Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מדגים בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל במבחנה כמודל להערכת חדירות מחסום הדם-רשתית הפנימית על ידי מדידת יכולתם של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית להעביר פרוקסידאז חזרת על פני תאים בתהליכי הובלה טרנס-תאיים בתיווך caveolae.

Abstract

תפקוד לקוי של מחסום הדם-רשתית (BRB) תורם לפתופיזיולוגיה של מספר מחלות עיניים וסקולריות, שלעתים קרובות גורמות לבצקת רשתית ולאובדן ראייה לאחר מכן. מחסום הדם-רשתית הפנימי (iBRB) מורכב בעיקר מאנדותל כלי דם ברשתית עם חדירות נמוכה בתנאים פיזיולוגיים. תכונה זו של חדירות נמוכה מווסתת היטב ומתוחזקת על ידי שיעורים נמוכים של הובלה פארא-תאית בין תאי אנדותל מיקרווסקולריים ברשתית סמוכים, כמו גם הובלה טרנס-תאית (טרנסציטוזה) דרכם. הערכת חדירות המחסום הטרנס-תאי ברשתית עשויה לספק תובנות בסיסיות לגבי שלמות ה-iBRB בבריאות ובמחלות. במחקר זה אנו מתארים בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל (EC), כמודל חוץ גופי להערכת חדירות iBRB, תוך שימוש בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs). בדיקה זו מעריכה את יכולתם של HRMECs להעביר טרנספרין ופרוקסידאז חזרת (HRP) בתהליכי הובלה טרנס-תאיים בתיווך קולטן וקאוולה, בהתאמה. HRMECs בעלי השפעה מלאה שגודלו בתרבית על ממברנה נקבובית הודגמו עם טרנספרין מתויג פלואורסצנטי (טרנסציטוזה תלוית קלתרין) או HRP (טרנסציטוזה בתיווך caveolae) כדי למדוד את רמות הטרנספרין או HRP שהועברו לתא התחתון, מה שמעיד על רמות טרנסציטוזה על פני המונולייר EC. איתות WNT, מסלול ידוע המווסת את iBRB, הונע כדי להדגים את שיטת הבדיקה הטרנסציטוזה המבוססת על HRP בתיווך caveolae. בדיקת הטרנסציטוזה של EC המתוארת כאן עשויה לספק כלי שימושי לחקר הרגולטורים המולקולריים של חדירות EC ותקינות iBRB בפאתולוגיות וסקולריות ולסינון מערכות אספקת תרופות.

Introduction

הרשתית האנושית היא אחת הרקמות הדורשות אנרגיה הגבוהה ביותר בגוף. תפקוד תקין של הרשתית העצבית דורש אספקה יעילה של חמצן וחומרים מזינים יחד עם שטף מוגבל של מולקולות אחרות שעלולות להזיק כדי להגן על סביבת הרשתית, המתווכת דרך מחסום הדם-רשתית (BRB)1. בדומה למחסום הדם-מוח (BBB) במערכת העצבים המרכזית, ה-BRB פועל כמחסום סלקטיבי בעין, המווסת את תנועת היונים, המים, חומצות האמינו והסוכר אל הרשתית וממנה. BRB גם שומר על הומאוסטזיס ברשתית ועל הפריבילגיה החיסונית שלו על ידי מניעת חשיפה לגורמים במחזור הדם כגון תאי מערכת החיסון, נוגדנים ופתוגנים מזיקים2. תפקוד לקוי של BRB תורם לפתופיזיולוגיה של מספר מחלות עיניים וסקולריות, כגון רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), רטינופתיה של פגות (ROP), חסימת ורידים ברשתית ואובאיטיס, וכתוצאה מכך בצקת וזוגנית ואובדן ראייהלאחר מכן 3,4,5.

ה-BRB מורכב משני מחסומים נפרדים עבור שתי רשתות כלי דם עיניים נפרדות, בהתאמה: כלי הדם ברשתית והכוריוקפילריס הפנסטרטיבי שמתחת לרשתית. ה-BRB הפנימי (iBRB) מורכב בעיקר מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית (RMECs) המרפדים את המיקרו-ווסקולטורה של הרשתית, המזינים את השכבות העצביות הפנימיות ברשתית. מצד שני, אפיתל פיגמנט הרשתית מהווה את המרכיב העיקרי של BRB החיצוני, אשר נמצא בין הרשתית neurosensory ו choriocapillaris2. עבור ה-iBRB, ההובלה המולקולרית על פני RMECs מתבצעת דרך נתיבים על-תאיים וטרנס-תאיים כאחד (איור 1). הרמה הגבוהה של סלקטיביות החומר ב-iBRB מסתמכת על (i) נוכחותם של קומפלקסים של חלבונים צומתיים המגבילים את ההובלה העל-תאית בין תאי אנדותל סמוכים (ECs), ו-(ii) רמות ביטוי נמוכות של מתווכים, מובילים וקולטנים של caveolae בתוך תאי האנדותל השומרים על שיעורים נמוכים של הובלה טרנס-תאית 1,6,7,8 . קומפלקסים צמתים המווסתים את השטף הפארא-תאי מורכבים מצמתים הדוקים (קלודינים, occludins), צמתים דבקים (VE cadherins) וצמתי פער (connexins), המאפשרים מעבר של מים ותרכובות קטנות המסיסות במים. בעוד שמולקולות ליפופיליות קטנות מתפזרות באופן פסיבי על פני פנים ה-RMECs, התנועה של מולקולות ליפופיליות והידרופיליות גדולות יותר מווסתת על ידי מסלולים טרנס-אנדותליים מונעי ATP, כולל הובלה שלפוחיתית ומובילי ממברנות 5,9.

טרנסציטוזה שלפוחיתית עשויה להיות מסווגת כטרנסציטוזה מערות בתיווך קייבולין, טרנסציטוזה תלוית קלתרין (ובתיווך קולטן) ומקרופינוציטוזה שאינה תלויה בקלתרין (איור 2). תהליכי הובלה שלפוחיתיים אלה כוללים בועיות בגדלים שונים, כאשר המקרופינוזומים הם הגדולים ביותר (הנעים בין 200-500 ננומטר) ו-caveolae הם הקטנים ביותר (ממוצע של 50-100 ננומטר), בעוד ששלפוחיות מצופות קלתרין נעות בין 70-150 ננומטר10. Caveolae הם אינווגינציות של קרום פלזמה עשיר בשומנים בצורת בקבוקון עם ציפוי חלבון, המורכב בעיקר מ- caveolin-1 הקושר כולסטרול של קרום השומנים וחלבונים מבניים ואיתותים אחרים באמצעות תחום פיגומי המערותשלהם 11. Caveolins פועלים יחד עם cavin מחובר היקפית כדי לקדם ייצוב caveolae בקרום פלזמה12. ממברנות מערות עשויות גם לשאת קולטנים למולקולות אחרות כגון אינסולין, אלבומין וליפופרוטאינים במחזור, כולל ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) וליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) כדי לסייע לתנועתם על פני תאי האנדותל13. במהלך הפיתוח, היווצרות של BRB פונקציונלי תלוי דיכוי של EC transcytosis8. אנדותל רשתית בוגר, לפיכך, יש רמות נמוכות יחסית של קולטני caveolae, caveolin-1, ו albumin ביחס לתאי אנדותל אחרים בתנאים פיזיולוגיים, תורם תכונות המחסום שלה 4,9.

מכיוון שהתמוטטות iBRB היא סימן היכר מרכזי של מחלות עיניים פתולוגיות רבות, חיוני לפתח שיטות להערכת חדירות כלי הדם ברשתית in vivo ו- in vitro. שיטות אלה מסייעות לספק תובנות סבירות לגבי המנגנונים של שלמות BRB שנפגעה ולהעריך את היעילות של מטרות טיפוליות פוטנציאליות. הדמיית in vivo נוכחית או בדיקות דליפת כלי דם כמותיות משתמשות בדרך כלל בפלואורסצנט (נתרן פלואורסצין ודקסטרון), קולורימטרי (צבע כחול אוונס ומצע פרוקסידאז חזרת [HRP]), או עוקבים רדיואקטיביים14 כדי לזהות אקסטרווזיה מכלי הדם לרקמות הרשתית הסובבות באמצעות הדמיית מיקרוסקופ או בליזאט רקמה מבודדת. עקיבה אידיאלית לכימות שלמות כלי הדם צריכה להיות אינרטית וגדולה מספיק כדי לחדור באופן חופשי לכלי דם פגועים בעודם כלואים בתוך נימים בריאים ושלמים. שיטות המשתמשות בנתרן פלואורסצין או פלואורסצין איזותיוציאנט מצומד דקסטרן (FITC-dextran) באנגיוגרפיה חיה של פונדוס פלואורסצין (FFA) או בתושבות שטוחות רשתית מבודדות נמצאות בשימוש נרחב לכמותית של אקסטרוואסציה ברשתית in vivo או ex vivo. ל-FITC-dextran יש את היתרון בכך שהוא זמין במשקלים מולקולריים שונים הנעים בין 4-70 kDa למחקרים סלקטיביים בגודל15,16,17. FITC-אלבומין (~68 kDa) הוא מעקב חלבוני חלופי בגודל גדול בעל רלוונטיות ביולוגית למחקרי דליפת כלי דם18. הצבע הכחול של אוונס, שהוזרק באופן תוך-קרדיאלי19, רטרו-אורביטלי, או דרך וריד הזנב 20, מסתמך גם על קשירתו עם אלבומין אנדוגני כדי ליצור מולקולה גדולה שניתן לכמת על ידי זיהוי ספקטרופוטומטרי בעיקר, או, פחות נפוץ, מיקרוסקופיה פלואורסצנטיתב-20,21 תושבות שטוחות. עם זאת, מתודולוגיות הדמיה כמותיות או קלות אלה אינן מבחינות לעתים קרובות בין הובלה פארא-תאית לבין הובלה טרנס-אנדותל. לצורך ניתוח ספציפי של טרנסציטוזה עם הדמיה אולטרה-סטרוקטורלית של שלפוחיות טרנסציטוזיות, מולקולות עקיבה כגון HRP משמשות בדרך כלל לאיתור שלפוחיות טרנסציטוזה בתוך תאי אנדותל שניתן לצפות בהן תחת מיקרוסקופ אלקטרונים22,23,24 (איור 3A-C).

הפיתוח והשימוש במודלים של iBRB במבחנה להערכת חדירות תאי האנדותל יכולים לספק הערכת תפוקה חזקה וגבוהה כדי להשלים ניסויי in vivo ולסייע בחקירת הרגולטורים המולקולריים של דליפת כלי דם. מבחנים נפוצים להערכת ההובלה העל-תאית והשלמות של צמתים הדוקים כוללים התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל (TEER), מידה של מוליכות יונית (איור 4)2,25, ובדיקת דליפת כלי דם במבחנה באמצעות עוקבים פלואורסצנטיים במשקל מולקולרי קטן 26. בנוסף, מבחני טרנסציטוזה מבוססי טרנסציטוזה המבוססים על טרנספירין מודלים BBB שימשו לחקר טרנסציטוזה תלוית קלתרין27. למרות זאת, בדיקות להערכת BRB, וליתר דיוק, רשתית EC caveolar transcytosis במבחנה מוגבלים.

במחקר זה, אנו מתארים בדיקת טרנסציטוזה של EC באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs) כמודל במבחנה לקביעת חדירות iBRB וטרנסציטוזה של EC. בדיקה זו מסתמכת על היכולת של HRMECs להעביר טרנספרין או HRP דרך מסלולי טרנסציטוזה בתיווך קולטן או תלויי מערות, בהתאמה (איור 2). HRMECs שגודלו בתרבית למפגש מלא בתא האפיקלי (כלומר, תוסף מסנן) דוגרו עם טרנספרין מצומד-פלואורסצנטי (Cy3-Tf) או HRP כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות המתאימה לרמות הטרנספרין או HRP שהועברו לתא התחתון באמצעות טרנסציטוזה EC בלבד. מפגש של מונולאייר התא יכול להיות מאושר על ידי מדידת TEER, המציין את שלמות הצומת הדוק25. כדי להדגים את טכניקת הבדיקה של TEER וטרנסציטוזה, נעשה שימוש במודולטורים מולקולריים ידועים של חדירות כלי דם וטרנסציטוזה של EC, כולל גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF)28 ואלה באיתות Wnt (ליגנדות Wnt: Wnt3a ונורין)29.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית החולים לילדים בבוסטון ליצירת מיקרוסקופיית אור ותמונות EM (איור 3). פרוטוקולים למחקרי in vivo ניתן לקבל מ- Wang et al.24. כל הניסויים שכללו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs) אושרו על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBC) בבית החולים לילדים בבוסטון.

1. הכנת ריאגנטים

  1. פתרון לציפוי צלחת תרבית רקמה: הכינו תמיסת ג'לטין של 0.1% על ידי המסת 1 מ"ל של תמיסת מלאי ג'לטין (40%-50%) ב-500 מ"ל של תרבית רקמה סטרילית דרגה 1x PBS (pH = 7.4). סנן את הפתרון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן תמיסת ג'לטין של 0.1% בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס. זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורה האמורה במשך זמן בלתי מוגבל במצב סטרילי.
  2. מדיום גדילה: הכן 500 מ"ל של צמיחת תאי אנדותל מדיום שלם (EGM) על ידי המסת תוספי EGM למדיום הבסיסי לצמיחת תאי אנדותל (EBM) בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים). Aliquot צמיחה בינונית לתוך צינורות 50 מ"ל ולאחסן את הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס. חיי המדף של מדיום הצמיחה הם 12 חודשים ב -4 מעלות צלזיוס.
  3. תמיסת טריפסין: עבור תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25%, aliquot מבקבוקון המלאי לצינורות 50 מ"ל ולאחסן ב-4 °C (עד שבועיים) או −20 °C (עד 24 חודשים).

2. טיפוח HRMECs

  1. תרבית תאים ראשונית
    1. תרבית תאי ציפוי צלחות פטרי (קוטר 100 מ"מ x גובה 20 מ"מ) עם 5 מ"ל של תמיסת ג'לטין 0.1% מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית ולשמור אותם ללא הפרעה במכסה המנוע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לציפוי אחיד.
      הערה: ציפוי ג'לטין של כלים משפר את החיבור לתאים. לחלופין, ניתן להשתמש גם בצלוחיות תרבות T75 מצופות ג'לטין.
    2. לפני זריעת התאים, לשאוף את תמיסת הג'לטין באמצעות משאבת ואקום. לחץ הוואקום של השואף ששימש היה עד 724 מ"מ כספית.
      הערה: השאיפה חייבת להיעשות מיד לפני זריעת התאים כדי למנוע התייבשות מתמיסת הציפוי.
    3. הפשרת בקבוקון קפוא של HRMECs (מאחסון בחנקן נוזלי) על ידי שימוש באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או על ידי הוספת מדיום גידול חם לתוך הבקבוקון. לאחר ההפשרה, העבירו את תרחיף התאים ל-9 מ"ל של מדיום גדילה (בהנחה שהבקבוקון המופשר של HRMECs הוא 1 מ"ל).
      הערה: ה- HRMECs הושגו באופן מסחרי (טבלת חומרים). מדיום הגדילה שנוסף לתאים צריך תמיד להיות מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    4. סובב את התאים ב 200 x g במשך 5 דקות ב RT בזהירות לשאוף את supernatant כדי למנוע הסרת גלולה התא.
    5. יש לתלות את גלולת התא ב-10 מ"ל של מדיום גדילה ולהעביר את התרחיף שנוצר על צלחת פטרי מצופה ג'לטין. שמור את התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. בדרך כלל, HRMECs הם 70%-80% מפגש לאחר 72 שעות.
      הערה: מדיום הצמיחה משתנה אחת ליומיים.
  2. תת-תרבות של HRMECs על תוספות ממברנה חדירות
    1. הכן תוספות מסנן תרבית תאים (תוספות 6.5 מ"מ עם קרום פוליקרבונט בגודל נקבוביות 0.4 מיקרומטר, המונחות בצלחת של 24 בארות) לזריעת HRMECs על ידי ציפוי כל תוסף (תא אפיקלי) עם 200 μL של תמיסת ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות מתחת למכסה זרימה למינרית. ודא שהפתרון מכסה את כל המשטח התחתון של תוספת המסנן.
      הערה: לכל באר יש תא אפיקלי ובזולטרלי המופרדים על ידי קרום נקבובי.
    2. הוציאו את צלחת הפטרי עם HRMECs מתורבתים (שלב 2.1.5.) מהאינקובטור ושאפו את מדיית הצמיחה. יש לשטוף בעדינות את התאים פי 2 עם 10 מ"ל של PBS 1x מתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית כדי להיפטר מתאים צפים/מתים פוטנציאליים.
    3. לנתק את התאים עם 0.5-1 מ"ל של 0.25% תמיסת טריפסין-EDTA ולהניח את צלחת פטרי באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2) במשך 5 דקות.
    4. להרוות את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 4.5-9 מ"ל של מדיית גדילה ולהעביר את מתלה התא לתוך צינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה 10 מ"ל.
    5. סובב את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT, להסיר בזהירות את supernatant, ולהשעות את הכדור ב 3 מ"ל של מדיה צמיחה.
    6. ספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר ידני או מונה תאים אוטומטי וזרע בצפיפות של 4 x 104 תאים לכל תוספת מסנן (כלומר, 1.25 x 105 תאים לס"מ2). נפח ההשעיה של התא עבור כל תוספת הוא 250 μL.
    7. שאפו את תמיסת הציפוי מהבארות המכילות תוספות חדירות והעבירו 250 μL של תרחיף התא לכל תוספת (תא apical). הוסף רק מדיום (כלומר, ללא תאים) לאחת התוספות, אשר ישמש כ"פקד ריק " למדידת TEER. בו זמנית, גם להוסיף 750 μL של בינוני לכל באר, בתאים basolateral.
    8. שמור את צלחת 24 באר עם תוספות חדירות באינקובטור (37 °C ו 5% CO 2) במשך 7-12 ימים עד התאים בתרבית להיות מפגש מלא ואת הערך TEER הרצוי של ~ 20 Ω·cm2 מושגת.
    9. שנה את מדיום הצמיחה כל יומיים. במהלך שינוי מדיה, שאפו בזהירות את המדיה כדי למזער את ההפרעה של חד-שכבתי התא והוסיפו 250 μL ו-750 μL של מדיה טרייה לכל באר לתאים apical ו-basolateral, בהתאמה.
      הערה: מדיום הצמיחה משתנה הן עבור התאים האפיקליים והן עבור התאים הבזולטרליים של הבארות.

3. מדידות TEER (איור 4)

  1. ביום 14 לאחר זריעת תאים (שלב 2.2.9.), מדוד את ה- TEER עבור HRMECs באמצעות מערכת התנגדות חשמלית (ER) של מד וולט-אוהם אפיתל (EVOM) (טבלת חומרים) באופן הבא.
  2. טען מראש את מערכת המיון ובדוק את פונקציונליות המונה באמצעות אלקטרודת הבדיקה STX04. כייל, במידת הצורך.
  3. חבר את האלקטרודה למטר ושיווי משקל האלקטרודה על ידי השרייתה תחילה ב-70% אתנול למשך 15-20 דקות ולאחר מכן טבילתה לזמן קצר במדיום הגדילה של EGM בתרבית התא.
  4. בינתיים, שמור את צלחת 24 הבאר המכילה תאים במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ב- RT למשך 15-20 דקות לשיווי משקל טמפרטורה.
    הערה: מדידות TEER מושפעות מהטמפרטורה, ולכן שלב שיווי המשקל חיוני.
  5. למדידת TEER, הוסף מדיום גידול טרי הן לתאים האפיקליים (250 μL) והן לתאים הבזולטרליים (750 μL) של הבארות.
  6. בצע מדידת TEER על ידי טבילה זהירה של האלקטרודה כך שהקצה הקצר יותר נמצא בתוסף והקצה הארוך יותר נוגע בתחתית הבאר. מדוד תחילה את ההתנגדות על-פני הפקד הריק. עבור כל תוספת, מדוד TEER במשולשים.
    הערה: לשטיפת האלקטרודה בין המדידות, נעשה שימוש במדיית תרבית. ודא שהאלקטרודה מוחזקת בזווית של 90° לתחתית התוסף לקריאה יציבה.
  7. חישוב התנגדות חשמלית (ב Ω·ס"מ 2) על פני המונולאייר באמצעות הנוסחה, TEER = התנגדות נטו (Ω) x שטח הפנים של תוספת המסנן (ס"מ2); כאן, התנגדות נטו היא ההבדל בין ההתנגדות של כל באר (מדיום צמיחה עם תאים) לבין הבאר הריקה (רק מדיום צמיחה).
  8. בצע טיפול נוסף בתאים רק לאחר שערך ה- TEER מגיע ל~20 Ω·ס"מ2. אם לא מגיעים לרמת ה- TEER הרצויה, שמור את הצלחת באינקובטור ומדוד את ה- TEER למחרת.
    הערה: מפגש HRMEC יכול להיות מאומת גם על ידי בדיקה מורפולוגית של צורת התא (תחת מיקרוסקופ) עם מורפולוגיה טיפוסית מרוצפת אבן ו / או על ידי נוכחות של חלבונים צומת התא עם צביעת אימונוהיסטוכימיה בנפרד.

4. בדיקת טרנסציטוזה

  1. בדיקת טרנסציטוזה חוץ-גופית בתיווך קלתרין באמצעות טרנספרין מתויג Cy3 (איור 5)
    1. עם ההגעה למפגש עם ערכי TEER סביב 20 Ω·cm 2, סרום לשלול את התאים במשך 24 שעות ב 37 °C ו 5% CO2 באמצעות 0.5% FBS ב EBM (מדיום מופחת בסרום) בשני התאים (תא apical: 250 μL ותא basolateral: 750 μL) לפני הטיפול עם הליגנד. EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה.
    2. דגירה של התאים (באמצעות המדיום המופחת בסרום בשלב 4.1.1.) בתא האפיקלי עם ליגנד טרנספרין (Cy3-Tf) מתויג פלואורסצנטי (ציאנין 3) (ריכוז סופי של 40 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש להגן על לוחות המכילים Cy3-Tf מפני אור כדי למנוע הלבנה של Cy3-Tf על ידי עטיפת רדיד אלומיניום וביצוע הניסוי במכסה מנוע של תרבית תאים כאשר האורות כבויים.
    3. לאחר שעה אחת, הניחו את הצלחת על קרח ושטפו את המונולייר באופן אפי ובזולטרלי 4x (3-5 דקות לשטיפה) עם המדיום המופחת בסרום ב-RT כדי להסיר את Cy3-Tf החופשי שאינו מאוגד.
      הערה: שטיפה חיונית להסרת מולקולות עוקבות חופשיות ומאפשרת קריאה מדויקת של טרנסציטוזה ללא דליפה פוטנציאלית מהמסלול הפרה-תאי.
    4. הוסיפו מדיום מופחת סרום טרי (כמו בשלב 4.1.1.) לתוספות המסנן השטופות היטב המכילות תאים והעבירו את התוספות לבארות טריות של צלחת 24 בארות המכילות מדיום מופחת סרום שחומם מראש.
    5. דגירה של התאים במשך 90 דקות נוספות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2), ולאחר מכן אסוף את המדיום מתא הבזולטרלי.
    6. רשום את עוצמת הפלואורסצנטיות של התמיסה מתא הבזולטרלי באמצעות גלאי פלואורסצנטי. רמות עוצמת הפלואורסצנציה, הנמדדות כיחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU), מצביעות על כמות הטרנסציטוזה של קומפלקס Cy3-Tf המועברת על פני המונו-שכבה HRMEC באמצעות טרנסציטוזה תלוית קלתרין.
  2. בדיקת טרנסציטוזה חוץ-גופית בתיווך מערות באמצעות HRP (איור 6)
    1. עם הגעה למפגש מלא עם ערכי TEER סביב 20 Ω·cm 2, סרום לשלול את התאים במשך 24 שעות ב 37 °C ו 5% CO2 באמצעות 0.5% המכיל FBS בינוני (מדיום מופחת בסרום) לפני הטיפול (כמו בשלב 4.1.1.). מדיום EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה.
    2. טפלו בתאים שבחדר האפיקלי בעזרת הטיפולים הרצויים ובקרות הרכב.
      הערה: כאן, השתמשנו במודולטורים של Wnt כדוגמה כדי להדגים את הרגולציה של טרנסציטוזה בתיווך מערות על ידי מסלול האיתות Wnt ב- HRMECs: מעכב נורין רקומביננטי אנושי ומעכב Wnt XAV939. בניסוי טיפוסי, תאים טופלו במשך 24 שעות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2) בריכוזים הבאים: נורין (125 ננוגרם/מ"ל), נורין (125 ננוגרם/מ"ל) + XAV939 (10 מיקרומטר), ותמיסת בקרת רכב. בנוסף, נעשה שימוש גם במדיום מותנה Wnt3a (המיוצר מתאי L Wnt-3A).
    3. דגירה של התאים בתא האפיקלי עם HRP (5 מ"ג/מ"ל) למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    4. לאחר מכן, הניחו את צלחת 24 הבארות על קרח ושטפו את התאים האפיקליים והבזולטרליים באופן אינטנסיבי פי 6 עם חיץ P (10 mM HEPES pH = 7.4, 1 mM נתרן פירובט, 10 mM גלוקוז, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) על מנת להסיר את HRP החוץ תאי החופשי.
      הערה: שטיפה חיונית להסרת מולקולות עוקבות חופשיות ומאפשרת קריאה מדויקת של טרנסציטוזה ללא דליפה פוטנציאלית מהמסלול הפרה-תאי.
    5. הוסיפו מדיום טרי מופחת בסרום (כמו בשלב 4.1.1.) לתא האפיקלי והעבירו את התוספות לבאר טרייה המכילה מדיה שחוממה מראש.
    6. דגירה מונולייר במשך 90 דקות נוספות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 לפני איסוף המדיום מן התא basolateral.
    7. למדיום שנאסף, יש להוסיף 100 μL של מצע פרוקסידאז פלואורוגני HRP (טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן, ולדגירה ב-RT למשך 10 דקות לפני עצירת התגובה עם 100 μL של תמיסת עצירה.
    8. זהה את הרמות של תוצר תגובת מצע HRP במדיה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באורך גל פליטה של 420 ננומטר (עם עירור של 325 ננומטר) וכיחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU). הערכים מציינים את רמת הטרנסציטוזה של HRP על פני שכבת HRMEC באמצעות טרנסציטוזה בתיווך caveolae.
      הערה: המוצר הפלואורסצנטי המשמש כאן (טבלת חומרים) אינו פוטו-אקונומיקה. אין צורך בהגנה מפני הלבנה.

תוצאות

תמונות EM של אנדותל כלי דם ברשתית מראות הובלה שלפוחיתית טרנסציטוטית ושלפוחיות מערות בתאי אנדותל in vivo.
ניתן לדמיין טרנסציטוזה של EC in vivo בתוך חתכי רשתית עם משקע חום כהה המשקף כלי דם המכילים HRP תחת מיקרוסקופ אור (איור 3A) וכמשקע צפוף אלקטרונים המעיד על שלפו...

Discussion

BRB ממלא תפקיד חיוני בבריאות הרשתית ובמחלותיה. טכניקות במבחנה להערכת חדירות כלי הדם הוכיחו את עצמן ככלים חיוניים במחקרים הנוגעים להתפתחות ותפקוד של מחסומים (BRB/BBB). ההליך המתואר כאן יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס טרנסציטוזה של EC או להעריך מודולטורים מולקולר...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים או אינטרסים כספיים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH (R01 EY028100, EY024963 ו- EY031765) ל- JC. ZW נתמך על ידי מענק קריירה של קרן האבירים הטמפלרים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Biological Safety Cabinet Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific1286
Cell culture petridish Nest Biotechnology704001
Centrifuge Eppendorf5702
Centrifuge tubes (15 mL)Corning Inc.352097
Centrifuge tubes (50 mL)Denville Scientific Inc.C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin Jackson ImmunoResearchAB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza BioscienceCC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplementsLonza BioscienceCC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)MilliporeMERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)Lonza BioscienceCC-4102B
GelatinSigma-AldrichG7765
Hemocytometer (2-chip)Bulldog BioDHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)Sigma-AldrichP8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)Cell SystemsACBRI 181
IncubatorThermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific3110
L cells (for Control-conditioned medium)ATCCCRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)ATCCCRL-2647
Light microscopeLeicaDMi1
Multimode Plate ReaderEnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)GIBCO10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kitThermo Fisher Scientific15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)R&D Systems3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)R&D Systems293-VE
Syringe filter (0.22 µm)MilliporeSLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)Corning Inc.CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)GIBCO25-200-072
Water bathPrecision, Thermo Fisher Scientific51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)SelleckchemS1180

References

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184caveolaeWnt

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved