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摘要

该协议描述了一种使用CRISPR-Cas9技术促进斑马鱼胚胎精确敲入编辑的方法。提出了一个表型管道，以证明这些技术对长QT综合征相关基因变异进行建模的适用性。

摘要

动物模型中成簇规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）能够为生理现象的研究提供精确的遗传操作。斑马鱼已被用作有效的遗传模型，在全器官和生物体水平上研究与遗传性疾病，发育和毒理学相关的许多问题。由于斑马鱼基因组注释和映射良好，已经开发了许多用于基因编辑的工具。然而，使用CRISPR生成和检测精确敲入编辑的有效性是一个限制因素。这里描述的是一种基于CRISPR-Cas9的敲入方法，该方法可以简单地检测负责心脏复极化并与电障碍长QT综合征（LQTS）相关的基因的精确编辑。这种双单向导RNA（sgRNA）方法切除并替换了靶序列，并连接了基因编码的报告基因。通过描述野生型和基因编辑斑马鱼幼虫心脏电功能的非侵入性表型测量，证明了这种方法的实用性。这种方法能够有效地研究整个生物体中与疾病相关的变异。此外，该策略为插入选择的外源序列提供了可能性，例如报告基因、直系同源物或基因编辑器。

引言

动物模型中基于CRISPR的基因编辑策略能够在全生物体水平上研究遗传性疾病，发育和毒理学1，2，3。斑马鱼提供了一个强大的模型，在许多生理方面比小鼠或人类来源的细胞模型更接近人类4。斑马鱼已经使用了广泛的遗传工具和策略，用于正向5和反向遗传筛选6。斑马鱼的综合遗传图谱和注释促进了基因编辑方法，成为设计靶向基因敲除（KO）和精确敲入（KI）的主要技术7。

尽管如此，在斑马鱼中生成精确的KI编辑受到效率低和准确检测困难的限制。尽管转录因子样效应核酸酶（TALENs）已成功用于KIs 8并进行了优化，但CRISPR提供了一种改进的基因编辑策略，具有更简单的sgRNA靶向。许多研究已经使用CRISPR在斑马鱼9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20中生成精确的KI，尽管通过CRISPR介导的同源定向修复（HDR）产生的这些编辑往往效率低下，内在成功率低。需要基因分型作为主要筛查的比率9，10，14，21。这表明需要高效的斑马鱼KI CRISPR系统，以及用于检测精确编辑的可靠高通量系统。

本研究的目的是描述一个在斑马鱼心脏中产生精确心脏基因KI的平台，通过简单和高通量检测成功的编辑。描述了一种基于CRISPR-Cas9的双sgRNA外显子替代方法，该方法基于TALEN方法8。这种方法涉及使用双 sgRNA 向导切除靶序列，并用包含目标 KI 和遗传编码内含子报告基因的外源模板序列替换（图 1）。在靶基因内含子序列中整合基因编码的荧光报告基因可以有效地检测阳性编辑。然后描述了一个表型平台，用于评估斑马鱼幼虫的心脏电功能，以非侵入性地表征与遗传性LQTS相关的基因变异，遗传性LQTS是一种使个体易发生心脏性猝死的心脏电疾病。

这些方法将加强斑马鱼KI基因编辑的获取和使用，以模拟遗传疾病并解决生物学和生理学问题，例如绘制基因表达模式和发育调节。由于斑马鱼的心脏比小鼠模型更相似于人类心脏电生理特征，因此它们作为心脏病建模的遗传可处理系统可能特别有吸引力7，22，23。

研究方案

使用斑马鱼的研究是根据西蒙弗雷泽大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会的政策和程序进行的，并根据协议#1264K-18完成。

1. 用于精确编辑的CRISPR组件设计

  1. 为了设计将用于切除含有KI靶位点的序列的双sgRNA向导，首先鉴定目的基因的斑马鱼直系同源物。
    注意: 图2 概述了使用双sgRNA CRISPR-Cas9方法进行精确编辑的步骤。
  2. 接下来，使用设计软件工具，例如CRISPOR24，其中包括选择 Danio rerio 作为一个物种和要使用的Cas酶。
    注意:本研究感兴趣的基因是 zkcnh6a （集合转录本ID:ENSDART00000090809.6;UniProt蛋白ID:B3DJX4），目标突变为氨基酸R56Q。
    1. 对于双 sgRNA 方法，选择一个位于目标外显子之前的 sgRNA 位置和位于紧邻下游内含子内的第二个 sgRNA 位置。
    2. 确保所选的sgRNA具有高特异性和低预测脱靶结合。使用CRISPOR排名来识别具有最小脱靶结合的指南。不要考虑潜在脱靶种子序列中没有不匹配的指南。
    3. 在步骤6.1.3中，确定最可能的潜在脱靶位点（基于CRISPOR评分，选择前三个外显子潜在脱靶位点）以进行基于PCR的Sanger测序基因分型。
    4. 一旦选择了两个sgRNA，就为每个sgRNA获得反向补体，这样就有四个寡核苷酸可以使用:两个在突变之前和两个下游的互补寡核苷酸。
    5. 在四个寡核苷酸中的每一个上，添加相容的限制性位点以掺入所选的引导质粒中;为了整合到DR274质粒中，使用5' BsaI限制性位点创建突出部分。确保Bsa1识别位点在从CRISPOR中选择的指南的5'端设计，Bsa1识别位点在互补链的5'端设计，以确保DR274质粒中向导的正确方向（见 图3）。
  3. 为了设计用于斑马鱼HDR的外源模板（图1），请选择两个序列片段，它们将位于pKHR5质粒中的mVenus YFP报告基因的两侧。
    注意:预期的修改/编辑可以包含在上游或下游片段中。
    1. 使用 Ensembl 在感兴趣的基因序列中定位目标位点，包括大约 2 kb 的侧翼序列（同源臂），该序列将用于制作模板。
      注意:同源臂可以是对称的或不对称的25，26，每个大约 1 kb，位于目标位点的上游和下游。
    2. 将模板分成两个片段，插入mVenus YFP报告基因的两侧（见 图4）。确保分裂位点处于内含子中，以便编码序列不会中断。
      注意:如果基因表征良好，请检查内含子中的功能作用，例如剪接位点或调节区域。靠近5'或3'末端的区域更常参与mRNA剪接。
    3. 将修饰纳入模板序列，包括 i） 引导原间隔相邻基序 （PAM） 或种子序列中的沉默突变（注意 CAS 酶可能靶向的替代 PAM 位点），以防止 CAS 酶重新切割;ii） 权益的变更;iii）创建限制性核酸内切酶位点以促进克隆到含有mVenus YFP报告基因的pKHR5质粒中（见 图3）。
      注意:在本研究中，第一个模板片段包含R56Q突变位点上游的XhoI和下游的SalI，而第二个模板片段在引导靶序列上游具有EcoRI和下游的BamHI。如果模板序列中存在任何选定的限制性位点，则需要突变来沉默这些位点，或者可以使用替代方法，例如Gibson组装。

2. 胚胎显微注射用CRISPR组分的制备

  1. 在显微注射前 1 周准备用于显微注射的 Cas9。使用Cas9蛋白或通过体外转录制备Cas9 mRNA。
    注意:在这项研究中，使用了Cas9 mRNA，因为效率往往更高。
    1. 使用适当的抗生素（如氨苄西林）扩增市售 XL1 蓝色细菌琼脂刺（含 Cas9 质粒）的细菌培养物。使用 675 μL 液体培养物（含 325 μL 甘油）创建备用甘油原液，可在 −80 °C 下长期储存。
    2. 根据小型制备试剂盒随附的方案，使用剩余的液体培养物进行小型制备纯化。将最终纯化的DNA重悬于提供的50 μL洗脱缓冲液中。通过分光光度计 定量 产品以检查产量和纯度。
    3. 使用适当的限制性内切酶，并使用为目标酶列出的适当缓冲液和孵育时间，通过限制性酶 解液线性 化 2 μg 纯化的 DNA。
    4. 使用 PCR 纯化试剂盒纯化线性化质粒，将其重悬于 30 μL 提供的洗脱缓冲液中。
    5. 量化产物后，将其用作体外转录的模板，使用感兴趣的启动子的适当转录试剂盒。遵循提供的方案并通过氯化锂沉淀27纯化。将纯化的RNA重悬于10μL无核酸酶H2O中，并在储存在-20°C以用于显微注射混合物之前对其进行定量。
  2. 准备两个sgRNA指南。
    1. 通过扩增市售XL1蓝色细菌琼脂刺的细菌培养物（详见 材料表 ），以与上述MLM3613相同的方式（步骤2.1.1）制备sgRNA质粒，只是使用卡那霉素代替氨苄西林。
    2. 首先将 ssODN 重悬于 1x 退火缓冲液中，将 ssODN 重悬至 100 μM 浓度，从而对上述 sgRNA 指南的两对互补单链寡核苷酸 （ssODN） 进行退火。
    3. 在两个sgRNA中的每一个的单独反应中，使用热循环仪退火对互补的ssODN。将 2 μg 每个互补的 ssODN 对与 50 μL 退火缓冲液混合，并在 95 °C 下孵育 2 分钟，然后在 45 分钟内冷却至 25 °C。
    4. 消化含有gRNA支架的市售质粒。使用 1 μL BsaI、2 μL 适当缓冲液和 ddH 2O 至20 μL 在 37 °C 下消化 2 μg DR274 质粒 1 小时。使用凝胶电泳28确认线性化（可选:使用PCR纯化试剂盒纯化）。
    5. 在两个单独的连接反应（每个sgRNA一个）中，将退火的ssODN与线性化的DR274质粒连接。使用3:1的摩尔插入:载体比，通过在线连接计算器计算适当的质量。将所需质量的插入片段和载体与 1 μL T4 DNA 连接酶、2 μL 连接缓冲液和 ddH2O 至 12 μL 混合，并在室温下孵育 12 小时。
    6. 使用标准方法将 2 μL 连接产物转化为适当的感受态细胞（例如 10β 细胞），然后使用市售的 Miniprep 试剂盒扩增和纯化产品。可选:创建该产品的甘油原液。
    7. 通过使用尽可能接近空间序列末端的 3' 下游限制性位点线性化每个指南的 2 μg 来转录两个 sgRNA。对于DR274质粒，用HindIII线性化，然后使用PCR纯化试剂盒纯化RNA模板，重悬于30 μL洗脱缓冲液中。
    8. 使用 RNA 转录试剂盒转录两个指南。遵循制造商的方案并通过氯化锂沉淀27进行纯化。将两个纯化的sgRNA指南重悬于10μL无核酸酶H2O中，定量并储存在-20°C以用于显微注射混合物。
      注意:RNA转录试剂盒不能包含5'帽或poly-A尾巴。
  3. 准备双链外源 HDR 报告模板。
    注意:该模板由两部分合成，一部分是mVenus YFP报告基因的上游，另一部分是下游。这两个片段是通过商业供应商订购的合成构建体，然后依次连接到pKHR5（含有mVenus YFP）质粒中。
    1. 通过扩增市售DH5α细菌菌株中的细菌培养物来制备pKHR5质粒（详见 材料表 ），方法与上述MLM3613（步骤2.1.1）相同。
      注意:pKHR5质粒包含mVenus YFP报告基因序列。
    2. 将上述设计的两个模板片段重悬于TE缓冲液中至100μM，然后转化为10β细胞。
    3. 使用步骤1.3.3中选择的限制性内切酶消化第一个模板片段（mVenus YFP报告基因上游的模板片段）和pKHR5质粒。
      注意:pKHR5的顺序摘要是必要的，因为MCS中选定的限制性位点非常接近。
    4. 为了制备用于上游模板段的pKHR5质粒，用SalI消化4μgpKHR5（按照步骤2.2.4），然后使用PCR纯化试剂盒纯化。重悬于30 μL ddH2O中，并将其用作与XhoI进行第二次消化反应的模板。使用PCR纯化试剂盒纯化产品。
    5. 通过在37°C下消化2μg模板段（步骤2.3.2），1μLXhoI，1μLSalI，2μL适当缓冲液和ddH2O至20μL1小时来制备第一个模板片段，并对产物进行凝胶纯化。
    6. 使用步骤2.2.5中描述的反应条件将步骤2.3.5中的上游模板段连接到制备的pKHR5中。将连接产物转化为感受态 10β 细胞，扩增并使用小型制备纯化（可选:创建该产品的甘油原液）。
    7. 使用步骤2.3.6中的连接产物（其中包含连接到mVenus YFP报告基因上游pKHR5质粒的第一个模板片段）并酶解以准备第二个（mVenus报告基因的下游）模板片段。用BamHI消化4μg连接产物（来自步骤2.3.6，如步骤2.2.4），然后使用PCR纯化试剂盒纯化。重悬于 30 μL ddH2O 中，并将其用作与 EcoRI 进行第二次消化反应的模板。使用PCR纯化试剂盒纯化产品。
    8. 通过消化 2 μg 模板段（步骤 2.3.2）、1 μL BamHI、1 μL EcoRI、2 μL 适当缓冲液和ddH 2O 至 20 μL 在 37 °C 下 1 小时制备第二个模板段，并对产物进行凝胶纯化。
    9. 使用步骤2.2.5中描述的反应条件将下游模板段连接到制备的pKHR5（来自步骤2.3.7）中。将连接产物转化为感受态细胞，扩增并使用小型制备试剂盒纯化。创建该最终产品的甘油储备液，其中包含连接pKHR5内mVenus YFP报告基因两侧的两个模板片段。
  4. 使用 Cas9 mRNA、两个 sgRNA 和外源性 HDR 报告模板制备显微注射混合物。
    1. 在 1x 进样缓冲液中混合 200 ng/μL Cas9 mRNA、100 ng/μL 每种 sgRNA 和 200 ng/μL 外源性 HDR 报告模板，最终体积为 20 μL。
    2. 将显微注射混合物储存在-20°C，并在三个冻融循环后丢弃未使用的混合物。
      注意:使用4nL的这种显微注射混合物显微注射到每个胚胎的卵黄囊中。

3.斑马鱼的繁殖和胚胎显微注射

注意:斑马鱼繁殖和单细胞胚胎显微注射的方案已在前面描述过29，30，31。

  1. 对于繁殖，请使用 AB 品系的斑马鱼，年龄为 6-12 个月。在受精后约40分钟将胚胎注射到单细胞阶段（见 图5）。
    注意:注射胚胎的生物学性别未知;性二态性直到32 岁左右才明显。

4. CRISPR-Cas9编辑斑马鱼幼虫的报告基因筛选

  1. 在显微注射 CRISPR-Cas9 成分以筛选成功的 HDR 编辑后，可视化斑马鱼幼虫中的 YFP 整合。
    1. 在 25 毫米培养皿中，在受精后 3 天 （dpf） 在 0.3% 三卡因甲烷磺酸盐（MS-222，用 HEPES 和氢氧化钠缓冲至 pH 7.0-7.4）中麻醉 24 斑马鱼幼虫，直到它们失去自扶正反射（通常为 1-2 分钟）。麻醉后，将每个幼虫转移到24孔板的单个孔中。
    2. 使用能够检测GFP / YFP的显微镜，筛选每个幼虫眼睛中的报告基因荧光。
    3. 捕获每个幼虫的图像并记录报告基因表达的存在与否。

5. CRISPR-Cas9编辑的斑马鱼幼虫的表型分析

  1. 报告基因筛查后，对每个幼虫进行心脏表型（心率、心包尺寸、心电图）。表型报告基因阳性和阴性幼虫数量相等。
    1. 使用CCD相机（例如，blackfly USB3）以及视频和图像记录软件（例如，用于ImageJ的Micromanager）在幼虫麻醉时测量心率和心包尺寸。
    2. 要测量心率，请使用MicroManager创建一个感兴趣区域（ROI），以便捕获心脏并排除其他结构。
      1. 将视频作为图像序列导入 ImageJ，并确保在图像数下输入正确的帧数。
      2. 打开文件后，使用矩形选择工具在心形内绘制 ROI，但不包括其他移动元素，并将 ROI 保存在 ROI 管理器中（分析|工具|投资回报率经理）。
      3. 单击|安装的插件，选择心率算法以在默认文件夹中安装代码，然后在插件选项卡底部选择插件。从弹出窗口记录每分钟节拍 （bpm）。
        注意:图像检测算法是定制编写的，通过测量与心室收缩相关的单个像素密度变化来检测心率。代码可以在 https://github.com/dpoburko/zFish_HR 找到。
    3. 使用 ImageJ 等免费工具测量心包尺寸，以自由绘制心包囊和其中一只眼睛周围的 ROI。在 ImageJ 中打开图像并使用 多边形选择 工具首先在心包囊周围绘制 ROI，将其保存在 ROI 管理器 中，如步骤 5.1.2 所示，然后对眼睛重复此操作。在 投资回报率管理r 中选择这两个投资回报率，然后点击 衡量。记录每个幼虫的面积，以稍后计算归一化为每个幼虫眼部区域的心包囊面积。
    4. 在心率和心包测量后，记录单个幼虫的心电图。
      注意:记录斑马鱼心电图的协议已在前面描述过33，34，35，36。

6. CRISPR-Cas9编辑斑马鱼幼虫的基因分型

  1. 在表型分析之后，进行脱靶和潜在的脱靶基因分型，以确认准确和精确的HDR基因编辑。
    1. 使用 HOTShot 方法37 在 0.3% MS-222 和尾夹中麻醉每个 3 dpf 幼虫以分离 gDNA。将每个切除的尾夹在 15 μL 25 mM NaOH 中在 95 °C 中孵育 20 分钟。然后，用 1.5 μL Tris-HCl 中和并以 13，800 x g 离心 30 秒。保留含有提取的gDNA的上清液。
    2. 回收E3培养基中的幼虫，如果打算进一步发育或研究，则将其送回住房系统。
    3. 使用提取的gDNA作为模板，对靶向和潜在的脱靶位点进行基于PCR的Sanger测序。
      注意:可选:巢式PCR方法可能对某些基因区域有益。
    4. 确保靶向引物设计捕获突变位点和最近的sgRNA结合位点。设计单独的测序引物来检测插入的同源臂和靶基因的过渡，以确认整合到目的基因中。设计引物以对步骤1.2.3中确定的前三个潜在脱靶位点进行测序。
      注意:指南设计软件程序通常会建议使用引物，但可能需要定制才能获得最佳结果。
    5. 编译每条斑马鱼的靶上和脱靶基因分型、心率、心包尺寸、心电图表型和报告基因数据。

结果

这种双sgRNA外显子替代CRISPR方法的成功使用突出了对斑马鱼 zkcnh6a 基因中LQTS相关变体R56Q的精确编辑的引入和简单检测。 图6 显示了在单细胞胚胎阶段注射的具有代表性的3 dpf幼虫，如上所述的CRISPR组分。 图6A 显示了YFP mVenus报告基因在眼晶状体中的表达作为成功模板整合的阳性报告基因。图 6B，C 显示了分别从?...

讨论

使用CRISPR-Cas9进行精确基因编辑的工程受到HDR机制及其高效检测效率低的挑战。本文描述了一种基于CRISPR-Cas9的双sgRNA外显子替换方法，该方法在斑马鱼中产生精确的编辑，并直接目视检测阳性编辑。这种方法的有效性通过在 zkcnh6a 基因中产生精确的编辑来证明。本文展示了如何使用心率、心包尺寸和心电图形态的非侵入性表型测量来评估基因编辑斑马鱼幼虫的心脏功能。这种方法，从引入?...

披露声明

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

这项研究得到了加拿大卫生研究院研究项目拨款（T.W.C.）和加拿大自然科学与工程研究理事会发现补助金（T.W.C.）的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Program
CRISPORTEFOR Infrastructure
ENSEMBLEuropean Bioinformatics Institute
ImageJNational Institutes of Health (NIH)
Micro-ManagerOpen Source (Github)
NEBiocalculatorNew England Biolabs (NEB)
EQUIPMENT
24-well PlateVWR
25 mm Petri DishVWR
Blackfly USB3 CameraTeledyne FLIR
C1000 Thermal CyclerBio-Rad
Centrifuge 5415CEppendorf
EZNA Gel Extraction KitOmega Biotek
MAXIscript T7 Transcription KitInvitrogen
MaxQ 5000 IncubatorBarnstead Lab Line
Miniprep KitQiagen
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription KitInvitrogen
ND1000 SpectrophotometerNanodrop
PCR Purification KitQiagen
PLI 100A PicoinjectorHarvard Apparatus
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad
Stemi 305 SteroscopeZeiss
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis SystemBio-Rad
ZebTec Zebrafish Housing SystemTecniplast
SERVICES
Gene SynthesisGenewiz
Sanger SequencingGenewiz
REAGENTS
10β Competent CellsNEB
10X PCR BufferQiagen
100 mM Nucleotide MixtureABM
AmpicillinSigma
BamHI Endonuclease w/ bufferNEB
BsaI Endonuclease w/ bufferNEB
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)Addgene
EcoRI Endonuclease w/ bufferNEB
Glycerol
HEPESSigma
HindIII Endonuclease w/ bufferNEB
KanamycinSigma
Methylene BlueSigma
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)Addgene
MS-222 (Tricaine)Sigma
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab)Addgene
PmeI Endonuclease w/ bufferNEB
SalI Endonuclease w/ bufferNEB
Sodium HydroxideSigma
T4 Ligase w/ bufferSigma
Taq PolymeraseQiagen
TE BufferSigma
Tris HydrochlorideSigma
XhoI Endonuclease w/ bufferNEB
RECIPES
SolutionComponentSupplier
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0)10 mM TrisSigma
50 mM NaClSigma
1 mM EDTASigma
E3 Media (pH 7.2)5 mM NaClSigma
0.17 mM KClSigma
0.33 mM CaCl2Sigma
0.33 mM MgSO4Sigma
Injection Buffer (pH 7.5)20 mM HEPESSigma
150 mM KClSigma

参考文献

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