином, с использованием трансферрина, меченого Cy3 (рисунок 5)
   1. При достижении слияния со значениями TEER около 20 Ω·^см2 сыворотка лишает клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO₂ , используя 0,5% FBS в EBM (сывороточно-восстановленная среда) в обеих камерах (апикальная камера: 250 мкл и базолатеральная камера: 750 мкл) перед лечением лигандом. Сывороточно-восстановленный EBM использовался на протяжении всего анализа.
   2. Инкубируют клетки (используя сывороточно-восстановленную среду на стадии 4.1.1.) в апикальной камере флуоресцентным (цианин 3)-меченым трансферриновым лигандом (Cy3-Tf) (конечная концентрация 40 мкг/мл) в течение 60 мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины, содержащие Cy3-Tf, должны быть защищены от света, чтобы избежать фотоотбеливания Cy3-Tf, завернув в них алюминиевую фольгу и выполнив эксперимент в вытяжке клеточной культуры с выключенным светом.
   3. Через 1 ч поместите пластину на лед и промыть монослой апически и базолатерально 4x (3-5 мин на промывку) с восстановленной в сыворотке средой при RT, чтобы удалить свободный несвязанный Cy3-Tf.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка необходима для удаления свободных молекул индикатора и обеспечения точного считывания трансцитоза без потенциальной утечки из параклеточного пути.
   4. Добавьте свежую сывороточную среду (как на этапе 4.1.1.) к тщательно промытым фильтрующим вставкам, содержащим клетки, и переложите вкладыши в свежие колодцы 24-луночной пластины, содержащей предварительно нагретую сывороточную восстановленную среду.
   5. Инкубируют клетки еще 90 мин в инкубаторе (37 °C и 5% CO₂), а затем собирают среду из базолатеральной камеры.
   6. Запишите интенсивность флуоресценции раствора из базолатеральной камеры с помощью флуоресцентного детектора. Уровни интенсивности флуоресценции, измеряемые как относительные флуоресцентные единицы (РФС), указывают на количество комплекса Cy3-Tf, трансцитозируемого через монослой HRMEC через клатрин-зависимый трансцитоз.
2. Анализ трансцитоза in vitro, опосредованный кавеолами, с использованием HRP (рисунок 6)
   1. При достижении полного слияния со значениями TEER около 20 Ω·^см2 сыворотка лишает клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO₂ с использованием 0,5% FBS-содержащей EBM среды (сывороточно-восстановленная среда) перед лечением (как на стадии 4.1.1.). Сывороточно-восстановленная среда EBM использовалась на протяжении всего анализа.
   2. Обработайте клетки в апикальной камере желаемыми методами обработки и контроля транспортного средства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали модуляторы Wnt в качестве примера, чтобы продемонстрировать регуляцию трансцитоза, опосредованного кавеолами, сигнальным путем Wnt в HRMC: человеческий рекомбинантный Норрин и ингибитор Wnt XAV939. В типичном эксперименте клетки обрабатывали в течение 24 ч в инкубаторе (37 °C и 5% CO₂) со следующими концентрациями: Норрин (125 нг/мл), Норрин (125 нг/мл) + XAV939 (10 мкМ) и раствор для управления транспортным средством. Кроме того, использовалась среда, кондиционированная Wnt3a (полученная из клеток L Wnt-3A).
   3. Инкубируют клетки в апикальной камере с HRP (5 мг/мл) в течение 15 мин при 37 °C.
   4. После этого поместите 24-луночную плиту на лед и интенсивно промывайте апикальную и базолатеральную камеры 6x с буфером P (10 мМ HEPES pH = 7,4, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ глюкозы, 3 мМ CaCl₂, 145 мМ NaCl), чтобы удалить свободную внеклеточную HRP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка необходима для удаления свободных молекул индикатора и обеспечения точного считывания трансцитоза без потенциальной утечки из параклеточного пути.
   5. Добавьте свежую сывороточную среду (как на этапе 4.1.1.) в апикальную камеру и переложите вкладыши в свежий колодец, содержащий предварительно подогретую среду.
   6. Инкубируют монослой в течение дополнительных 90 мин в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ перед сбором среды из базолатеральной камеры.
   7. К собранной среде добавляют 100 мкл фторогенного пероксидазного субстрата HRP (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя и инкубируют на RT в течение 10 мин до остановки реакции 100 мкл стоп-раствора.
   8. Обнаружение уровней продукта реакции подложки HRP в среде с помощью считывателя флуоресцентных пластин. Измерьте интенсивность флуоресценции на длине волны излучения 420 нм (с возбуждением 325 нм) и в виде относительных флуоресцентных единиц (РФС). Значения указывают на уровень HRP, трансцитозируемого через слой HRMEC через кавеолы-опосредованный трансцитоз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный продукт, используемый здесь (Таблица материалов), не отбеливает. Светозащита от фотоотбеливания не нужна.

Результаты

ЭМ-изображения эндотелия сосудов сетчатки показывают трансцитотический везикулярный транспорт и кавеолярные везикулы в эндотелиальных клетках in vivo.
EC трансцитоз может быть визуализирован in vivo в поперечных сечениях сетчатки с темно-коричневым о...

Обсуждение

BRB играет важную роль в здоровье и заболеваниях сетчатки. Методы in vitro , оценивающие проницаемость сосудов, оказались важнейшими инструментами в исследованиях, касающихся развития и функции барьеров (BRB / BBB). Процедура, описанная здесь, может быть использована для изучения молекуляр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinet	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	1286
Cell culture petridish	Nest Biotechnology	704001
Centrifuge	Eppendorf	5702
Centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc.	352097
Centrifuge tubes (50 mL)	Denville Scientific Inc.	C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin	Jackson ImmunoResearch	AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)	Lonza Bioscience	CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements	Lonza Bioscience	CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)	Millipore	MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)	Lonza Bioscience	CC-4102B
Gelatin	Sigma-Aldrich	G7765
Hemocytometer (2-chip)	Bulldog Bio	DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)	Sigma-Aldrich	P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)	Cell Systems	ACBRI 181
Incubator	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	3110
L cells (for Control-conditioned medium)	ATCC	CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)	ATCC	CRL-2647
Light microscope	Leica	DMi1
Multimode Plate Reader	EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)	GIBCO	10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit	Thermo Fisher Scientific	15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)	R&D Systems	3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)	R&D Systems	293-VE
Syringe filter (0.22 µm)	Millipore	SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)	Corning Inc.	CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)	GIBCO	25-200-072
Water bath	Precision, Thermo Fisher Scientific	51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)	Selleckchem	S1180