无静脉-静脉旁路术的猪肝移植作为扩展标准供体模型

摘要

在该协议中，描述了在植入过程中不使用静脉 - 静脉旁路的情况下对供体器官静态冷藏20小时后猪原位肝移植的模型。该方法使用简化的手术技术，最大限度地减少无肝期，并采用复杂的容量和血管加压药管理。

摘要

肝移植被认为是治疗各种致命肝脏疾病的金标准。然而，慢性移植失败、器官供体持续短缺以及边缘移植物使用增加等未解决的问题要求改进当前的概念，例如器官机器灌注的实施。为了评估移植物修复和调节的新方法，需要转化模型。关于与人类的解剖学和生理学相似性以及异种移植领域的最新进展，猪已成为移植模型中使用的主要大型动物物种。在1965年由Garnier等人首次引入猪原位肝移植模型后，在过去的60年中已经发表了一些修改。

由于特定的解剖学特征，在无肝期进行静脉-静脉搭桥被认为是减少导致血流动力学不稳定和围手术期死亡率的肠充血和缺血的必要条件。然而，旁路的实施增加了程序的技术和后勤复杂性。此外，相关并发症，如空气栓塞、出血和需要同时进行脾切除术，以前已有报道。

在该协议中，我们描述了不使用静脉 - 静脉旁路术的猪原位肝移植模型。静态冷藏20小时后对供体肝脏的植入 - 模拟扩展标准供体条件 - 表明这种简化的方法可以在没有显着血流动力学改变或术中死亡率的情况下进行，并且定期摄取肝功能（由胆汁产生和肝脏特异性CYP1A2代谢定义）。优化的手术技术以及复杂的麻醉容量和血管加压药管理确保了这种方法的成功。

该模型应该对专注于术后即刻病程、缺血再灌注损伤、相关免疫机制和扩展标准供体器官修复的工作组特别感兴趣。

引言

肝移植仍然是导致急性或慢性肝衰竭的各种不同疾病中生存的唯一机会。自1963年Thomas E. Starzl首次在人类中成功应用以来，肝移植的概念已发展成为全球应用的可靠治疗选择，这主要是由于对免疫系统的理解的进步，现代免疫抑制的发展以及围手术期护理和^{手术技术的优化}1^，2.然而，人口老龄化和对器官需求的增加导致献血者短缺，过去几十年中，来自扩展标准捐献者的边际移植物的使用增加，并出现了新的挑战。器官机器灌注的引入和广泛实施被认为为移植物修复和调节开辟了一系列可能性，并有助于缓解器官短缺和降低等待名单死亡率³，⁴，^5，6。

为了评估这些概念及其在体内的效果，需要转化移植模型⁷。1983年，Kamada等人在大鼠中引入了一种有效的原位肝移植模型，该模型已被全球工作组广泛修改和应用8，⁹，^10，11。小鼠原位肝移植模型在技术上要求更高，但在免疫可转移性方面也更有价值，并于1991年由钱等人首次报道¹²。尽管在可用性、动物福利和成本方面具有优势，但啮齿动物模型在^{临床环境中的}适用性有限7。因此，需要大型动物模型。

近年来，猪由于其与人类的解剖和生理相似性，已成为用于转化研究的主要动物物种。此外，目前在异种移植领域的进展可能会进一步增加猪作为研究对象的重要性^13，14。

Garnier等早在1965年就描述了猪肝移植模型¹⁵。几位作者，包括1967年的Calne等人和1971年的Chalsrey等人，随后报告了修改，最终导致了随后几十年内猪肝移植的安全可行的实验性概念¹⁶，¹⁷，¹⁸，¹⁹，^20，21。

最近，不同的工作组使用猪原位肝移植技术提供了有关肝移植当前问题的数据，几乎总是包括主动或被动静脉静脉，即Porto-caval，旁路^19，22。其原因是由于肠相对较大且门腔或腔腔分流较少（例如，缺乏无肝期），对下腔静脉和门静脉钳夹的物种特异性不耐受²³。在人类受者中应用下腔静脉保留移植技术作为替代方案是不可行的，因为猪下腔静脉被肝组织包裹²³。

然而，静脉-静脉旁路的使用进一步增加了已经要求苛刻的外科手术中的技术和后勤复杂性，因此可能会阻止工作组完全尝试实施该模型。除了搭桥术的直接生理和免疫学影响外，一些作者还指出了分流放置期间的显着发病率，例如失血或空气栓塞，以及需要同时进行脾切除术，这可能会影响植入后的短期和长期结果^24，25。

以下协议描述了供体器官静态冷藏20小时后猪原位肝移植的简单技术，代表在植入过程中不使用静脉 - 静脉旁路的扩展标准供体条件，包括供体肝脏采购，背台准备，受体肝切除术和麻醉术前和术中管理。

该模型对于专注于术后即刻病程、缺血再灌注损伤、扩展标准供体器官的修复以及相关免疫机制的外科工作组应特别感兴趣。

研究方案

这项研究是在下萨克森州消费者保护和食品安全管理局（Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit [LAVES]; 19/3146）批准后在汉诺威医学院动物科学实验室进行的。

1. 供体肝脏采购

注意:肝脏供体是雌性家猪（Sus scrofa homeus），年龄为4-5个月大，平均体重约为50公斤，在手术前已经在动物研究机构隔离了至少10天。

1. 通过肌内注射阿托品（0.04-0.08 mg/kg 体重）、唑拉西泮（5 mg/kg 体重）和蒂他明（5 mg/kg 体重）进行术前用药。建立静脉通路（例如耳静脉）后，注射丙泊酚（1.5 - 2.5 mg / kg体重）诱导麻醉。
2. 根据动物的大小和解剖结构，使用 8.0-8.5 mm 气管插管进行插管。建立心电图监测、呼吸气体和外周血氧饱和度测量、无创血压测量。
3. 在通过吸入异氟醚（0.8-1.5体积%）和静脉内应用芬太尼（0.003-0.007mg / kg体重） 进行 供体肝脏采购期间维持猪的麻醉。在整个过程中进行容量控制的通气。
4. 将供体猪置于仰卧位并用松紧带将四肢固定在手术台底部后，用防腐剂（例如聚维酮碘或异丙醇）擦洗皮肤，并用无菌窗帘覆盖动物。
5. 通过失去对脚趾夹的戒断反应来确认足够的麻醉深度。使用单极烧灼术从剑突开始进行中线剖腹手术。放置腹部牵开器并将肠活动到供体的右侧。
6. 通过解剖脾结肠韧带、胃脾韧带和膈脾韧带进行脾切除术。用Overholt夹住脾门附近的脾静脉和脾动脉，并在切断血管后放置结扎（3-0多丝缝合线）。通过双极镊子或结扎切断额外的（较小）血管。
   注意:在供体肝脏采购期间进行脾切除术不是强制性的，但可以减少灌注期间和之后的血液外排。
7. 将肠动员到供体的左侧，并使用剪刀和双极烧灼切断镰状韧带和三角韧带。
8. 充分解剖肝脏后，用剪刀在5-10厘米的距离内切开横膈膜的左侧部分，以定位降主动脉的胸段。包围并放置结扎（3-0多丝缝合线），不要拧紧。
9. 用剪刀在5-10厘米的距离内切开横膈膜的右侧部分，并确定下腔静脉。
10. 将肠重新定位到供体的左上角，并使用剪刀在5-10厘米的距离内横向切开腹膜进入腹膜后空间。
11. 将腹主动脉和下腔静脉定位在髂骨分叉上方，并将两根血管分开，长度约为 6 cm。在腹主动脉周围放置两个 3-0 多丝结扎:一个髂骨分叉的颅骨和一个约 3 cm 的颅骨，不要收紧。在肝内腔静脉周围放置另一个结扎，不要收紧。
12. 静脉注射肝素（25，000 即）。选择合适的套管，并用冷却的保存溶液对滴灌管进行脱气。
13. 收紧腹主动脉周围的尾部第一结扎。在第二结扎的颅骨上阻塞腹主动脉后（手动或通过放置无创伤血管夹），使用剪刀在两个结扎之间做一个横向切口。
14. 将套管插入切口并用剩余的结扎固定。用剪刀切断颅上下腔静脉（靠近右心房）。
15. 失血约 1，500-2，000 mL 后，通过结扎交叉夹住降主动脉的胸段并开始顺行灌注。
    注意:对于植入期间可能需要的血液（输血）或正常热能机器灌注，可以使用含有柠檬酸盐抗凝剂的容器收集全血（约1，500毫升）。
16. 收紧放置在肝下腔静脉周围的结扎，切开结扎的颅骨血管，并插入手术吸引器。注射致死剂量的戊巴比妥钠（5，000毫克）。将粉碎的无菌冰放入胸腔和腹腔，而不会影响肝组织。
17. 用3，500mL保存溶液灌注约10-15分钟后，切断切开的下腔静脉。切断左肾静脉水平下肝下腔静脉。
18. 在两个结扎线（3-0 多丝）之间切断胰腺组织的胆管颅骨，以避免胆汁溢出。切断胰腺的门静脉颅骨。
19. 钝器准备后找到乳糜泻动脉，然后沿着腹主动脉背侧。切除相应的主动脉段，以便为以后的植入创建贴片。
20. 切除下腔静脉周围的隔膜，并用剪刀切断剩余的粘连。提取肝脏。
21. 进行胆囊切除术或收紧胆囊管周围的结扎，并用至少 20 mL 的保存溶液冲洗胆总管。将灌注插管放入门静脉，并用另外 500 mL 保存溶液冲洗移植物。将移植物放入放在冰上的无菌碗中。
    注意:根据科学目标，在开始后台准备和植入之前，可以立即准备器官进行植入或在冰上无限期地保持（本协议中为20小时）。

2. 肝脏的背台准备

1. 从主动脉段开始切除淋巴组织，从而用夹子、结扎线（4-0 多丝）或缝合线（5-0 单丝; 图1A）。同样，去除门静脉周围的淋巴组织，并用缝合线（5-0单丝）闭塞侧枝。
2. 识别下腔静脉，并在去除周围膈肌组织后，在两条膈静脉（5-0 单丝）周围缝合。用冷盐水或保存溶液冲洗所有容器，以识别任何残留的泄漏。仅在植入时进行血管缩短和主动脉瓣贴片的准备，以考虑个体解剖情况。

3.受者肝切除术、供体肝植入术及围手术期管理

注意:作为肝脏接受者，使用4-5个月大，平均体重约为50公斤的雌性家猪（Sus scrofa homeus）。与肝脏捐赠者类似，接受者在移植前已在动物研究机构隔离至少10天。

1. 麻醉和围手术期管理
   1. 通过肌内注射阿托品（0.04-0.08 mg/kg 体重）、唑拉西泮（5 mg/kg 体重）和蒂他明（5 mg/kg 体重）进行术前用药。建立静脉通路（例如耳静脉）后，注射丙泊酚（1.5-2.5 mg/kg 体重）诱导麻醉。
   2. 根据动物的大小和解剖结构，使用 8.0-8.5 mm 气管插管进行插管。建立心电图监测、呼吸气体和外周血氧饱和度测量、无创血压测量。在慢性模型的情况下，涂抹眼膏以避免手术干预后干燥。
   3. 将受体动物仰卧放在加热底座上，并用松紧带将四肢固定在手术台的底座上。
   4. 为了进行扩展监测，在超声引导下，将一根三腔中心静脉导管和一根大口径静脉导管（7 Fr.）放入颈内静脉，并将一根大口径静脉导管（7 Fr.）放入容量治疗。此外，在超声控制下将动脉导管插入颈内动脉/颈动脉以进行有创血压测量（图1B）。
   5. 通过吸入异氟醚（0.8-1.5体积%）和静脉内应用芬太尼（0.003-0.007mg / kg体重） 在 器官提取期间维持麻醉。在整个过程中进行容量控制的通气。使用 2，000 mg 舒他西林用于围手术期抗生素治疗，静脉注射 250 mg 甲泼尼龙。
   6. 静脉给予去甲肾上腺素等血管加压药，以达到 60 mmHg 的目标平均动脉压。此外，如有必要，使用晶体溶液，如林格氏乳酸溶液或胶体溶液，如液体明胶。
   7. 静脉注射葡萄糖酸钙 （10%） 和碳酸氢钠 （8.4%）、葡萄糖 （40%） 或氯化钾 （7.45%），每 30 分钟进行一次血气分析。
2. 受者肝切除术
   1. 用防腐剂擦洗皮肤，例如聚维酮碘或异丙醇，并用无菌窗帘覆盖动物。
   2. 通过失去对脚趾夹的戒断反应来确认足够的麻醉深度。使用单极烧灼术从剑突开始进行中线剖腹手术。放置腹部牵开器并将肠活动到供体的左侧。用湿布覆盖肠道。
   3. 放置耻骨上导尿管以优化术中容量管理。
   4. 用剪刀和双极烧灼切断镰状韧带和三角韧带。充分解剖肝脏后，将靠近肝实质的下腔静脉包围。
   5. 解剖并切断两个结扎（3-0 多丝）之间胆囊管交界处下方的胆总管。
   6. 切开覆盖肝十二指肠韧带的浅表腹膜层，并在进入肝实质前不久识别肝动脉。使用双极烧灼或夹子、结扎或缝合线进行解剖。
   7. 通过在左右膈肌的中线（无血管层）切开切口解剖腹主动脉。通过切除周围组织来准备主动脉吻合术。
      注意:仅当进行主动脉吻合时才需要此步骤。否则，进一步解剖肝动脉/肺门区域，为供体和受体肝动脉之间的常规端到端吻合做好准备。
   8. 进行受者肝切除术，在门静脉上放置无创伤血管钳夹，然后在下腔静脉（包括周围的膈肌，同时尾部回缩肝脏）和下肝下腔静脉上进行无创伤血管钳夹。
   9. 切断靠近肝实质的所有三条血管。从腹腔中取出受体肝脏。
      注意:血管的夹紧标志着无肝期的开始。在无肝期，猪血流动力学不稳定，需要相关量的血管加压药/儿茶酚胺。麻醉师应准备使用去甲肾上腺素和肾上腺素。保持阶段直到肝脏再灌注尽可能短。与麻醉师良好沟通。
3. 供体肝植入
   1. 将供体肝脏放入腹腔。将供体和/或受体下腔静脉缩短至足够长度，同时避免吻合口扭结或张力过大。
   2. 放置一条缝合线作为支撑线（5-0单丝），适应供体和受体下腔静脉的右角。从血管的左角开始吻合的背侧，用运行缝合线（5-0单丝，双臂）。
   3. 到达右角时，取下支撑线，用夹子固定运行缝合线，然后继续吻合口的腹侧，再次从血管的左角开始。用多个结收紧缝合线，不要限制血管直径，以避免狭窄。
   4. 将供体和/或受体门静脉缩短至足够的长度，同时避免吻合口扭结或张力过大。
   5. 使用6-0单丝双臂缝合线对供体和受体门静脉进行血管吻合，类似于步骤3.3.2-3.3.3。
   6. 通过移除血管钳夹、阻塞受体门静脉进行门静脉再灌注，并在引流约 200-400 mL 血液后用血管钳夹闭塞供体下腔静脉。慢慢移除阻塞下腔静脉受体的血管钳夹，并寻找活动性出血。
      注意:两个夹具的移除标志着无肝期的结束。此后不久，所需的儿茶酚胺量应显着减少。
   7. 缩短供体和/或受体下腔静脉。使用5-0单丝双臂缝合线对供体和受体下肝下腔静脉进行血管吻合，类似于步骤3.3.2-3.3.3。取下封闭供体和受体下肝下静脉的夹子。
   8. 根据解剖情况，使用剪刀准备直径约为1-1.5厘米的椭圆形主动脉贴片（Carrel贴片）。用无创伤性Cooley血管夹夹住腹主动脉，并使用手术刀切开。用剪刀扩大切口以适合贴片。
   9. 在切口/贴片的颅角处进行跑步缝合（6-0单丝，双臂）开始主动脉吻合术。当到达尾角时，用夹子固定运行缝合线，并从颅角开始再次完成吻合。用多个结拧紧缝合线，慢慢取下血管夹。
      注意:夹住腹主动脉会显着影响猪的血压。与麻醉师良好沟通。
   10. 在动脉吻合口周围放置止血纱布。将导管置于胆总管中，并用单个结扎将其固定。确保不要堵塞导管的直径。
   11. 通过调整肌肉筋膜和皮肤，用跑步缝合线暂时关闭腹部，并用保鲜膜和/或窗帘覆盖腹部以避免热损失。
       注意:如果科学目标需要慢性模型，请在供体和受体胆管之间进行端到端吻合，用腹膜和肌肉筋膜的单独运行缝合线关闭腹部，并用单缝合线闭合皮肤。
   12. 随访结束时，注射致死剂量的 5，000 mg 戊巴比妥钠用于术中安乐死。

结果

该方案中提出的技术在整个手术过程中的血流动力学稳定性和动物存活率以及术后移植物功能方面提供了可靠且可重复的结果。

最近，我们将该模型应用于缺血再灌注损伤的研究和治疗干预，以减轻术后立即的不利影响。取回和静态冷藏20小时后，以所述方式植入肝脏移植物（平均重量为983.38g）。在门静脉再灌注并以规定的时间间隔采样血液和胆汁以及肝脏和胆管组织采样?...

讨论

最近的技术发展，如机器灌注的引入，有可能彻底改变肝移植领域。为了将移植物修复或修饰概念转化为临床环境，大型动物的可重复移植模型是不可避免的。

在猪原位肝移植最初引入后，在过去的五十年中，几位作者一直致力于改进这些技术。所报道的手术方法之间的差异通常很小，涉及血管和胆道吻合、麻醉和围手术期管理。尽管如此，与目前临床肝移植的情况相反，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abdominal retractor	No Company Name available	No Catalog Number available
Aortic clamp, straight	Firma Martin	No Catalog Number available
Arterial Blood Sampler Aspirator (safePICOAspirator) 1.5 mL	Radiometer Medical ApS	956-622
Atropine (Atropinsulfat 0.5 mg/1 mL)	B.Braun	648037
Backhaus clamp	Bernshausen	BF432
Bipolar forceps, 23 cm	SUTTER	780222 SG
Bowl 5 L, 6 L, 9 L	Chiru-Instrumente	35-114327
Braunol Braunoderm	B.Braun	3881059
Bulldog clamp	Aesculap	No Catalog Number available
Button canula	Krauth + Timmermann GmbH	1464LL1B
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL (10%))	B.Braun	2353745
Cell Saver (Autotransfusion Reservoir)	Fresenius Kabi AG	9108471
Central venous catheter 7Fr., 3 Lumina, 30 cm 0.81 mm	Arrow	AD-24703
Clamp	INOX	B-17845  /  BH110  / B-481
Clamp	Aesculap	AN909R
Clamp, 260 mm	Fehling Instruments GMbH &Co.KG	ZAU-2
Clip Forceps, medium	Ethicon	LC207
Clip forceps, small	Ethicon	LC107
CPDA-1 solution	Fresenius Kabi AG	41SD09AA00
Custodiol (Histidin-Tryptophan-Ketogluterat-Solution)	Dr.Franz Köhler Chemie GmbH	2125921
Dissecting scissors	LAWTON  05-0641	No Catalog Number available
Dissecting scissors, 180 mm	Metzenbaum	BC606R
Endotracheal tube 8.0 mm	Covetrus	800764
Epinephrine (Adrenalin 1:1000)	InfectoPharm	9508734
Falcon Tubes 50ml	Greiner	227 261 L
Femoralis clamp	Ulrich	No Catalog Number available
Fentanyl 0.1mg	PanPharma	00483
Forceps, anatomical	Martin	12-100-20
Forceps, anatomical, 250 mm	Aesculap	BD052R
Forceps, anatomical, 250 mm	Aesculap	BD032R
Forceps, anatomical, 250 mm	Aesculap	BD240R
Forceps, surgical	Bernshausen	BD 671
Forceps, surgical	INOX	B-1357
G40 solution	Serag Wiessner	10755AAF
Gelafundin ISO solution 40 mg/mL	B. Braun	210257641
Guidewire with marker	Arrow	14F21E0236
Haemostatic gauze ("Tabotamp"  5 x 7.5 cm)	Ethicon	474273
Heparin sodium 25,000IE	Ratiopharm	W08208A
Hico-Aquatherm 60	Hospitalwerk	No Catalog Number available
Infusion Set Intrafix	B.Braun	4062981 L
Intrafix SafeSet 180 cm	B.Braun	4063000
Introcan Safety, 18 G	B.Braun	4251679-01
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-bore venous catheter, 7Fr.	Edwards Lifesciences	I301F7
Ligaclip, medium	Ethicon	LT200
Ligaclip, small	Ethicon	LT100
Material scissors	Martin	11-285-23
Methylprednisolone (Urbason solubile forte 250 mg)	Sanofi	7823704
Monopolar ERBE ICC 300	Fa. Erbe	No Catalog Number available
NaCl solution (0.9%)	Baxter	1533
Needle holder	Aesculap	BM36
Needle holder	Aesculap	BM035R
Needle holder	Aesculap	BM 67
Neutral electrode	Erbe Elektromedizin GmbH Tübingen	21191 - 060
Norepinephrine (Sinora)	Sintetica GmbH	04150124745717
Omniflush Sterile Filed 10 mL	B.Braun	3133335
Original Perfusorline 300 cm	B.Braun	21E26E8SM3
Overhold clamp	INOX	BH 959
Overhold clamp	Ulrich	CL 2911
Pentobarbital sodium(Release 500 mg/mL)	WDT, Garbsen	21217
Perfusers	B.Braun	49-020-031
Perfusor Syringe 50 mL	B.Braun	8728810F
Petri dishes  92 x 17 mm	Nunc	150350
Poole Suction Instrument Argyle flexibel	Covidien, Mansfield USA	20C150FHX
Potassium chloride (7.45%)	B.Braun	4030539078276
Pressure measurement set	Codan pvb Medical GmbH	957179
Propofol (1%)	CP-Pharma	No Catalog Number available
S-Monovette 2.6 mL K3E	Sarstedt	04.1901
S-Monovette 2.9 mL 9NC	Sarstedt	04.1902
S-Monovette 7.5 mL Z-Gel	Sarstedt	11602
Sartinski clamp	Aesculap	No Catalog Number available
Scalpel  No.11	Feather Safety Razor Co.LTD	02.001.40.011
Scissors	INOX	BC 746
Seldinger Arterial catheter	Arrow	SAC-00520
Sodium bicarbonate (8.4%)	B.Braun	212768082
Sterilization Set ("ProSet Preparation Kit CVC")	B.Braun	4899719
Sterofundin ISO solution	B.Braun	No Catalog Number available
Suction	Dahlhausen	07.068.25.301
Suction Aesculap Securat 80	Aesculap	No Catalog Number available
Suction catheter	ConvaTec	5365049
Sultamicillin (Unacid: 2000 mg Ampicillin/1000 mg Sulbactam)	Pfizer	DL253102
Suprapubic urinary catheter, "bronchialis", 50 cm	ConvaTec	UK  1F02772
Suprasorb ("Toptex lite RK")	Lohmann & Rauscher	31654
Suture Vicryl 3-0	Ethicon	VCP 1218 H
Suture Vicryl 4-0	Ethicon	V392H
Suture, Prolene 4-0	Ethicon	7588 H
Suture, Prolene 5-0, double armed	Ethicon	8890 H
Suture, Prolene 5-0, single armed	Ethicon	8720 H
Suture, Prolene 6-0, double armed	Ethicon	7230 H
Suture, Prolene 6-0, single armed	Ethicon	EH 7406 H
Suture, Prolene: blau 3-0	Ethicon	EH 7499H
Suture, Safil 2/0	Aesculap	C 1038446
Suture, Terylene 0	Serag Wiessner	353784
Syringe 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL	B.Braun	4606027V
TransferSet "1D/X-double" steril 330 cm	Fresenius Kabi AG	2877101
Ultrasound Butterfly IQ+	Butterfly Network Inc.	850-20014
Ventilator "Oxylog Dräger Fl"	Dräger Medical AG	No Catalog Number available
Yankauer Suction	Medline	RA19GMD
Zoletil 100 mg/mL  (50 mg Zolazepam, 50 mg tiletamin)	Virbac	794-861794861