斑马鱼幼虫作为评估潜在放射增敏剂或保护剂的模型

摘要

斑马鱼最近被用作验证潜在辐射改性剂的模型。本方案描述了使用斑马鱼胚胎进行基于辐射的筛选实验的详细步骤以及一些观察方法来评估不同治疗和辐射的效果。

摘要

斑马鱼被广泛用于多种研究，因为它们是易于维护的脊椎动物模型之一，并表现出独特而方便的模型系统的几个特征。由于高度增殖的细胞更容易受到辐射诱导的DNA损伤，斑马鱼胚胎是辐射研究的一线 体内 模型。此外，该模型在短时间内预测了辐射和不同药物的影响，以及主要的生物学事件和相关反应。一些癌症研究使用了斑马鱼，该协议基于在放疗和癌症背景下使用辐射调节剂。该方法可以很容易地用于验证不同药物对辐照和对照（非辐照）胚胎的影响，从而将药物识别为放射增敏或保护性药物。尽管这种方法用于大多数药物筛选实验，但实验的细节和X射线辐射暴露背景的毒性评估是有限的或仅简要解决，因此难以执行。该协议解决了这个问题，并通过详细说明讨论了程序和毒性评估。该程序描述了一种使用斑马鱼胚胎进行辐射研究和基于辐射的药物筛选的简单方法，具有很高的可靠性和可重复性。

引言

斑马鱼（Danio rerio）是一种著名的动物模型，在过去30年中被广泛用于研究。它是一种小型淡水鱼，易于在实验室条件下饲养和繁殖。斑马鱼已被广泛用于各种发育和毒理学研究1,2,3,4,5,6,7,8。斑马鱼繁殖力高，胚胎世代短;这些胚胎适合跟踪不同的发育阶段，在视觉上是透明的，并且适用于各种遗传操作和高通量筛选平台9,10,11,12,13,14。此外，斑马鱼提供实时成像，其发育过程和存在各种有毒物质或因素的不同畸形可以很容易地使用立体或荧光显微镜进行研究7,15,16。

放射治疗是用于治疗癌症的主要治疗方式之一 17,18,19,20,21,22,23,24。然而，癌症放射治疗需要潜在的放射保护剂来保护正常健康细胞免于死亡，同时杀死恶性细胞或在涉及高能辐射的治疗期间保护人类健康 25,26,27,28,29。相反，有效的放射增敏剂也正在研究中，以提高辐射杀死恶性细胞的效率，特别是在靶向和精准治疗中30,31,32,33。因此，为了验证有效的放射防护剂和增敏剂，高度征求了一种适用于半高通量药物筛选并可测量地表现出辐射效应的模型。几种可用的模型用于辐射研究并参与药物筛选实验。然而，高等脊椎动物，甚至是最常用的体内模型小鼠，都不适合大规模的药物筛选，因为用这些模型设计这种筛选实验既费时又费钱，而且具有挑战性。同样，细胞培养模型是各种高通量药物筛选实验的理想选择^34,35。然而，涉及细胞培养的实验并不总是实用的、高度可重复的或可靠的，因为培养中的细胞可能会根据生长条件和动力学显着改变其行为。此外，各种细胞类型显示出不同的辐射敏化。值得注意的是，2D 和 3D 细胞培养系统并不代表整个生物体的情况，因此，获得的结果可能无法概括实际的放射毒性水平^36,37。在这方面，斑马鱼在筛选新型放射增敏剂和放射防护剂方面具有多种优势。斑马鱼易于操作、离合器尺寸大、寿命短、胚胎发育快、胚胎透明、体型小等特点，是大规模药物筛选的合适模型。由于上述优点，可以在短时间内轻松重复实验，并且可以在多孔板的解剖显微镜下轻松观察效果。因此，斑马鱼在涉及辐射研究的药物筛选研究中越来越受欢迎^38,39。

斑马鱼作为筛选辐射调节剂的真正模型的潜力已在各种研究中得到证明 40,41,42,43,44,45。潜在的放射性修饰剂，如纳米颗粒DF1、氨磷汀（WR-2721）、DNA修复蛋白KU80和ATM，以及移植的造血干细胞，以及放射增敏剂，如黄酮吡醇和AG1478，在斑马鱼模型中的作用已被报道19,41,42,43,44,45,46.使用相同的系统，在全身和器官特异性水平上评估了DF-1（富勒烯纳米颗粒）的辐射防护作用，并进一步探索了使用斑马鱼胚胎进行放射防护剂筛选⁴⁷。最近，据报道，Kelulut蜂蜜是斑马鱼胚胎中的放射保护剂，并被发现可以提高胚胎存活率并防止器官特异性损伤、细胞DNA损伤和细胞凋亡⁴⁸。

同样，在高通量筛选中检查了通过Hantzsch反应产生的聚合物对斑马鱼胚胎的辐射防护作用，并且主要通过保护细胞免受DNA损伤来提供保护⁴⁹。在之前的一项研究中，使用这种方法的斑马鱼模型发现亲脂性他汀类药物氟伐他汀是一种潜在的放射增敏剂⁵⁰。同样，金纳米颗粒被认为是一种理想的放射增敏剂，并已用于许多研究^51,52。

斑马鱼的胚胎发育涉及最初 3 小时内的卵裂，其中单细胞受精卵分裂形成 2 个细胞、4 个细胞、8 个细胞、16 个细胞、32 个细胞和 64 个细胞，这些细胞很容易用立体显微镜识别。然后，它达到具有 128 个细胞（受精后 2.25 小时，hpf）的胚泡阶段，其中细胞每 15 分钟翻一番，并经历以下阶段:256 个细胞 （2.5 hpf）、512 个细胞 （2.75 hpf），并在短短 3 小时内达到 1,000+ 个细胞（图 1）。在4小时时，卵达到球形阶段，随后在胚胎质量7,53,54中形成圆顶形。斑马鱼的原肠形成从 5.25 hpf⁵⁴ 开始，在那里它达到盾牌阶段。盾牌清楚地表明细胞向胚环一侧的快速收敛运动（图1），并且是胃胚的一个突出而独特的阶段，可以很容易地识别^53,54。尽管胚胎的辐射暴露可以在其发育的任何阶段进行，但原肠胚形成期间的辐射暴露可能具有更明显的形态变化，有助于更好地读出辐射诱导的毒性⁵⁵;同样，最早可以在2 HPF⁵⁴开始对胚胎施用药物。

研究方案

本研究是在布巴内斯瓦尔生命科学研究所机构动物伦理委员会事先批准并遵循其指导方针的情况下进行的。所有斑马鱼的维护和繁殖均在28.5°C的常温养鱼设施中进行，胚胎在28.5°C的生物需氧量（BOD）培养箱中维持。 在这里，使用斑马鱼AB品系，并根据Kimmel等人⁵⁴进行分期。在 6 hpf（屏蔽阶段）给予 X 射线辐射，并在 120 hpf 之前观察到不同的表型。

1. 育种设置和胚胎采集

1. 设置养殖罐（由聚碳酸酯制成，容量为 1 L，参见 材料表）。将系统水（pH值，6.8-7.5;电导率，500μS;温度，28.5°C）倒入养殖池中，覆盖其体积的近40%。将分隔器放入水箱中以创建两个腔室，一个用于雌性，另一个用于雄性。
2. 从亲本罐中，在网的帮助下小心地收集两只健康的雌性和一只健康的雄性，将它们放在各自的两半，并将它们在28.5°C的黑暗中过夜（至少10小时）。
3. 第二天早上，取下隔板，让鱼在不打扰繁殖缸的情况下交配。
   注意:雌性将开始产卵，在允许鱼类交配后 10-15 分钟内看到卵躺在水箱底部^56,57,58。
4. 产卵后将鱼放回鱼缸，使用过滤器从繁殖缸中收集胚胎，用系统水正确清洗，并将收集的卵保存在含有E-3培养基的培养皿中（4.94mM NaCl，0.17mM KCl，0.43mM CaCl 2,0.85mM MgCl₂盐，1%w / v亚甲蓝， 见材料表）。
5. 在解剖显微镜下观察卵子，使用巴斯德移液管除去未受精或死亡的胚胎，并将含有受精卵的培养皿保持在28.5°C的E-3培养基中，在培养箱中，以便其正常生长和维持。
   注意:未受精的卵子可以识别为乳白色外观，带有凝固的绒毛膜或绒毛膜内的细胞破裂。与未受精的卵子一起，必须丢弃未进行卵裂的卵子和具有畸形的卵子，例如卵裂过程中的不规则性，例如不对称、囊泡形成或绒毛膜损伤或未积极发育，以保持收集的胚胎健康并保持培养基清洁^7,56。

2. 监测胚胎和选择辐射实验

1. 在解剖显微镜下监测生长中的胚胎，确定适当的阶段^7,54，并去除任何死亡或不健康的胚胎。确保足够的胚胎分期，因为辐射和药物剂量将在特定的原肠胚形成阶段给予。
   注意:每天检查培养皿中培养基的水平和质量。每24小时更换一次培养基，同时去除死胚胎。巴斯德移液器首选用于挑选胚胎或更换培养基。
2. 在开始实验之前，在巴斯德移液管的帮助下小心地将健康胚胎分布在实验板中。对于每个实验组，取15-20个胚胎。
   注意:仅将所需发育阶段的健康胚胎放入实验板中。假设药物治疗必须以6 hpf的胚胎进行，然后至少提前30-60分钟开始将它们接种在实验板中。

3.药物治疗

1. 向斑马鱼胚胎中加入所需浓度的药物。提前准备好含药物的 E-3 培养基。在制备用于治疗斑马鱼胚胎的工作培养基之前，确保药物的储备溶液中没有未溶解的药物。
2. 在将任何药物添加到用于辐射筛选的介质中之前，请检查药物的细胞毒性作用与药物浓度的等级。按照经合组织指南评估被评估药物的LC 50 59,60,61。
   注意: 在照射或观察期间移动盘子和盘子时要小心。在处理过程中，板很有可能受到干扰，导致培养基从孔中泄漏出来，或者胚胎从各自的孔中溢出，从而可能污染附近的孔并破坏实验。

4. X射线照射

1. 在设置辐射实验时，包括对照组/非辐照组和仅辐射组。同样，在进行药物筛选时，包括另一组，其中药物的浓度将与筛选实验中施用的药物相同，并伴有辐射。
   注意: 在孔板或培养皿的盖子和底座上贴上标签，以免盖子放错位置。
2. 如果辐射防护罩可以覆盖并保护额外的孔免受辐射，而其他孔暴露于特定的辐射剂量，则将胚胎分布在孔板中;否则，使用单个板或圆盘在每辐射剂量下播种胚胎。
3. 打开 X 射线辐照机（见 材料表），并启动机器初始化和预热。
   注意: 源到被摄体的距离 （SSD） 值必须为 50 厘米;人们可以再次使用不同的 SSD，这需要标准化。
4. 将实验板放在机器内部的辐照器下方的中心，确保板位于X射线源的正下方，然后设置剂量（例如，5 GY）并开始X射线。
   注意: 用石蜡膜密封板，以避免在将板从培养箱运输到辐照器并返回过程中出现任何不必要的溢出或污染。
5. 照射完成后，取出板，关闭机器程序，关闭机器，放疗后立即在显微镜下检查板。取出死胚胎，将板放回28.5°C的培养箱中。 在解剖显微镜下评估后记录死胚胎的数量。
   注意:用指定的辐射剂量照射不同的胚胎组，在各组之间没有太多延迟，因为辐射的影响可能会受到发育阶段差异的显着影响。
   注意: 操作 X 光机时，请采取适当的保护措施。

5. 数据收集、成像和分析

1. 以预定的时间间隔收集数据，例如给予辐射后每 24 小时收集一次数据。记录所有可能的观察结果，如存活率、孵化效率、发育阶段、心跳计数、身体和尾巴弯曲、心包水肿、卵黄囊的延伸、小头畸形、鱼鳔发育、一般运动或活动等62,63,64。
2. 要捕获图像，请在干净的载玻片上选择具有代表性的胚胎，在显微镜下检查胚胎，将它们定向到特定方向，然后单击 图像。根据组和时间重命名图像文件。
   注意: 以不同的时间间隔拍摄照片时，必须使用相同的放大倍率和照明。

结果

该协议的整体布局如图2所示。通过以下分析评估了辐射的影响和剂量依赖性表征。

X射线诱导毒性的评估
使用体视显微镜，在药物治疗和/或放疗后评估和表征以下异常。根据经合组织指南61，对于鱼类的毒性评估，包括四个主要的顶端终点，包括胚胎凝固、体节形成畸形、尾巴不脱离卵黄囊以及心跳减少或消失，以分析总体?...

讨论

斑马鱼在许多研究中被用作有价值的模型，包括几种类型的癌症研究。该模型为大规模药物筛选提供了有用的平台^67,68。与任何其他毒性评估方法一样，辐射和/或药物治疗后主要生物学变化的定量评估是该协议最关键的部分。在这类研究中，生存率不能是观察毒性的唯一标准;它需要通过适当的评分系统来评估身体或发育缺陷。在这种情况下，在高达72 h...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL