Essai de transcytose cellulaire endothéliale comme modèle in vitro pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne

Résumé

Ce protocole illustre un test in vitro de transcytose des cellules endothéliales comme modèle pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne en mesurant la capacité des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines à transporter la peroxydase de raifort à travers les cellules dans les processus de transport transcellulaire médiés par les cavéoles.

Résumé

Le dysfonctionnement de la barrière hémato-rétinienne (BRB) contribue à la physiopathologie de plusieurs maladies oculaires vasculaires, entraînant souvent un œdème rétinien et une perte de vision subséquente. La barrière interne hémato-rétinienne (BRB) est principalement composée d’endothélium vasculaire rétinien à faible perméabilité dans des conditions physiologiques. Cette caractéristique de faible perméabilité est étroitement régulée et maintenue par de faibles taux de transport paracellulaire entre les cellules endothéliales microvasculaires de la rétine adjacentes, ainsi que par le transport transcellulaire (transcytose) à travers elles. L’évaluation de la perméabilité de la barrière transcellulaire rétinienne peut fournir des informations fondamentales sur l’intégrité de l’IBB dans la santé et la maladie. Dans cette étude, nous décrivons un test de transcytose sur cellules endothéliales (CE), comme un modèle in vitro pour évaluer la perméabilité iBRB, en utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC). Ce test évalue la capacité des HRMECs à transporter la transferrine et la peroxydase de raifort (HRP) dans les processus de transport transcellulaire médiés par les récepteurs et les cavéoles, respectivement. Des HRMECs entièrement confluents cultivés sur membrane poreuse ont été incubés avec de la transferrine marquée par fluorescence (transcytose dépendante de la clathrine) ou HRP (transcytose médiée par les cavéoles) pour mesurer les niveaux de transferrine ou HRP transférés dans la chambre inférieure, indiquant les niveaux de transcytose à travers la monocouche EC. La signalisation Wnt, une voie connue régulant l’iBRB, a été modulée pour démontrer la méthode de dosage de transcytose basée sur HRP médiée par les cavéoles. Le test de transcytose EC décrit ici peut fournir un outil utile pour étudier les régulateurs moléculaires de la perméabilité EC et de l’intégrité iBRB dans les pathologies vasculaires et pour le dépistage des systèmes d’administration de médicaments.

Introduction

La rétine humaine est l’un des tissus les plus exigeants en énergie du corps. Le bon fonctionnement de la rétine neurale nécessite un apport efficace d’oxygène et de nutriments ainsi qu’un flux restreint d’autres molécules potentiellement nocives pour protéger l’environnement rétinien, qui est médié par la barrière hémato-rétinienne (BRB)¹. Semblable à la barrière hémato-encéphalique (BHE) dans le système nerveux central, le BRB agit comme une barrière sélective dans l’œil, régulant le mouvement des ions, de l’eau, des acides aminés et du sucre dans et hors de la rétine. Le BRB maintient également l’homéostasie rétinienne et son privilège immunitaire en empêchant l’exposition à des facteurs circulatoires tels que les cellules immunitaires, les anticorps et les agents pathogènes nocifs². Le dysfonctionnement des BRB contribue à la physiopathologie de plusieurs maladies oculaires vasculaires, telles que la rétinopathie diabétique, la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la rétinopathie du prématuré (RDP), l’occlusion veineuse rétinienne et l’uvéite, entraînant un œdème vasogénique et une perte de vision subséquente ^3,4,5.

Le BRB se compose de deux barrières distinctes pour deux réseaux vasculaires oculaires distincts, respectivement: le système vasculaire rétinien et le choriocapillaire fenêtré sous la rétine. Le BRB interne (iBRB) est principalement composé de cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes (CMRM) qui tapissent le système microvasculaire rétinien, qui nourrit les couches neuronales rétiniennes internes. D’autre part, l’épithélium pigmentaire rétinien forme le composant majeur du BRB externe, qui se situe entre la rétine neurosensorielle et la choriocapillaris². Pour l’IBRi, le transport moléculaire à travers les CEMR s’effectue par les voies paracellulaires et transcellulaires (Figure 1). Le degré élevé de sélectivité de la substance à travers le BRB repose sur (i) la présence de complexes protéiques jonctionnels qui restreignent le transport paracellulaire entre les cellules endothéliales adjacentes (CE), et (ii) les faibles niveaux d’expression des médiateurs, transporteurs et récepteurs des cavéoles dans les cellules endothéliales qui maintiennent de faibles taux de transport transcellulaire 1,6,7,8 . Les complexes jonctionnels régulant le flux paracellulaire sont composés de jonctions serrées (claudines, occludines), de jonctions adhérentes (cadhérines VE) et de jonctions lacunaires (connexines), permettant le passage de l’eau et de petits composés solubles dans l’eau. Alors que les petites molécules lipophiles diffusent passivement à l’intérieur des CMRM, le mouvement des molécules lipophiles et hydrophiles plus grosses est régulé par les voies trans-endothéliales induites par l’ATP, y compris le transport vésiculaire et les transporteurs membranaires ^5,9.

La transcytose vésiculeuse peut être classée comme une transcytose cavéolaire médiée par la cavéoline, une transcytose dépendante de la clathrine (et médiée par les récepteurs) et une macropinocytose indépendante de la clathrine (Figure 2). Ces processus de transport vésiculeux impliquent des vésicules de tailles différentes, les macropinosomes étant les plus grands (allant de 200 à 500 nm) et les cavéoles les plus petits (en moyenne 50 à 100 nm), tandis que les vésicules recouvertes de clathrine vont de 70 à 150 nm¹⁰. Les caveolae sont des invaginations de membrane plasmique riche en lipides en forme de flacon avec une enveloppe protéique, principalement composée de cavéoline-1 qui lie le cholestérol de la membrane lipidique et d’autres protéines structurelles et de signalisation via leur domaine d’échafaudage^{cavéoline 11}. Les cavéolines travaillent avec la cavine attachée par voie périphérique pour favoriser la stabilisation des cavéoles au niveau de la membrane plasmique¹². Les membranes caveolaires peuvent également transporter des récepteurs pour d’autres molécules telles que l’insuline, l’albumine et les lipoprotéines circulantes, y compris les lipoprotéines de haute densité (HDL) et les lipoprotéines de basse densité (LDL) pour faciliter leur mouvement à travers les cellules endothéliales¹³. Au cours du développement, la formation de BRB fonctionnelle dépend de la suppression de la transcytose EC⁸. L’endothélium rétinien mature présente donc des niveaux relativement faibles de récepteurs cavéoles, cavéoline-1 et albumine par rapport aux autres cellules endothéliales dans des conditions physiologiques, contribuant à ses propriétés de barrière ^4,9.

Parce que la dégradation de l’iBRB est une caractéristique majeure de nombreuses affections oculaires pathologiques, il est essentiel de développer des méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire rétinienne in vivo et in vitro. Ces méthodes aident à fournir des informations probables sur les mécanismes de l’intégrité compromise des BRB et à évaluer l’efficacité des cibles thérapeutiques potentielles. Les essais actuels d’imagerie in vivo ou de fuite vasculaire quantitative utilisent généralement des tests fluorescents (fluorescéine de sodium et dextran), colorimétriques (colorant bleu Evans et substrat de peroxydase de raifort [HRP]) ou radioactifs¹⁴ pour détecter l’extravasation du système vasculaire dans les tissus rétiniens environnants avec l’imagerie au microscope ou dans un lysat tissulaire isolé. Un traceur idéal pour quantifier l’intégrité vasculaire devrait être inerte et suffisamment grand pour pénétrer librement les vaisseaux compromis tout en étant confiné dans des capillaires sains et intacts. Les méthodes employant la fluorescéine de sodium ou le dextran conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC-dextran) dans l’angiographie à la fluorescéine vivante du fond d’œil (FFA) ou sur des supports plats rétiniens isolés sont largement utilisées pour quantifier l’extravasation rétinienne in vivo ou ex vivo. FITC-dextran a l’avantage d’être disponible en différents poids moléculaires allant de 4 à 70 kDa pour les études sélectives^{par taille 15,16,17}. La FITC-albumine (~68 kDa) est un traceur protéique alternatif de grande taille présentant une importance biologique pour les études de fuite vasculaire¹⁸. Le colorant Evans Blue, injecté par voie intracardiale19, rétro-orbitale ou par la veine de la queue 20, repose également sur sa liaison avec l’albumine endogène pour former une grosse molécule qui peut être quantifiée par détection spectrophotométrique ou, moins fréquemment, par microscopie à fluorescence dans des supports plats^20,21. Cependant, ces méthodologies d’imagerie quantitative ou lumineuse ne distinguent souvent pas le transport paracellulaire du transport transendothélial. Pour l’analyse spécifique de la transcytose avec visualisation ultrastructurale des vésicules transcytosées, les molécules traceurs telles que HRP sont généralement utilisées pour localiser les vésicules transcytosées dans les cellules endothéliales qui peuvent être observées au microscope électronique^22,23,24 (Figure 3A-C).

Le développement et l’utilisation de modèles in vitro iBRB pour évaluer la perméabilité des cellules endothéliales pourraient fournir une évaluation robuste et à haut débit pour compléter les expériences in vivo et aider à l’étude des régulateurs moléculaires des fuites vasculaires. Les essais couramment utilisés pour évaluer le transport paracellulaire et l’intégrité des jonctions serrées comprennent la résistance électrique transendothéliale (TEER), une mesure de la conductance ionique (Figure 4)^2,25, et le test de fuite vasculaire in vitro utilisant des traceurs fluorescents de faible poids moléculaire ²⁶. De plus, des tests de modélisation de la transcytose à base de transferrine ont été utilisés pour explorer la transcytose dépendante de la clathrine27. Malgré cela, les tests pour évaluer la BRB et, plus spécifiquement, la transcytose cavéolaire EC rétinienne in vitro sont limités.

Dans cette étude, nous décrivons un test de transcytose EC utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC) comme modèle in vitro pour déterminer la perméabilité iBRB et la transcytose EC. Ce test repose sur la capacité des HRMECs à transporter la transferrine ou le HRP via les voies de transcytose médiée par les récepteurs ou dépendantes des cavéoles, respectivement (Figure 2). Les HRMECs cultivés à pleine confluence dans la chambre apicale (c.-à-d. insert de filtre) ont été incubés avec de la transferrine conjuguée fluorescente (Cy3-Tf) ou HRP pour mesurer l’intensité de fluorescence correspondant aux niveaux de transferrine ou HRP transférés à la chambre inférieure par transcytose EC uniquement. La confluence de la monocouche cellulaire peut être confirmée en mesurant TEER, indiquant l’intégrité de la jonction serrée²⁵. Pour démontrer la technique TEER et de dosage de la transcytose, des modulateurs moléculaires connus de la perméabilité vasculaire et de la transcytose EC ont été utilisés, notamment le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF)²⁸ et ceux de la signalisation Wnt (ligands Wnt : Wnt3a et Norrin)²⁹.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Boston Children’s Hospital pour la génération d’images de microscopie optique et EM (Figure 3). Les protocoles pour les études in vivo peuvent être obtenus auprès de Wang et al.24. Toutes les expériences impliquant des cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC) ont été approuvées par le Comité institutionnel de biosécurité (IBC) du Boston Children’s Hospital.

1. Préparation des réactifs

1. Solution pour enrober la capsule de culture tissulaire : Préparer une solution de gélatine à 0,1 % en dissolvant 1 mL de solution mère de gélatine (40 % à 50 %) dans 500 mL de culture tissulaire stérile grade 1x PBS (pH = 7,4). Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm. Conserver la solution de gélatine à 0,1 % entre 2 et 8 °C. Il peut être conservé à ladite température pendant une durée indéterminée dans un état stérile.
2. Milieu de croissance : Préparer 500 mL de milieu complet de croissance cellulaire endothéliale (EGM) en dissolvant les suppléments d’EGM dans le milieu de base de croissance des cellules endothéliales (EBM) conformément aux instructions du fabricant (Tableau des matériaux). Milieu de croissance aliquote dans des tubes de 50 ml et conserver les tubes à 4 °C. La durée de conservation du milieu de croissance est de 12 mois à 4 °C.
3. Solution de trypsine : Pour une solution de trypsine-EDTA à 0,25 %, extraire de la partie aliquote du flacon mère dans des tubes de 50 ml et conserver à 4 °C (jusqu’à 2 semaines) ou −20 °C (jusqu’à 24 mois).

2. Culture des HRMECs

1. Culture cellulaire initiale
   1. Enrobez les boîtes de Petri de culture cellulaire (100 mm de diamètre x 20 mm de hauteur) avec 5 ml de solution de gélatine à 0,1 % sous une hotte à flux laminaire et conservez-les intactes dans la hotte pendant 30 minutes à température ambiante (RT) pour un revêtement uniforme.
      REMARQUE: L’enrobage de gélatine de la vaisselle améliore la fixation des cellules. Alternativement, des flacons de culture T75 enrobés de gélatine peuvent également être utilisés.
   2. Avant d’ensemencer les cellules, aspirez la solution de gélatine à l’aide d’une pompe à vide. La pression de vide de l’aspirateur utilisé était jusqu’à 724 mmHg.
      REMARQUE : L’aspiration doit être effectuée immédiatement avant l’ensemencement des cellules pour éviter le dessèchement de la solution d’enrobage.
   3. Décongeler un flacon congelé de HRMECs (provenant de l’entreposage dans de l’azote liquide) soit en utilisant un bain-marie à 37 °C, soit en ajoutant un milieu de croissance chaud dans le flacon. Une fois décongelée, transférer la suspension cellulaire dans 9 mL de milieu de croissance (en supposant que le flacon décongelé des HRMECs est de 1 mL).
      REMARQUE : Les CMRH ont été obtenues commercialement (Tableau des matières). Le milieu de croissance ajouté aux cellules doit toujours être préchauffé à 37 °C avant utilisation.
   4. Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min à TA et aspirez soigneusement le surnageant pour éviter de retirer la pastille de cellule.
   5. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu de croissance et transférez la suspension résultante sur une boîte de Petri recouverte de gélatine. Conserver les cellules dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂. En règle générale, les HRMECs sont confluents à 70 % à 80 % après 72 h.
      REMARQUE: Le milieu de croissance est changé tous les deux jours.
2. Sous-culture de HRMECs sur inserts membranaires perméables
   1. Préparer des inserts filtrants de culture cellulaire (inserts de 6,5 mm avec membrane de polycarbonate de taille de pores de 0,4 μm, placés dans une plaque de 24 puits) pour l’ensemencement des HRMECs en enduisant chaque insert (chambre apicale) de 200 μL de solution de gélatine à 0,1% pendant 30 minutes sous une hotte à flux laminaire. Assurez-vous que la solution couvre toute la surface inférieure de l’insert du filtre.
      NOTE: Chaque puits a une chambre apicale et basolatérale séparée par une membrane poreuse.
   2. Sortir la boîte de Petri avec des HRMECs cultivés (étape 2.1.5.) de l’incubateur et aspirer le milieu de croissance. Rincez doucement les cellules 2x avec 10 ml de PBS 1x sous une hotte à flux laminaire pour éliminer les cellules flottantes / mortes potentielles.
   3. Dissocier les cellules avec 0,5-1 mL de solution trypsine-EDTA à 0,25% et placer la boîte de Petri dans l’incubateur (37 °C et 5% CO₂) pendant 5 min.
   4. Éteindre l’activité de la trypsine en ajoutant 4,5 à 9 mL de milieu de culture et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL à l’aide d’une pipette de 10 mL.
   5. Faire tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min à TA, retirer délicatement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 3 mL de milieu de culture.
   6. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre manuel ou d’un compteur de cellules automatisé et semer à une densité de 4 x 10⁴ cellules par insert filtrant (c.-à-d. 1,25 x 10⁵ cellules/cm²). Le volume de suspension cellulaire pour chaque insert est de 250 μL.
   7. Aspirer la solution de revêtement des puits contenant des inserts perméables et transférer 250 μL de la suspension cellulaire par insert (chambre apicale). Ajouter uniquement un support (c’est-à-dire sans cellules) à l’un des inserts, qui sera utilisé comme « témoin blanc » pour la mesure TEER. Simultanément, ajoutez également 750 μL de milieu par puits, dans les chambres basolatérales.
   8. Conserver la plaque à 24 puits avec inserts perméables dans l’incubateur (37 °C et 5 % de CO₂) pendant 7 à 12 jours jusqu’à ce que les cellules cultivées deviennent complètement confluentes et que la valeur TEER souhaitée de ~20 Ω·^cm2 soit atteinte.
   9. Changez le milieu de croissance tous les deux jours. Pendant le changement de média, aspirez soigneusement le média pour minimiser la perturbation de la monocouche cellulaire et ajoutez 250 μL et 750 μL de média frais par puits aux chambres apicales et basolatérales, respectivement.
      NOTE: Le milieu de croissance est modifié pour les chambres apicales et basolatérales des puits.

3. Mesures TEER (Figure 4)

1. Le jour 14, après l’ensemencement cellulaire (étape 2.2.9.), mesurer le TEER pour les HRMECs à l’aide d’un système de résistance électrique (ER) volt-ohmmètre épithélial (EVOM) (Tableau des matériaux) comme suit.
2. Préchargez le système ER et vérifiez le fonctionnement du compteur à l’aide de l’électrode de test STX04. Calibrer, si nécessaire.
3. Connectez l’électrode au compteur et équilibrez l’électrode en la trempant d’abord dans de l’éthanol à 70% pendant 15-20 minutes, puis en l’immergeant brièvement dans le milieu de croissance EGM de culture cellulaire.
4. En attendant, conservez la plaque de 24 puits contenant la cellule dans la hotte à flux laminaire à TA pendant 15-20 minutes pour l’équilibre de la température.
   REMARQUE: Les mesures TEER sont affectées par la température, l’étape d’équilibrage est donc essentielle.
5. Pour la mesure TEER, ajouter un milieu de croissance frais aux chambres apicales (250 μL) et basolatérales (750 μL) des puits.
6. Effectuez la mesure TEER en immergeant soigneusement l’électrode de sorte que la pointe la plus courte soit dans l’insert et que la pointe la plus longue touche le fond du puits. Mesurez d’abord la résistance à travers la commande vide. Pour chaque insert, mesurer TEER en trois exemplaires.
   REMARQUE: Pour rincer l’électrode entre les mesures, un milieu de culture est utilisé. Assurez-vous que l’électrode est maintenue à un angle de 90° par rapport au bas de l’insert pour des lectures stables.
7. Calculer la résistance électrique (en Ω·cm 2) à travers la monocouche à l’aide de la formule, TEER = résistance nette (Ω) x surface de l’insert filtrant (cm²); Ici, la résistance nette est la différence entre la résistance de chaque puits (milieu de croissance avec cellules) et le puits blanc (seul milieu de croissance).
8. Effectuer un traitement ultérieur des cellules seulement après que la valeur TEER atteigne ~20 Ω·cm². Si le niveau TEER souhaité n’est pas atteint, conservez la plaque dans l’incubateur et mesurez le TEER le lendemain.
   NOTE: La confluence HRMEC peut également être validée par un examen morphologique de la forme cellulaire (au microscope) avec une morphologie pavée typique et / ou par la présence de protéines de jonction cellulaire avec coloration immunohistochimique séparément.

4. Test de transcytose

1. Essai de transcytose in vitro médiée par la clathrine à l’aide de transferrine marquée au Cy3 (Figure 5)
   1. En atteignant la confluence avec des valeurs TEER autour de 20 Ω·cm 2, le sérum prive les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5% de CO² en utilisant 0,5% FBS dans EBM (milieu réduit au sérum) dans les deux chambres (chambre apicale: 250 μL et chambre basolatérale: 750 μL) avant le traitement avec le ligand. L’EBM réduite en sérum a été utilisée tout au long de l’essai.
   2. Incuber les cellules (à l’aide du milieu sérum réduit à l’étape 4.1.1.) dans la chambre apicale avec un ligand de transferrine marqué fluorescent (cyanine 3) (Cy3-Tf) (concentration finale de 40 μg/mL) pendant 60 min à 37 °C.
      NOTE: Les plaques contenant du Cy3-Tf doivent être protégées de la lumière pour éviter le photoblanchiment du Cy3-Tf en les enveloppant dans du papier d’aluminium et en effectuant l’expérience dans une hotte de culture cellulaire avec les lumières éteintes.
   3. Après 1 h, placer la plaque sur de la glace et laver la monocouche apicale et basolatéralement 4x (3-5 min par lavage) avec le milieu réduit au sérum à TA pour éliminer le Cy3-Tf libre non lié.
      REMARQUE: Le lavage est essentiel pour éliminer les molécules de traceur libres et permettre une lecture précise de la transcytose sans fuite potentielle de la voie paracellulaire.
   4. Ajouter un milieu frais réduit en sérum (comme à l’étape 4.1.1.) aux inserts filtrants soigneusement lavés contenant des cellules et transférer les inserts dans des puits frais de la plaque de 24 puits contenant un milieu préchauffé à sérum réduit.
   5. Incuber les cellules pendant encore 90 minutes dans l’incubateur (37 °C et 5% de CO₂), puis recueillir le milieu dans la chambre basolatérale.
   6. Enregistrer l’intensité de fluorescence de la solution à partir de la chambre basolatérale à l’aide d’un détecteur de fluorescence. Les niveaux d’intensité de fluorescence, mesurés en unités fluorescentes relatives (UFR), indiquent la quantité de complexe Cy3-Tf transcytosée à travers la monocouche HRMEC par transcytose dépendante de la clathrine.
2. Essai de transcytose in vitro médiée par les cavéoles à l’aide de HRP (Figure 6)
   1. Lorsque la confluence est complète avec les valeurs TEER autour de 20 Ω·^cm2, le sérum prive les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5% de CO₂ en utilisant un milieu EBM contenant 0,5% de FBS (milieu réduit au sérum) avant le traitement (comme à l’étape 4.1.1.). Le milieu EBM réduit en sérum a été utilisé tout au long de l’essai.
   2. Traiter les cellules de la chambre apicale avec les traitements et les contrôles de véhicule souhaités.
      REMARQUE: Ici, nous avons utilisé les modulateurs Wnt comme exemple pour démontrer la régulation de la transcytose médiée par les cavéoles par la voie de signalisation Wnt dans les HRMECs: Norrine recombinant humain et inhibiteur de Wnt XAV939. Dans une expérience typique, les cellules ont été traitées pendant 24 heures dans un incubateur (37 °C et 5% de CO₂) avec les concentrations suivantes: Norrin (125 ng / mL), Norrin (125 ng / mL) + XAV939 (10 μM) et solution de contrôle du véhicule. En outre, un milieu conditionné Wnt3a (produit à partir de cellules L Wnt-3A) a également été utilisé.
   3. Incuber les cellules dans la chambre apicale avec HRP (5 mg/mL) pendant 15 min à 37 °C.
   4. Ensuite, placez la plaque de 24 puits sur de la glace et lavez intensément les chambres apicales et basolatérales 6x avec un tampon P (pH HEPES 10 mM = 7,4, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de glucose, 3 mM de CaCl₂, 145 mM de NaCl) afin d’éliminer le HRP extracellulaire libre.
      REMARQUE: Le lavage est essentiel pour éliminer les molécules de traceur libres et permettre une lecture précise de la transcytose sans fuite potentielle de la voie paracellulaire.
   5. Ajouter un milieu frais réduit au sérum (comme à l’étape 4.1.1.) dans la chambre apicale et transférer les inserts dans un puits frais contenant un milieu préchauffé.
   6. Incuber la monocouche pendant 90 minutes supplémentaires dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO₂ avant de recueillir le milieu dans la chambre basolatérale.
   7. Dans le milieu recueilli, ajouter 100 μL de substrat de peroxydase fluorogénique HRP (Table des matières) selon les instructions du fabricant, et incuber à TA pendant 10 minutes avant d’arrêter la réaction avec 100 μL de solution Stop.
   8. Détecter les niveaux de produit de réaction du substrat HRP dans le milieu à l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence. Mesurer l’intensité de fluorescence à une longueur d’onde d’émission de 420 nm (avec une excitation de 325 nm) et en unités fluorescentes relatives (RFU). Les valeurs indiquent le niveau de HRP transcytosé à travers la couche HRMEC par transcytose médiée par les cavéoles.
      REMARQUE : Le produit fluorescent utilisé ici (Tableau des matières) n’est pas photoblanchi. Une protection lumineuse contre le photoblanchiment n’est pas nécessaire.

Résultats

Les images EM de l’endothélium vasculaire rétinien montrent le transport vésiculaire transcytotique et les vésicules cavéolaires dans les cellules endothéliales in vivo.
La transcytose EC peut être visualisée in vivo dans des coupes transversales rétiniennes avec un précipité brun foncé reflétant des vaisseaux sanguins contenant HRP au microscope optique (Figure 3A) et sous forme de précipité dense en électrons indiquant des vésicu...

Discussion

Le BRB joue un rôle essentiel dans la santé et la maladie de la rétine. Les techniques in vitro évaluant la perméabilité vasculaire se sont avérées être des outils cruciaux dans les études concernant le développement et la fonction des barrières (BRB/BBB). La procédure décrite ici pourrait être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transcytose EC ou évaluer les modulateurs moléculaires connexes affectant la perméabilité BRB. In vitro Les tests de tra...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Safety Cabinet	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	1286
Cell culture petridish	Nest Biotechnology	704001
Centrifuge	Eppendorf	5702
Centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc.	352097
Centrifuge tubes (50 mL)	Denville Scientific Inc.	C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin	Jackson ImmunoResearch	AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)	Lonza Bioscience	CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements	Lonza Bioscience	CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)	Millipore	MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)	Lonza Bioscience	CC-4102B
Gelatin	Sigma-Aldrich	G7765
Hemocytometer (2-chip)	Bulldog Bio	DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)	Sigma-Aldrich	P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)	Cell Systems	ACBRI 181
Incubator	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	3110
L cells (for Control-conditioned medium)	ATCC	CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)	ATCC	CRL-2647
Light microscope	Leica	DMi1
Multimode Plate Reader	EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)	GIBCO	10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit	Thermo Fisher Scientific	15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)	R&D Systems	3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)	R&D Systems	293-VE
Syringe filter (0.22 µm)	Millipore	SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)	Corning Inc.	CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)	GIBCO	25-200-072
Water bath	Precision, Thermo Fisher Scientific	51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)	Selleckchem	S1180