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요약

이 프로토콜은 카베올라 매개 세포 횡단 수송 과정에서 세포를 가로질러 양 고추냉이 과산화 효소를 운반하는 인간 망막 미세 혈관 내피 세포의 능력을 측정하여 내부 혈액 망막 장벽 투과성을 평가하는 모델로서 시험관 내 내피 세포 트랜스사이토시스 분석을 보여줍니다.

초록

혈액 망막 장벽 (BRB)의 기능 장애는 여러 혈관 안 질환의 병태 생리학에 기여하여 종종 망막 부종 및 후속 시력 상실을 초래합니다. 내부 혈액-망막 장벽(iBRB)은 주로 생리적 조건에서 투과성이 낮은 망막 혈관 내피로 구성됩니다. 낮은 투과성의이 특징은 인접한 망막 미세 혈관 내피 세포 사이의 낮은 세포 간 수송 속도뿐만 아니라이를 통한 세포 간 수송 (transcytosis)에 의해 엄격하게 조절되고 유지됩니다. 망막 세포 횡단 장벽 투과성의 평가는 건강 및 질병에서 iBRB 무결성에 대한 근본적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 연구에서는 인간 망막 미세 혈관 내피 세포 (HRMECs)를 사용하여 iBRB 투과성을 평가하기위한 시험관 내 모델로서 내피 세포 (EC) transcytosis 분석을 설명합니다. 이 분석은 수용체 및 카베올라 매개 세포 간 수송 과정에서 각각 트랜스페린 및 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)를 수송하는 HRMEC의 능력을 평가합니다. 다공성 막에서 배양 된 완전히 합류 된 HRMEC를 형광 태그 트랜스페린 (클라 트린 의존성 트랜스 사이토 시스) 또는 HRP (카베 올라 매개 트랜스 사이토 시스)와 함께 배양하여 EC 단층 전체의 트랜스사이토 시스 수준을 나타내는 바닥 챔버로 전달 된 트랜스페린 또는 HRP의 수준을 측정했습니다. iBRB를 조절하는 알려진 경로인 Wnt 신호전달은 카베올라 매개 HRP 기반 트랜스사이토시스 분석 방법을 입증하기 위해 조절되었습니다. 여기에 설명된 EC 트랜스사이토시스 분석은 혈관 병리학에서 EC 투과성 및 iBRB 무결성의 분자 조절자를 조사하고 약물 전달 시스템을 스크리닝하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.

서문

인간의 망막은 신체에서 가장 높은 에너지를 요구하는 조직 중 하나입니다. 신경 망막의 적절한 기능을 위해서는 망막 환경을 보호하기 위해 잠재적으로 유해한 다른 분자의 제한된 흐름과 함께 산소와 영양소의 효율적인 공급이 필요하며, 이는 망막 장벽(BRB)1을 통해 매개됩니다. 중추 신경계의 혈액-뇌 장벽(BBB)과 유사하게 BRB는 눈의 선택적 장벽 역할을 하여 망막 안팎으로 이온, 물, 아미노산 및 당의 이동을 조절합니다. BRB는 또한 면역 세포, 항체 및 유해한 병원체와 같은 순환 인자에 대한 노출을 방지함으로써 망막 항상성과 면역 특권을 유지합니다2. BRB 기능 장애는 당뇨병성 망막증, 연령 관련 황반변성(AMD), 미숙아 망막병증(ROP), 망막 정맥 폐색 및 포도막염과 같은 여러 혈관 안 질환의 병태생리학에 기여하여 혈관성 부종 및 후속 시력 상실을 초래합니다 3,4,5.

BRB는 각각 두 개의 별개의 안구 혈관 네트워크에 대한 두 개의 개별 장벽으로 구성됩니다 : 망막 혈관 구조와 망막 아래의 창공 된 융모 모세 혈관. 내부 BRB(iBRB)는 주로 망막 미세혈관을 감싸는 망막 미세혈관 내피 세포(RMEC)로 구성되어 있으며, 이는 내부 망막 신경층에 영양을 공급합니다. 한편, 망막 색소 상피는 신경 감각 망막과 융모막 모세 혈관 2 사이에있는 외부 BRB의 주요 구성 요소를형성합니다. iBRB의 경우 RMEC를 통한 분자 수송은 세포 간 경로와 세포 간 경로를 통해 발생합니다(그림 1). iBRB에 걸친 높은 수준의 물질 선택성은 (i) 인접한 내피 세포(EC) 사이의 세포내 수송을 제한하는 접합 단백질 복합체의 존재 및 (ii) 낮은 세포 간 수송 속도를 유지하는 내피 세포 내의 카베올라 매개체, 수송체 및 수용체의 낮은 발현 수준에 의존합니다.1,6,7,8 . paracellular 플럭스를 조절하는 접합 복합체는 단단한 접합 (클로딘, 오클루 딘), 부착 접합 (VE cadherins) 및 갭 접합 (connexins)으로 구성되어있어 물과 작은 수용성 화합물의 통과를 허용합니다. 작은 친유성 분자가 RMEC의 내부를 가로질러 수동적으로 확산되는 반면, 더 큰 친유성 및 친수성 분자의 이동은 소포 수송 및 막 수송체(5,9)를 포함하는 ATP 구동 내피 횡단 경로에 의해 조절됩니다.

수포 트랜스사이토시스는 카베올린 매개 카베올라 트랜스사이토시스, 클라트린 의존성(및 수용체 매개) 트랜스사이토시스 및 클라트린 비의존성 마크로피노사이토시스로 분류할 수 있습니다(그림 2). 이러한 소포 수송 과정은 다양한 크기의 소포를 포함하며, 마크로 피노솜이 가장 크고 (200-500 nm 범위) 카베 올라는 가장 작으며 (평균 50-100 nm), 클라 트린 코팅 소포는 70-150 nm 범위입니다10. Caveolae는 단백질 코트가있는 플라스크 모양의 지질이 풍부한 원형질막 침범으로, 주로 카베 올린 -1로 구성되어 지질막 콜레스테롤 및 기타 구조 및 신호 전달 단백질을 카베 올린-11 도메인을 통해 결합합니다. 카베올린은 원형질막(12)에서 카베올라 안정화를 촉진하기 위해 말초로 부착된 카빈과 함께 작용한다. Caveolar 막은 또한 인슐린, 알부민, 및 고밀도 지단백질 (HDL) 및 저밀도 지단백질 (LDL)을 포함하는 순환 지단백질과 같은 다른 분자에 대한 수용체를 운반하여 내피 세포13을 통한 이동을 지원할 수 있습니다. 발달 중에, 기능성 BRB의 형성은 EC transcytosis8의 억제에 달려있다. 따라서 성숙한 망막 내피는 생리적 조건 하에서 다른 내피 세포에 비해 상대적으로 낮은 수준의 카베올라, 카베올린-1 및 알부민 수용체를 가지며장벽 특성에 기여합니다4,9.

iBRB 파괴는 많은 병리학적 눈 상태의 주요 특징이기 때문에 생체 내 및 체외에서 망막 혈관 투과성을 평가하는 방법을 개발하는 것이 필수적입니다. 이러한 방법은 손상된 BRB 무결성의 메커니즘에 대한 가능한 통찰력을 제공하고 잠재적 치료 표적의 효능을 평가하는 데 도움이 됩니다. 현재의 생체내 이미징 또는 정량적 혈관 누출 분석은 전형적으로 형광(나트륨 플루오레세인 및 덱스트란), 비색(에반스 블루 염료 및 호스래디쉬 퍼옥시다제[HRP] 기질) 또는 방사성 추적자(14)를 사용하여 현미경 이미징 또는 분리된 조직 용해물에서 혈관구조로부터 주변 망막 조직으로의 혈관 외유출을 검출한다. 혈관 무결성을 정량화하기 위한 이상적인 추적자는 불활성이어야 하며 건강하고 온전한 모세혈관 내에 갇혀 있는 동안 손상된 혈관을 자유롭게 투과할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 살아있는 안저 플루오레세인 혈관 조영술(FFA) 또는 분리된 망막 플랫 마운트에서 나트륨 플루오레세인 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트 컨쥬게이트 덱스트란(FITC-덱스트란)을 사용하는 방법은 생체 내 또는 생체 외 망막 혈관 외 유출을 정량하는 데 널리 사용됩니다. FITC-덱스트란은 크기 선택적 연구15,16,17을 위해 4-70kDa 범위의 다양한 분자량으로 이용 가능하다는 장점이 있습니다. FITC- 알부민 (~ 68 kDa)은 혈관 누출 연구18에 대한 생물학적 관련성의 대체 대형 단백질 추적자입니다. 심장 내 (19), 역궤도 또는 꼬리 정맥 (20)을 통해 주입 된 에반스 블루 염료는 또한 내인성 알부민과의 결합에 의존하여 대부분 분광 광도계 검출 또는 덜 일반적으로 플랫 마운트(20,21)에서 형광 현미경에 의해 정량화 될 수있는 큰 분자를 형성한다. 그러나 이러한 정량적 또는 광 이미징 방법론은 종종 세포 내 내 수송과 내피 간 수송을 구별하지 못합니다. 트랜스사이토시스 소포의 초구조적 시각화를 통한 트랜스사이토시스의 특이적 분석을 위해, HRP와 같은 추적 분자는 전형적으로 전자 현미경22,23,24 하에서 관찰될 수 있는 내피 세포 내의 트랜스사이토시스 소포를 찾는 데 사용된다(도 3A-C).

내피 세포 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 iBRB 모델의 개발 및 사용은 생체 내 실험을 보완하고 혈관 누출의 분자 조절자 조사를 지원하기 위해 강력하고 높은 처리량 평가를 제공할 수 있습니다. 초세포 수송 및 단단한 접합의 무결성을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석에는 경내피 전기 저항(TEER), 이온 전도도 측정(그림 4)2,25 및 소분자량 형광 추적자(26)를 사용한 시험관 내 혈관 누출 분석이 포함됩니다. 또한, BBB를 모델링하는 트랜스페린 기반 트랜스사이토시스 분석은 클라트린-의존성 트랜스사이토시스27을 탐구하기 위해 활용되었다. 그럼에도 불구하고, BRB 및 보다 구체적으로, 시험관 내에서 망막 EC 카베올라 트랜스사이토시스를 평가하기 위한 분석은 제한적이다.

이 연구에서는 iBRB 투과성 및 EC 트랜스사이토시스를 결정하기 위한 시험관 내 모델로 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMEC)를 사용하는 EC 트랜스사이토시스 분석을 설명합니다. 이 분석은 각각 수용체 매개 또는 카베올라 의존성 트랜스사이토시스 경로를 통해 트랜스페린 또는 HRP를 수송하는 HRMEC의 능력에 의존합니다(그림 2). 정점 챔버 (즉, 필터 삽입)에서 완전히 응축 된 HRMEC를 형광 공액 트랜스페린 (Cy3-Tf) 또는 HRP와 함께 배양하여 EC 트랜스사이토 시스를 통해 바닥 챔버로 전달 된 트랜스페린 또는 HRP의 수준에 해당하는 형광 강도를 측정했습니다. 세포 단층의 컨플루언스는 TEER을 측정함으로써 확인할 수 있으며, 이는 타이트한 접합 완전성을 나타낸다(25). TEER 및 트랜스사이토시스 분석 기술을 입증하기 위해, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)28 및 Wnt 신호전달(Wnt 리간드: Wnt3a 및 Norrin)29을 포함하여 혈관 투과성 및 EC 트랜스사이토시스의 공지된 분자 조절제가 사용되었습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 광학 현미경 및 EM 이미지 생성을 위해 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(그림 3). 생체내 연구를 위한 프로토콜은 Wang et al.24로부터 얻을 수 있다. 인간 망막 미세 혈관 내피 세포 (HRMECs)와 관련된 모든 실험은 보스턴 아동 병원의 기관 생물 안전위원회 (IBC)의 승인을 받았습니다.

1. 시약의 제조

  1. 조직 배양 접시 코팅용 용액: 멸균 조직 배양 등급 1x PBS(pH = 7.4)의 500mL에 젤라틴 원액 1mL(40%-50%)를 용해시켜 0.1% 젤라틴 용액을 준비합니다. 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과합니다. 0.1% 젤라틴 용액을 2-8°C에 보관하십시오. 상기 온도에서 멸균 상태에서 무기한 보관할 수 있습니다.
  2. 성장 배지: 제조업체의 지침(재료 표)에 따라 EGM 보충제를 내피 세포 성장 기저 배지(EBM)에 용해시켜 내피 세포 성장 완전 배지(EGM) 500mL를 준비합니다. 성장 배지를 50mL 튜브에 분취하고 튜브를 4°C에서 보관합니다. 성장 배지의 저장 수명은 4°C에서 12개월이다.
  3. 트립신 용액: 0.25% 트립신-EDTA 용액의 경우 스톡 바이알에서 50mL 튜브로 분취하여 4°C(최대 2주) 또는 -20°C(최대 24개월)에서 보관합니다.

2. HRMEC 배양

  1. 초기 세포 배양
    1. 층류 후드 아래에 0.1% 젤라틴 용액 5mL로 세포 배양 페트리 접시(직경 100mm x 높이 20mm)를 코팅하고 균일한 코팅을 위해 실온(RT)에서 30분 동안 후드에 방해받지 않고 유지합니다.
      알림: 접시의 젤라틴 코팅은 세포 부착을 향상시킵니다. 대안적으로, 젤라틴-코팅된 T75 배양 플라스크가 또한 사용될 수 있다.
    2. 세포를 파종하기 전에 진공 펌프를 사용하여 젤라틴 용액을 흡인하십시오. 사용 된 흡인기의 진공 압력은 최대 724 mmHg였습니다.
      알림: 코팅 용액이 마르지 않도록 세포를 파종하기 직전에 흡인을 수행해야 합니다.
    3. 37°C의 수조를 사용하거나 바이알에 따뜻한 성장 배지를 추가하여 HRMEC의 냉동 바이알(액체 질소 보관에서)을 해동합니다. 해동되면 세포 현탁액을 9mL의 성장 배지로 옮깁니다(HRMEC의 해동된 바이알이 1mL라고 가정).
      참고 : HRMEC는 상업적으로 획득되었습니다 (재료 표). 세포에 첨가된 성장 배지는 사용하기 전에 항상 37°C로 예열해야 합니다.
    4. RT에서 5분 동안 세포를 200 x g 으로 회전시키고 세포 펠릿이 제거되지 않도록 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.
    5. 세포 펠릿을 10mL의 성장 배지에 재현탁하고 결과 현탁액을 젤라틴 코팅된 페트리 접시에 옮깁니다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이터에 보관한다. 일반적으로 HRMEC는 70시간 후에 80%-72% 합류합니다.
      알림: 성장 배지는 격일로 교체됩니다.
  2. 투과성 멤브레인 인서트에 대한 HRMEC의 계대배양
    1. 층류 후드 아래에서 30분 동안 각 삽입물(정점 챔버)을 0.1% 젤라틴 용액 200μL로 코팅하여 HRMEC를 파종하기 위한 세포 배양 필터 삽입물(0.4μm 기공 크기의 폴리카보네이트 멤브레인이 있는 6.5mm 삽입물, 24웰 플레이트에 배치)을 준비합니다. 용액이 필터 인서트의 전체 바닥 표면을 덮는지 확인하십시오.
      참고: 각 우물에는 다공성 막으로 분리된 정점 및 기저측 챔버가 있습니다.
    2. 배양기에서 배양 된 HRMEC (2.1.5 단계)로 페트리 접시를 꺼내고 성장 배지를 흡인합니다. 층류 후드 아래에서 10mL의 1x PBS로 세포를 2x 부드럽게 헹구어 잠재적인 부유/죽은 세포를 제거합니다.
    3. 세포를 0.5-1mL의 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 해리하고 페트리 접시를 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)에 5분 동안 둡니다.
    4. 4.5-9mL의 성장 배지를 추가하여 트립신 활성을 퀀칭하고 10mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
    5. RT에서 5분 동안 세포를 200 x g 으로 회전시키고, 상청액을 조심스럽게 제거하고, 성장 배지 3mL에 펠릿을 재현탁시킨다.
    6. 수동 혈구계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 계산하고 필터 삽입물당 4 x 104 세포(즉, 1.25 x 105 cells/cm2)의 밀도로 시드합니다. 각 삽입물에 대한 세포 현탁액의 부피는 250μL입니다.
    7. 투과성 삽입물을 포함하는 웰로부터 코팅 용액을 흡인하고 삽입물(정점 챔버)당 250 μL의 세포 현탁액을 옮깁니다. 인서트 중 하나에 배지(즉, 셀 없음)만 추가하면 TEER 측정을 위한 "블랭크 컨트롤"로 사용됩니다. 동시에 기저측 챔버에 웰당 750μL의 배지를 추가합니다.
    8. 배양된 세포가 완전히 합류하고 ~20 Ω·cm2의 원하는 TEER 값이 달성될 때까지 투과성 삽입물이 있는 24웰 플레이트를 인큐베이터(37°C 및 5% CO2)에7-12일 동안 보관합니다.
    9. 격일로 성장 배지를 교체하십시오. 배지를 교체하는 동안 배지를 조심스럽게 흡입하여 세포 단층의 파괴를 최소화하고 웰당 250μL 및 750μL의 신선한 배지를 정점 및 기저측 챔버에 각각 추가합니다.
      참고: 성장 배지는 우물의 정점 및 기저측 챔버 모두에 대해 변경됩니다.

3. 티어 측정(그림 4)

  1. 세포 파종 후 14일째(단계 2.2.9.)에 다음과 같이 상피 전압-옴 미터(EVOM) 전기 저항(ER) 시스템(재료 표)을 사용하여 HRMEC에 대한 TEER을 측정합니다.
  2. ER 시스템을 사전 충전하고 STX04 테스트 전극을 사용하여 미터 기능을 확인하십시오. 필요한 경우 보정합니다.
  3. 전극을 측정기에 연결하고 먼저 70% 에탄올에 15-20분 동안 담근 다음 세포 배양 EGM 성장 배지에 잠시 담가 전극을 평형화합니다.
  4. 그 동안 온도 평형을 위해 셀 함유 24웰 플레이트를 RT의 층류 후드에 15-20분 동안 유지하십시오.
    알림: TEER 측정은 온도의 영향을 받으므로 평형 단계가 필수적입니다.
  5. TEER 측정을 위해 웰의 정점(250μL) 및 기저측(750μL) 챔버 모두에 신선한 성장 배지를 추가합니다.
  6. 짧은 팁이 인서트에 있고 긴 팁이 웰 바닥에 닿도록 전극을 조심스럽게 담그어 TEER 측정을 수행합니다. 먼저 블랭크 컨트롤의 저항을 측정합니다. 각 삽입물에 대해 TEER을 삼중 단위로 측정합니다.
    참고: 측정 사이에 전극을 헹구기 위해 배양 배지가 사용됩니다. 안정적인 판독을 위해 전극이 인서트 바닥과 90° 각도로 유지되는지 확인하십시오.
  7. 공식을 사용하여 단층 전체의 전기 저항 (Ω·cm 2)을 계산하고, TEER = 순 저항 (Ω) x 필터 인서트의 표면적 (cm2); 여기서 순 저항은 각 웰(세포가 있는 성장 배지)과 빈 웰(성장 배지만)의 저항 차이입니다.
  8. TEER 값이 ~20 Ω·cm2에 도달한 후에만 세포의 추가 처리를 수행하십시오. 원하는 TEER 수준에 도달하지 못하면 플레이트를 인큐베이터에 보관하고 다음날 TEER을 측정하십시오.
    참고: HRMEC 컨플루언시는 일반적인 조약돌 형태를 가진 세포 모양의 형태학적 검사(현미경 아래) 및/또는 면역조직화학 염색을 별도로 하는 세포 접합 단백질의 존재에 의해서도 검증될 수 있습니다.

4. 트랜스사이토시스 분석

  1. Cy3-태그된 트랜스페린을 사용한 클라트린 매개 시험관 내 트랜스사이토시스 분석(그림 5)
    1. 약 20 Ω·cm2의 TEER 값과 컨플루언시에 도달하면, 혈청은 리간드로 처리하기 전에 양쪽 챔버(정점 챔버: 250 μL 및 기저측 챔버: 750 μL)에서 EBM(혈청 감소 배지)에서 0.5% FBS를 사용하여 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 세포를 박탈합니다. 혈청-감소된 EBM을 분석 전반에 걸쳐 사용하였다.
    2. 세포를 형광 (시아닌 3) 태그가 부착 된 트랜스페린 리간드 (Cy3-Tf) (최종 농도 40 μg / mL)와 함께 정점 챔버에서 (단계 4.1.1의 혈청 감소 배지를 사용하여) 37 ° C에서 60 분 동안 배양합니다.
      알림: Cy3-Tf가 포함 된 플레이트는 Cy3-Tf의 광표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일을 감싸고 조명을 끈 상태에서 세포 배양 후드에서 실험을 수행하여 빛으로부터 보호해야합니다.
    3. 1 시간 후, 플레이트를 얼음 위에 놓고 RT에서 혈청 환원 배지로 단분자층을 정점 및 기저측으로 4 배 (세척 당 3-5 분) 세척하여 자유 결합되지 않은 Cy3-Tf를 제거합니다.
      알림: 세척은 자유 추적 분자를 제거하고 세포 주위 경로에서 잠재적인 누출 없이 전이세포증의 정확한 판독을 허용하는 데 필수적입니다.
    4. 세포를 포함하는 완전히 세척된 필터 삽입물에 신선한 혈청 감소 배지(단계 4.1.1에서와 같이)를 추가하고 삽입물을 예열된 혈청 감소 배지가 들어 있는 24웰 플레이트의 신선한 웰로 옮깁니다.
    5. 세포를 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)에서 추가로 90분 동안 인큐베이션한 다음, 기저측 챔버로부터 배지를 수집한다.
    6. 형광 검출기를 사용하여 기저측 챔버로부터의 용액의 형광 강도를 기록한다. 상대 형광 단위(RFU)로 측정된 형광 강도 수준은 클라트린 의존성 트랜스사이토시스를 통해 HRMEC 단층에 걸쳐 트랜스사이토싱된 Cy3-Tf 복합체의 양을 나타냅니다.
  2. HRP를 사용한 카베올라 매개 시험관 내 트랜스사이토시스 분석(그림 6)
    1. 약 20 Ω·cm2의 TEER 값을 갖는 완전한 컨플루언시에 도달하면, 혈청은 처리 전에 (단계 4.1.1에서와 같이) 0.5% FBS-함유 EBM 배지(혈청-감소 배지)를 사용하여 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 세포를 박탈한다. 혈청-감소된 EBM 배지를 전체 분석에 걸쳐 사용하였다.
    2. 정점 챔버의 세포를 원하는 치료 및 비히클 제어로 치료하십시오.
      참고: 여기에서는 HRMEC의 Wnt 신호 전달 경로에 의한 카베올라 매개 트랜스사이토시스의 조절을 입증하기 위해 Wnt 조절제를 예로 사용했습니다: 인간 재조합 Norrin 및 Wnt 억제제 XAV939. 전형적인 실험에서, 세포를 다음 농도의 인큐베이터 (37 °C 및 5 % CO2)에서 24 시간 동안 처리 하였다 : Norrin (125 ng / mL) + XAV939 (10 μM) 및 비히클 제어 용액. 또한, Wnt3a-조건화된 배지 (L Wnt-3A 세포로부터 생성됨)도 사용하였다.
    3. 정점 챔버에서 HRP (5 mg / mL)로 세포를 37 ° C에서 15 분 동안 배양합니다.
    4. 그 후, 24웰 플레이트를 얼음 위에 놓고 P 완충액(10mM hepes pH = 7.4, 1mM 나트륨 피루베이트, 10mM 포도당, 3mMCaCl2, 145mM NaCl)으로 정점 및 기저측 챔버를 6x 집중적으로 세척하여 유리 세포외 HRP를 제거합니다.
      알림: 세척은 자유 추적 분자를 제거하고 세포 주위 경로에서 잠재적인 누출 없이 전이세포증의 정확한 판독을 허용하는 데 필수적입니다.
    5. 정점 챔버에 신선한 혈청 환원 배지(4.1.1단계 참조)를 추가하고 삽입물을 예열된 배지가 포함된 새 웰로 옮깁니다.
    6. 기저측 챔버로부터 배지를 수집하기 전에 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에서 추가의 90분 동안 단분자층을 인큐베이션한다.
    7. 수집된 배지에 제조업체의 지침에 따라 100μL의 HRP 플루오로겐 퍼옥시다제 기질(재료 표)을 추가하고 100μL의 Stop 용액으로 반응을 중지하기 전에 RT에서 10분 동안 배양합니다.
    8. 형광 플레이트 리더를 사용하여 배지에서 HRP 기질 반응 생성물의 수준을 검출합니다. 420nm 방출 파장(325nm 여기 포함) 및 상대 형광 단위(RFU)에서 형광 강도를 측정합니다. 이 값은 카베올라 매개 트랜스사이토시스를 통해 HRMEC 층을 가로질러 트랜스사이토시션된 HRP의 수준을 나타냅니다.
      참고: 여기에 사용된 형광 제품(재료 표)은 광표백되지 않습니다. 광 표백에 대한 빛 보호는 필요하지 않습니다.

결과

망막 혈관 내피의 EM 이미지는 생체 내 내피 세포에서 경세포 소포 수송 및 동굴 소포를 보여줍니다.
EC 트랜스사이토시스는 광학 현미경(그림 3A)에서 HRP 함유 혈관을 반사하는 짙은 갈색 침전물이 있는 망막 단면 내에서 생체 내에서 시각화할 수 있으며, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 HRP 함유 트랜스사이토시클(그림 3B,C

토론

BRB는 망막 건강과 질병에 필수적인 역할을 합니다. 혈관 투과성을 평가하는 시험관 내 기술은 장벽 (BRB / BBB) 발달 및 기능에 관한 연구에서 중요한 도구로 입증되었습니다. 여기에 설명 된 절차는 EC transcytosis의 기초가되는 분자 메커니즘을 연구하거나 BRB 투과성에 영향을 미치는 관련 분자 조절제를 평가하는 데 활용 될 수 있습니다. 시험관 내 EC 트랜스사이토시스 분석은 생체 ?...

공개

저자는 공개 할 이해 상충이나 재정적 이익이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 JC에 대한 NIH 보조금(R01 EY028100, EY024963 및 EY031765)의 지원을 받았습니다. ZW는 Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant의 지원을 받았습니다.

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NameCompanyCatalog NumberComments
Biological Safety Cabinet Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific1286
Cell culture petridish Nest Biotechnology704001
Centrifuge Eppendorf5702
Centrifuge tubes (15 mL)Corning Inc.352097
Centrifuge tubes (50 mL)Denville Scientific Inc.C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin Jackson ImmunoResearchAB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza BioscienceCC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplementsLonza BioscienceCC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)MilliporeMERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)Lonza BioscienceCC-4102B
GelatinSigma-AldrichG7765
Hemocytometer (2-chip)Bulldog BioDHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)Sigma-AldrichP8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)Cell SystemsACBRI 181
IncubatorThermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific3110
L cells (for Control-conditioned medium)ATCCCRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)ATCCCRL-2647
Light microscopeLeicaDMi1
Multimode Plate ReaderEnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)GIBCO10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kitThermo Fisher Scientific15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)R&D Systems3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)R&D Systems293-VE
Syringe filter (0.22 µm)MilliporeSLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)Corning Inc.CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)GIBCO25-200-072
Water bathPrecision, Thermo Fisher Scientific51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)SelleckchemS1180

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