CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

요약

이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 제브라피쉬 배아에서 정밀한 녹인 편집을 용이하게 하는 접근 방식을 설명합니다. 표현형 파이프라인은 Long QT 증후군 관련 유전자 변이체를 모델링하기 위한 이러한 기술의 적용 가능성을 입증하기 위해 제시됩니다.

초록

동물 모델에서 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)이 클러스터링되어 생리적 현상 연구를 위한 정확한 유전자 조작이 가능합니다. Zebrafish는 전체 장기 및 유기체 수준에서 유전성 질병, 발달 및 독성학과 관련된 수많은 질문을 연구하는 효과적인 유전 모델로 사용되었습니다. 주석이 잘 달리고 매핑된 제브라피쉬 게놈으로 인해 유전자 편집을 위한 수많은 도구가 개발되었습니다. 그러나 CRISPR을 사용하여 정확한 녹인 편집을 생성하는 효율성과 용이함은 제한 요소입니다. 여기에 설명된 것은 심장 재분극을 담당하고 전기 장애인 LQTS(Long QT 증후군)와 관련된 유전자에서 정밀한 편집을 간단하게 감지하는 CRISPR-Cas9 기반 녹인 접근 방식입니다. 이 2-단일 가이드 RNA(sgRNA) 접근법은 표적 서열을 절제 및 대체하고 유전적으로 암호화된 리포터 유전자를 연결합니다. 이 접근법의 유용성은 야생형 및 유전자 편집 제브라 피쉬 유충에서 심장 전기 기능의 비 침습적 표현형 측정을 설명함으로써 입증됩니다. 이 접근법은 전체 유기체에서 질병 관련 변이체의 효율적인 연구를 가능하게합니다. 또한, 이 전략은 리포터 유전자, 오르토로그 또는 유전자 편집자와 같은 외인성 선택 서열의 삽입 가능성을 제공합니다.

서문

동물 모델에서 CRISPR 기반 유전자 편집 전략을 사용하면 전체 유기체 수준 ^1,2,3에서 유전적으로 유전되는 질병, 발달 및 독성학을 연구할 수 있습니다. 제브라피쉬는 쥐 또는 인간 유래^{세포 모델보다} 다양한 생리학적 측면에서 인간에게 더 가까운 강력한 모델을 제공합니다4. 광범위한 유전 도구와 전략이 제브라 피쉬에서 전진⁵ 및 역 유전자 스크리닝⁶ 모두에 사용되었습니다. 제브라피쉬의 포괄적인 유전자 매핑 및 주석은 표적 유전자 녹아웃(KO) 및 정밀 녹인(^KI)을 엔지니어링하는 주요 기술로서 유전자 편집 접근 방식을 촉진했습니다7.

그럼에도 불구하고 제브라 피쉬에서 정확한 KI 편집을 생성하는 것은 낮은 효율성과 정확한 탐지의 어려움으로 인해 제한됩니다. 전사 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs)가 KI⁸에 성공적으로 ....

프로토콜

제브라 피쉬를 사용한 연구는 Simon Fraser University 동물 관리위원회와 캐나다 동물 관리위원회의 정책 및 절차에 따라 수행되었으며 프로토콜 # 1264K-18에 따라 완료되었습니다.

1. 정밀한 편집을 위한 CRISPR 부품 설계

1. KI 표적 부위를 포함하는 서열을 절제하는 데 사용될 2-sgRNA 가이드를 설계하려면 먼저 관심 유전자에 대한 제브라피쉬 오르토로그를 식별합니다.
   참고: 그림 2 는 two-sgRNA CRISPR-Cas9 접근법을 사용하여 정밀한 편집을 엔지니어링하는 단계에 대한 요약 개요를 제공합니다.
2. 다음으로, CRISPOR²⁴와 같은 설계 소프트웨어 도구를 사용하는데, 여기에는 사용할 Cas 효소의 종으로서의 Danio rerio 에 대한 선택이 포함됩니다.
   참고: 이 연구의 관심 유전자는 zkcnh6a (Ensembl 전사체 ID: ENSDART00000090809.6; UniProt 단백질 ID: B3DJX4), 표적 돌연변이는 아미노산, R56Q였다.
   1. 2-sgRNA 접근법의 경우 표적 엑....

결과

이 2-sgRNA 엑손 대체 CRISPR 접근법의 성공적인 사용은 제브라피쉬의 zkcnh6a 유전자에서 LQTS 관련 변이체 R56Q를 엔지니어링하기 위한 정밀 편집의 도입 및 간단한 검출로 강조됩니다. 도 6 은 상기와 같이 CRISPR 성분으로 단세포 배아 단계에서 주입된 대표적인 3 dpf 유충을 나타낸다. 도 6A 는 성공적인 주형 통합의 양성 리포터로서 눈 렌즈에서 YFP mVenus.......

토론

CRISPR-Cas9를 사용한 정밀한 유전자 편집 엔지니어링은 HDR 메커니즘의 낮은 효율성과 효율적인 검출로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 양성 편집을 직접 시각적으로 감지하여 제브라피쉬에서 정밀한 편집을 생성하는 CRISPR-Cas9 기반 2-sgRNA 엑손 대체 접근법에 대해 설명합니다. 이 접근법의 효능은 zkcnh6a 유전자에서 정확한 편집을 생성함으로써 입증됩니다. 이 논문은 유전자 편집 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Program
CRISPOR	TEFOR Infrastructure
ENSEMBL	European Bioinformatics Institute
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)
Micro-Manager	Open Source (Github)
NEBiocalculator	New England Biolabs (NEB)
EQUIPMENT
24-well Plate	VWR
25 mm Petri Dish	VWR
Blackfly USB3 Camera	Teledyne FLIR
C1000 Thermal Cycler	Bio-Rad
Centrifuge 5415C	Eppendorf
EZNA Gel Extraction Kit	Omega Biotek
MAXIscript T7 Transcription Kit	Invitrogen
MaxQ 5000 Incubator	Barnstead Lab Line
Miniprep Kit	Qiagen
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit	Invitrogen
ND1000 Spectrophotometer	Nanodrop
PCR Purification Kit	Qiagen
PLI 100A Picoinjector	Harvard Apparatus
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad
Stemi 305 Steroscope	Zeiss
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System	Bio-Rad
ZebTec Zebrafish Housing System	Tecniplast
SERVICES
Gene Synthesis	Genewiz
Sanger Sequencing	Genewiz
REAGENTS
10β Competent Cells	NEB
10X PCR Buffer	Qiagen
100 mM Nucleotide Mixture	ABM
Ampicillin	Sigma
BamHI Endonuclease w/ buffer	NEB
BsaI Endonuclease w/ buffer	NEB
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)	Addgene
EcoRI Endonuclease w/ buffer	NEB
Glycerol
HEPES	Sigma
HindIII Endonuclease w/ buffer	NEB
Kanamycin	Sigma
Methylene Blue	Sigma
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)	Addgene
MS-222 (Tricaine)	Sigma
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab)	Addgene
PmeI Endonuclease w/ buffer	NEB
SalI Endonuclease w/ buffer	NEB
Sodium Hydroxide	Sigma
T4 Ligase w/ buffer	Sigma
Taq Polymerase	Qiagen
TE Buffer	Sigma
Tris Hydrochloride	Sigma
XhoI Endonuclease w/ buffer	NEB
RECIPES
Solution	Component	Supplier
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0)	10 mM Tris	Sigma
	50 mM NaCl	Sigma
	1 mM EDTA	Sigma
E3 Media (pH 7.2)	5 mM NaCl	Sigma
	0.17 mM KCl	Sigma
	0.33 mM CaCl2	Sigma
	0.33 mM MgSO4	Sigma
Injection Buffer (pH 7.5)	20 mM HEPES	Sigma
	150 mM KCl	Sigma