Modifiche precise mediate da CRISPR-Cas9 nei cuori di zebrafish

Riepilogo

Questo protocollo descrive un approccio per facilitare modifiche precise knock-in negli embrioni di zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Viene presentata una pipeline di fenotipizzazione per dimostrare l'applicabilità di queste tecniche per modellare una variante genetica associata alla sindrome del QT lungo.

Abstract

Le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) in modelli animali consentono una precisa manipolazione genetica per lo studio dei fenomeni fisiologici. I pesci zebra sono stati utilizzati come modello genetico efficace per studiare numerose domande relative alla malattia ereditaria, allo sviluppo e alla tossicologia a livello di intero organo e organismo. Grazie al genoma del pesce zebra ben annotato e mappato, sono stati sviluppati numerosi strumenti per l'editing genetico. Tuttavia, l'efficacia della generazione e la facilità di rilevare modifiche precise utilizzando CRISPR è un fattore limitante. Qui è descritto un approccio knock-in basato su CRISPR-Cas9 con la semplice rilevazione di modifiche precise in un gene responsabile della ripolarizzazione cardiaca e associato al disturbo elettrico, la sindrome del QT lungo (LQTS). Questo approccio a due RNA a guida singola (sgRNA) asporta e sostituisce la sequenza bersaglio e collega un gene reporter geneticamente codificato. L'utilità di questo approccio è dimostrata descrivendo misure fenotipiche non invasive della funzione elettrica cardiaca in larve di zebrafish wild-type e geneticamente modificate. Questo approccio consente lo studio efficiente delle varianti associate alla malattia in un intero organismo. Inoltre, questa strategia offre possibilità per l'inserimento di sequenze esogene di scelta, come geni reporter, ortologhi o editor di geni.

Introduzione

Le strategie di editing genetico basate su CRISPR in modelli animali consentono lo studio di malattie, sviluppo e tossicologia geneticamente ereditabili a livello dell'intero organismo ^1,2,3. I pesci zebra forniscono un modello potente che è più vicino in numerosi aspetti fisiologici agli esseri umani rispetto ai modelli cellulari murini o derivati dall'uomo⁴. Una vasta gamma di strumenti e strategie genetiche sono stati utilizzati nel pesce zebra sia per lo screening genetico in avanti⁵ che per lo screenin....

Protocollo

Gli studi che utilizzano il pesce zebra sono stati condotti in accordo con le politiche e le procedure del Simon Fraser University Animal Care Committee e del Canadian Council of Animal Care e sono stati completati secondo il protocollo # 1264K-18.

1. Progettazione di componenti CRISPR per modifiche precise

1. Per progettare le guide a due sgRNA che verranno utilizzate per asportare la sequenza contenente il sito bersaglio KI, identificare prima l'ortologo del pesce zebra per il gene di interesse.
   NOTA: la Figura 2 fornisce una panoramica riepilogativa dei passaggi per progettare modi....

Risultati

L'uso di successo di questo approccio CRISPR di sostituzione dell'esone a due sgRNA è evidenziato dall'introduzione e dalla semplice rilevazione di una modifica precisa per ingegnerizzare la variante associata a LQTS, R56Q, nel gene zkcnh6a nel pesce zebra. La Figura 6 mostra una larva rappresentativa di 3 dpf iniettate allo stadio embrionale unicellulare con componenti CRISPR come descritto sopra. La Figura 6A mostra la presenza dell'espressione genic.......

Discussione

L'ingegneria di precisi edit genetici utilizzando CRISPR-Cas9 è messa in discussione dalle basse efficienze dei meccanismi HDR e dal loro rilevamento efficiente. Qui, viene descritto un approccio di sostituzione dell'esone a due sgRNA basato su CRISPR-Cas9 che produce modifiche precise nel pesce zebra con rilevamento visivo diretto di modifiche positive. L'efficacia di questo approccio è dimostrata generando modifiche precise nel gene zkcnh6a . Questo articolo mostra come la funzione cardiaca nelle larve di ze.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Program
CRISPOR	TEFOR Infrastructure
ENSEMBL	European Bioinformatics Institute
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)
Micro-Manager	Open Source (Github)
NEBiocalculator	New England Biolabs (NEB)
EQUIPMENT
24-well Plate	VWR
25 mm Petri Dish	VWR
Blackfly USB3 Camera	Teledyne FLIR
C1000 Thermal Cycler	Bio-Rad
Centrifuge 5415C	Eppendorf
EZNA Gel Extraction Kit	Omega Biotek
MAXIscript T7 Transcription Kit	Invitrogen
MaxQ 5000 Incubator	Barnstead Lab Line
Miniprep Kit	Qiagen
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit	Invitrogen
ND1000 Spectrophotometer	Nanodrop
PCR Purification Kit	Qiagen
PLI 100A Picoinjector	Harvard Apparatus
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad
Stemi 305 Steroscope	Zeiss
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System	Bio-Rad
ZebTec Zebrafish Housing System	Tecniplast
SERVICES
Gene Synthesis	Genewiz
Sanger Sequencing	Genewiz
REAGENTS
10β Competent Cells	NEB
10X PCR Buffer	Qiagen
100 mM Nucleotide Mixture	ABM
Ampicillin	Sigma
BamHI Endonuclease w/ buffer	NEB
BsaI Endonuclease w/ buffer	NEB
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)	Addgene
EcoRI Endonuclease w/ buffer	NEB
Glycerol
HEPES	Sigma
HindIII Endonuclease w/ buffer	NEB
Kanamycin	Sigma
Methylene Blue	Sigma
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)	Addgene
MS-222 (Tricaine)	Sigma
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab)	Addgene
PmeI Endonuclease w/ buffer	NEB
SalI Endonuclease w/ buffer	NEB
Sodium Hydroxide	Sigma
T4 Ligase w/ buffer	Sigma
Taq Polymerase	Qiagen
TE Buffer	Sigma
Tris Hydrochloride	Sigma
XhoI Endonuclease w/ buffer	NEB
RECIPES
Solution	Component	Supplier
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0)	10 mM Tris	Sigma
	50 mM NaCl	Sigma
	1 mM EDTA	Sigma
E3 Media (pH 7.2)	5 mM NaCl	Sigma
	0.17 mM KCl	Sigma
	0.33 mM CaCl2	Sigma
	0.33 mM MgSO4	Sigma
Injection Buffer (pH 7.5)	20 mM HEPES	Sigma
	150 mM KCl	Sigma