ゼブラフィッシュの幼生を潜在的な放射線増感剤またはプロテクターを評価するためのモデルとして

要約

ゼブラフィッシュは最近、潜在的な放射線修飾因子を検証するためのモデルとして利用されています。本プロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚を放射線ベースのスクリーニング実験に使用する詳細な手順と、さまざまな治療と放射線の効果を評価するためのいくつかの観察アプローチについて説明します。

要約

ゼブラフィッシュは、脊椎動物のモデルとしては維持が容易であり、ユニークで便利なモデルシステムの特徴を示すため、さまざまな研究に広く利用されています。増殖性の高い細胞は放射線によるDNA損傷を受けやすいため、ゼブラフィッシュの胚は放射線研究の最前線の in vivo モデルです。さらに、このモデルは、主要な生物学的事象と関連する応答とともに、放射線とさまざまな薬物の影響を短時間で予測します。いくつかのがん研究でゼブラフィッシュが使用されており、このプロトコルは、放射線療法とがんの文脈での放射線修飾剤の使用に基づいています。この方法は、放射線照射された胚と対照胚(非照射)に対するさまざまな薬物の効果を検証するために容易に使用でき、したがって、薬物を放射線増感薬または保護薬として識別します。この手法は、ほとんどの薬物スクリーニング実験で用いられていますが、実験の詳細やX線被曝を背景とした毒性評価は、限定的であるか、短時間しか取り上げられていないため、実施が困難でした。このプロトコルでは、この問題に対処し、手順と毒性評価について詳細な図で説明します。この手順では、ゼブラフィッシュの胚を放射線研究や放射線ベースの薬物スクリーニングに使用し、高い信頼性と再現性を実現するための簡単なアプローチを説明しています。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、過去30年間にわたって研究で広く使用されてきた有名な動物モデルです。実験室の条件下で飼育や繁殖が簡単な小型の淡水魚です。ゼブラフィッシュは、さまざまな発生および毒物学的研究に広く使用されています1,2,3,4,5,6,7,8。ゼブラフィッシュは繁殖力が高く、胚発生が短いです。胚は、さまざまな発生段階の追跡に適しており、視覚的に透明であり、さまざまな遺伝子操作およびハイスループット^{スクリーニングプラットフォーム}9,10,11,12,13,14に適しています。さらに、ゼブラフィッシュは、その発生過程とさまざまな有毒物質または因子の存在下でのさまざまな奇形を実体顕微鏡または蛍光顕微鏡法を使用して簡単に研究できるトトおよびライブイメージングを提供します7,15,16。

放射線療法は、がんの治療に使用される主要な治療法の1つです¹⁷、^18、19、²⁰、21、²²、^23、24。しかし、がん放射線治療では、悪性細胞を殺しながら正常な健康な細胞を死滅から守ったり、高エネルギー放射線を含む治療中に人間の健康を保護したりするための潜在的な放射線防護剤が必要です25,26,27,28,29。逆に、強力な放射線増感剤は、特に標的療法や精密治療において、悪性細胞を殺すための放射線の効率を高めるために研究されています30,31,32,33。したがって、強力な放射線防護剤と増感剤を検証するために、セミハイスループットの薬物スクリーニングに適しており、放射線効果を測定可能に示すモデルが強く求められています。いくつかの利用可能なモデルは、放射線研究で使用され、薬物スクリーニング実験に関与しています。しかし、高等脊椎動物や、最も一般的に使用されているin vivoモデルであるマウスでさえ、これらのモデルを用いたスクリーニング実験の設計には時間とコストがかかり、困難であるため、大規模な薬物スクリーニングには適していません。同様に、細胞培養モデルは、さまざまなハイスループット薬物スクリーニング実験に理想的です^34,35。しかし、細胞培養を含む実験は、培養中の細胞が増殖条件や動態に応じて挙動を著しく変化させる可能性があるため、必ずしも実用的、再現性が高く、信頼性が高いとは限りません。また、さまざまな種類の細胞が差動放射線感作を示します。特に、2Dおよび3D細胞培養システムは生物全体のシナリオを表していないため、得られた結果は実際の放射毒性のレベルを再現していない可能性があります^36,37。この点で、ゼブラフィッシュは、新規の放射線増感剤および放射線防護剤のスクリーニングにおいていくつかの利点を提供します。取り扱いの容易さ、大きなクラッチサイズ、短い寿命、急速な胚発生、胚の透明性、および小さな体サイズにより、ゼブラフィッシュは大規模な薬物スクリーニングに適したモデルになっています。以上の利点により、実験を短時間で容易に繰り返すことができ、マルチウェルプレートの解剖顕微鏡下で容易に効果を観察することができる。したがって、ゼブラフィッシュは放射線研究を含む薬物スクリーニング研究で人気を集めています^38,39。

放射線修飾剤をスクリーニングするための正真正銘のモデルとしてのゼブラフィッシュの可能性は、さまざまな研究で実証されています^{40,41,42,43,44,45}。ゼブラフィッシュモデルでは、ナノ粒子DF1、アミフォスチン(WR-2721)、DNA修復タンパク質KU80、ATM、移植造血幹細胞などの潜在的な放射線修飾剤の放射線防護効果、およびフラボピリドールやAG1478などの放射線増感剤の効果が報告されています^{19,41,42,43,44,45,46}.同じシステムを用いて、DF-1(フラーレンナノ粒子)の放射線防護効果を全身レベルと臓器特異的レベルの両方で評価し、放射線防護体スクリーニングのためのゼブラフィッシュ胚の使用もさらに調査された⁴⁷。最近、ケルルート蜂蜜はゼブラフィッシュの胚の放射線防護剤として報告され、胚の生存率を高め、臓器特異的な損傷、細胞DNAの損傷、およびアポトーシスを防ぐことがわかった⁴⁸。

同様に、ハンチの反応によって生成されたポリマーの放射線防護効果は、ゼブラフィッシュの胚でハイスループットスクリーニングでチェックされ、その保護は主に細胞をDNA損傷から保護することによって与えられた⁴⁹。以前の研究の1つでは、親油性スタチンフルバスタチンが、このアプローチでゼブラフィッシュモデルを使用して潜在的な放射線増感剤として発見されました⁵⁰。同様に、金ナノ粒子は理想的な放射線増感剤であると考えられており、多くの研究で使用されています^51,52。

ゼブラフィッシュの胚発生は、単細胞の受精卵が分裂して2細胞、4細胞、8細胞、16細胞、32細胞、64細胞を形成する最初の3時間での切断を伴い、実体顕微鏡で容易に識別できます。その後、128個の細胞(受精後2.25時間、hpf)で胞胚期に達し、細胞は15分ごとに倍増し、256細胞(2.5hpf)、512細胞(2.75hpf)、わずか3時間で1,000+細胞に達します(図1)。4時間で、卵は球の段階に達し、続いて胚の塊^7,53,54にドーム形状が形成されます。ゼブラフィッシュの原腸形成は5.25 hpf⁵⁴から始まり、そこでシールド段階に達します。シールドは、生殖輪の片側への細胞の急速な収束移動を明確に示しており(図1)、容易に識別できるガスtrulate胚の顕著で明確な段階です^53,54。胚への放射線被曝は発生のどの段階でも起こりうるが、原腸形成中の放射線被曝は、より明瞭な形態学的変化を有し、放射線誘発毒性のより良い読み出しを容易にする可能性がある⁵⁵。同様に、胚への薬物投与は、早ければ^2HPF54から開始することができる。

プロトコル

本研究は、ブバネシュワールの生命科学研究所の動物倫理委員会のガイドラインに従って事前承認を得て実施されました。ゼブラフィッシュの維持と繁殖はすべて28.5°Cの常温魚養殖施設で行い、胚は28.5°Cの生物学的酸素要求量(BOD)インキュベーターで維持しました。 ここでは、ゼブラフィッシュAB株を用い、病期分類はKimmel et ^al.54に従って行った。X線照射は6 hpf(遮蔽期)で行われ、120 hpfまで異なる表現型が観察された。

1. 繁殖のセットアップと胚の採取

1. 飼育タンク(ポリカーボネート製、容量1L、 材料表参照)をセットします。システム水(pH、6.8-7.5、導電率、500μS、温度、28.5°C)を、その体積の約40%をカバーする飼育タンクに注ぎます。仕切りをタンクに入れて、女性用と男性用の2つのチャンバーを作成します。
2. 親水槽から、網の助けを借りて健康な雌2匹と健康な雄1匹を慎重に集め、それぞれ半分に分け、28.5°Cで一晩(最低10時間)暗所に保管します。
3. 翌朝、仕切りを取り外し、繁殖水槽を乱さずに魚を交配させます。
   注:女性は産卵を開始し、魚が^56,57,58交尾を許可された後、10〜15分以内に卵が水槽の底に横たわっているのが見られます。
4. 産卵後、魚を水槽に戻し、ストレーナーを使用して繁殖水槽から胚を回収し、システム水で適切に洗浄し、収集した卵をE-3培地(4.94 mMのNaCl、0.17 mMのKCl、0.43 mM CaCl 2、0.85 mMのMgCl₂塩、1%w/vのメチレンブルー、 材料表を参照)。
5. 卵子を解剖顕微鏡で観察し、パスツールピペットを使用して未受精胚または死死胚を取り除き、受精卵を含むペトリプレートをE-3培地中の28.5°Cのインキュベーターで適切に増殖および維持するために保管します。
   注:未受精卵は、凝固した絨毛膜または絨毛膜内の破裂した細胞を伴う乳白色の外観で識別できます。未受精卵とともに、卵割を受けていない卵子や、卵割中の不規則性、例えば非対称性、小胞の形成、絨毛膜の損傷などの奇形のある卵子、または活発に発育していない卵は、採取された胚を健康に保ち、培地を清潔に保つために廃棄する必要があります^7,56。

2. 放射線実験のための胚のモニタリングと選抜

1. 解剖顕微鏡で成長する胚を監視し、適切なステージ^7,54を特定し、死んだ胚や不健康な胚を取り除きます。放射線と薬物の投与量は特定の原腸形成段階で投与されるため、適切な胚の病期分類を確保します。
   注:培養皿の培地のレベルと品質を毎日確認してください。死んだ胚を取り除くとともに、24時間ごとに培地を交換します。パスツールピペットは、胚の摘出や培地の交換に好まれます。
2. 実験を開始する前に、パスツールピペットの助けを借りて、実験プレートに健康な胚を慎重に分配します。実験グループごとに、15〜20個の胚を採取します。
   注:望ましい発生段階の健康な胚のみを実験プレートに入れます。薬物治療を6 hpfの胚で行わなければならないと仮定し、少なくとも30〜60分前に実験プレートに播種を開始します。

3.薬物治療

1. ゼブラフィッシュの胚に所望の濃度の薬剤を加えます。薬物含有E-3培地は、事前に十分に準備してください。ゼブラフィッシュの胚を治療するための作業培地を調製する前に、薬剤の原液に未溶解の薬剤が含まれていないことを確認してください。
2. 放射線スクリーニングのために培地に薬物を添加する前に、薬物の濃度のグレードで薬物の細胞毒性効果を確認してください。OECDガイドラインに従って、評価中の医薬品のLC50を評価します^59、60、61。
   注意: 照射時間中や観察時間中にプレートや皿を動かすときは注意してください。この処理中にプレートが乱れ、培地がウェルから漏れたり、胚がそれぞれのウェルからこぼれたりして、近くのウェルを汚染して実験を台無しにする可能性があります。

4. X線照射

1. 放射線実験を設定する際には、対照群/非照射群と放射線のみのグループを含めます。同様に、薬物スクリーニングを実施する際に、スクリーニング実験で投与されたものと同じ濃度の薬物を放射線とともに投与する別のグループを含めます。
   注意: ウェルプレートまたは培養皿の蓋と底の両方にラベルを付けて、蓋の位置を間違えないようにします。
2. 放射線遮蔽体が余分なウェルを覆い、放射線から保護できる場合、他のウェルが特定の放射線量に曝露されている場合は、ウェルプレートに胚を分配します。それ以外の場合は、個々のプレートまたはディスクを使用して、放射線量ごとに胚を播種します。
3. X線照射装置( 材料表参照)の電源を入れ、装置の初期化とウォームアップを開始します。
   注意: ソースから被写体までの距離(SSD)の値は50cmである必要があります。異なるSSDを再び使用することができるため、標準化が必要です。
4. 実験プレートを装置内部の照射器の下に中央に置き、プレートがX線源の真下にあることを確認してから、線量(例:5GY)を設定してX線を開始します。
   注:プレートをパラフィンフィルムで密封して、インキュベーターから照射器へ、および照射器から照射器に戻るプレートの輸送中に不要なこぼれや汚染を防ぎます。
5. 照射終了後、プレートを取り出し、マシンプログラムをシャットダウンし、マシンの電源を切り、照射直後に顕微鏡でプレートを確認してください。死んだ胚を取り除き、プレートを28.5°Cのインキュベーターに戻します。 解剖顕微鏡で評価した後、死んだ胚の数を記録します。
   (注)発育段階の違いにより放射線の影響が大きく影響する可能性があるため、個々のグループ間で指定線量を照射する。
   注意: X線装置を操作するときは、適切な保護対策を講じてください。

5. データ収集、イメージング、分析

1. 放射線照射後24時間ごとなど、所定の時間間隔でデータを収集します。生存率、孵化効率、発達段階、心拍数、体と尾の湾曲、心膜浮腫、卵黄嚢の伸展、小頭症、水泳膀胱の発達、一般的な運動性または活動など、考えられるすべての観察を記録します62,63,64。
2. 画像をキャプチャするには、きれいなスライドで代表的な胚を選択し、顕微鏡で胚を確認し、特定の方向に向け、 画像をクリックします。グループと時間に応じて画像ファイルの名前を変更します。
   注意: 異なる時間間隔で写真をキャプチャする場合は、同じ倍率と照明を使用する必要があります。

結果

プロトコルの全体的なレイアウトを図 2 に示します。放射線の影響と線量依存的な特性評価は、以下の分析で評価されました。

X線誘発毒性評価
実体顕微鏡を用いて、薬物治療および/または放射線照射後の以下の異常を評価し、特徴付けた。OECDガイドライン⁶¹によると、魚類の毒性評価では、胚の凝固?...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、数種類のがん研究を含む多くの研究で貴重なモデルとして使用されています。このモデルは、大規模な薬物スクリーニングのための有用なプラットフォームを提供する^67,68。他の毒性評価法と同様に、放射線および/または薬物治療時の主要な生物学的変化の定量的評価は、このプロトコルの最も重要な部分です。この種の研?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL