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요약

제브라피시는 최근 잠재적인 방사선 조절제를 검증하기 위한 모델로 활용되고 있습니다. 본 프로토콜은 방사선 기반 스크리닝 실험에 제브라피시 배아를 사용하는 세부 단계와 다양한 처리 및 방사선의 효과를 평가하기 위한 몇 가지 관찰 접근 방식을 설명합니다.

초록

제브라피쉬는 쉽게 관리할 수 있는 척추동물 모델 중 하나이며 독특하고 편리한 모델 시스템의 여러 기능을 보여주기 때문에 여러 종류의 연구에서 광범위하게 사용됩니다. 증식성이 높은 세포는 방사선으로 인한 DNA 손상에 더 취약하기 때문에 제브라피시 배아는 방사선 연구의 최전선 생체 내 모델입니다. 또한 이 모델은 주요 생물학적 사건 및 관련 반응과 함께 짧은 시간 내에 방사선 및 다양한 약물의 영향을 예측합니다. 여러 암 연구에서 제브라피시를 사용했으며, 이 프로토콜은 방사선 요법 및 암의 맥락에서 방사선 조절제의 사용을 기반으로 합니다. 이 방법은 방사선 조사 및 대조군(비방사선 조사) 배아에 대한 다양한 약물의 효과를 검증하는 데 쉽게 사용할 수 있으므로 약물을 방사선 감작 또는 보호 약물로 식별할 수 있습니다. 이 방법론은 대부분의 약물 스크리닝 실험에 사용되지만 X선 방사선 노출을 배경으로 한 실험 및 독성 평가의 세부 사항이 제한적이거나 간략하게만 다루어져 수행이 어렵습니다. 이 프로토콜은 이 문제를 해결하고 자세한 그림과 함께 절차 및 독성 평가에 대해 설명합니다. 이 절차는 방사선 연구 및 방사선 기반 약물 스크리닝에 제브라피시 배아를 사용하여 신뢰성과 재현성을 높이는 간단한 접근 방식을 설명합니다.

서문

제브라피시(Danio rerio)는 지난 30년 동안 연구에 널리 사용되어 온 잘 알려진 동물 모델입니다. 실험실 조건에서 사육 및 번식하기 쉬운 작은 민물고기입니다. 제브라피쉬는 다양한 발달 및 독성 연구에 광범위하게 사용되어 왔다 1,2,3,4,5,6,7,8. 제브라피쉬는 번식력이 높고 배아 생성이 짧습니다. 배아는 다양한 발달 단계를 추적하는데 적합하고, 시각적으로 투명하며, 다양한 유전자 조작 및 고처리량 스크리닝 플랫폼 9,10,11,12,13,14에 적응할 수 있다. 또한, 제브라피쉬는 입체 또는 형광 현미경 7,15,16을 사용하여 다양한 독성 물질 또는 요인이 존재할 때 발달 과정과 다양한 기형을 쉽게 연구할 수 있는 토토 및 라이브 이미징을 제공합니다.

방사선 치료는 암 치료에 사용되는 주요 치료 방법 중 하나입니다 17,18,19,20,21,22,23,24. 그러나 암 방사선 치료는 악성 세포를 죽이면서 정상적이고 건강한 세포가 죽지 않도록 보호하거나 고에너지 방사선을 포함하는 치료 중에 인간의 건강을 보호하기 위해 잠재적인 방사선 보호기를 필요로 한다 25,26,27,28,29. 반대로, 강력한 방사성 감작제는 특히 표적 및 정밀 치료에서 악성 세포를 죽이기 위한 방사선의 효율을 증가시키기 위해 연구되고 있다30,31,32,33. 따라서 강력한 방사선 보호기 및 감작제를 검증하기 위해 준고처리량 약물 스크리닝에 적합하고 방사선 효과를 측정 가능하게 나타내는 모델이 많이 요청됩니다. 사용 가능한 몇 가지 모델이 방사선 연구에 사용되며 약물 스크리닝 실험에 포함됩니다. 그러나 고등 척추동물과 가장 일반적으로 사용되는 생체 내 모델인 마우스조차도 이러한 모델로 이러한 스크리닝 실험을 설계하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 도전적이기 때문에 대규모 약물 스크리닝에 적합하지 않습니다. 유사하게, 세포 배양 모델은 다양한 고처리량 약물 스크리닝 실험(34,35)에 이상적이다. 그러나 세포 배양과 관련된 실험은 배양 중인 세포가 성장 조건 및 역학에 따라 거동을 현저하게 변화시킬 수 있기 때문에 항상 실용적이거나 재현성이 높거나 신뢰할 수 있는 것은 아닙니다. 또한, 다양한 세포 유형은 차등 방사선 감작을 나타냅니다. 특히, 2D 및 3D 세포 배양 시스템은 전체 유기체 시나리오를 나타내지 않으며, 따라서 얻어진 결과는 방사성 독성의 실제 수준을 요약하지 않을 수 있다36,37. 이와 관련하여 제브라피시는 새로운 방사능 감작제 및 방사능 보호제를 스크리닝하는 데 몇 가지 이점을 제공합니다. 취급 용이성, 큰 클러치 크기, 짧은 수명, 빠른 배아 발달, 배아 투명성 및 작은 몸 크기는 제브라피시를 대규모 약물 스크리닝에 적합한 모델로 만듭니다. 위의 장점으로 인해 짧은 시간에 실험을 쉽게 반복할 수 있으며 멀티웰 플레이트의 해부 현미경으로 효과를 쉽게 관찰할 수 있습니다. 따라서 제브라피시는 방사선 연구와 관련된 약물 스크리닝 연구에서 인기를 얻고 있습니다38,39.

방사선 조절제를 스크리닝하는 진정한 모델로서의 제브라피쉬의 잠재력은 다양한 연구에서 입증되었습니다 40,41,42,43,44,45. 제브라피시 모델에서 나노입자 DF1, 아미포스틴(WR-2721), DNA 복구 단백질 KU80 및 ATM, 이식된 조혈모세포와 같은 잠재적 방사성 변형제의 방사선 보호 효과와 플라보피리돌 및 AG1478과 같은 방사성 감작제의 효과가 보고되었다 19,41,42,43,44,45,46. 동일한 시스템을 사용하여 DF-1(풀러렌 나노입자)의 방사능 보호 효과를 전신 및 장기 특이적 수준에서 평가했으며, 방사능 보호기 스크리닝을 위한 제브라피시 배아의 사용도 추가로 조사되었습니다47. 최근 켈룰룻 꿀은 제브라피시 배아에서 방사성 보호제로 보고되었으며, 배아 생존율을 높이고 장기 특이적 손상, 세포 DNA 손상 및 세포사멸을 예방하는 것으로 밝혀졌다48.

유사하게, Hantzsch의 반응을 통해 생성된 중합체의 방사능 보호 효과는 고처리량 스크리닝에서 제브라피시 배아에서 확인되었으며, 보호는 주로 DNA 손상으로부터 세포를 보호함으로써 부여되었습니다49. 이전 연구들 중 하나에서, 친유성 스타틴 플루바스타틴(lipophilic statin fluvastatin)은 이러한 접근법을 가진 제브라피시 모델을 사용하여 잠재적인 방사성 감작제로서 발견되었다50. 유사하게, 금 나노 입자는 이상적인 방사성 감작제로 간주되며 많은 연구에서 사용되었습니다51,52.

제브라피쉬의 배아 발달은 단세포 접합체가 분열하여 실체현미경으로 쉽게 식별할 수 있는 2개의 세포, 4개의 세포, 8개의 세포, 16개의 세포, 32개의 세포 및 64개의 세포를 형성하는 초기 3시간 동안의 절단을 포함합니다. 그런 다음 128개의 세포(수정 후 2.25시간, hpf)가 있는 배반구 단계에 도달하며, 여기서 세포는 15분마다 두 배로 증가하여 256개 세포(2.5hpf), 512개 세포(2.75hpf) 및 단 3시간 만에 1,000+ 세포에 도달합니다(그림 1). 4 시간에, 난자는 구체 단계에 도달하고, 배아 질량 7,53,54에 돔 모양의 형성이 뒤따른다. 제브라피쉬의 위축은 5.25hpf54에서 시작하여 쉴드 단계에 도달합니다. 쉴드는 생식 고리의 한쪽으로 세포가 빠르게 수렴하는 움직임을 명확하게 나타내며(그림 1), 쉽게 식별할 수 있는 배아의 두드러지고 뚜렷한 단계입니다53,54. 배아에 대한 방사선 노출은 발달의 어느 단계에서나 이루어질 수 있지만, 배아 형성 중 방사선 노출은 방사선 유발 독성의 더 나은 판독을 용이하게 하는 보다 뚜렷한 형태학적 변화를 가질 수 있다55; 유사하게, 배아에 대한 약물 투여는 빠르면 2 HPF54부터 시작될 수 있다.

프로토콜

본 연구는 부바네스와르 생명과학연구소 기관동물윤리위원회(Institutional Animal Ethical Committee)의 사전 승인과 지침에 따라 수행되었다. 모든 제브라피시 유지 및 번식은 28.5°C의 주변 어류 배양 시설에서 수행되었으며, 배아는 28.5°C의 생물학적 산소 요구량(BOD) 인큐베이터에서 유지되었습니다. 여기서, 제브라피시 AB 균주를 사용하였고, Kimmel et al.54에 따라 병기를 수행하였다. X선 방사선은 6hpf(차폐 단계)에서 주어졌으며 120hpf까지 다른 표현형을 관찰했습니다.

1. 번식 설정 및 배아 채취

  1. 번식 탱크를 설정합니다 (폴리 카보네이트로 구성, 용량 1L, 재료 표 참조). 시스템 용수(pH, 6.8-7.5, 전도도, 500μS, 온도 28.5°C)를 부피의 거의 40%를 차지하는 사육 탱크에 붓습니다. 탱크에 칸막이를 놓아 암컷과 수컷을 위한 두 개의 방을 만듭니다.
  2. 부모 탱크에서 그물을 사용하여 건강한 암컷 2 마리와 건강한 수컷 1 마리를 조심스럽게 모아 각각의 반쪽에 넣고 28.5 ° C에서 밤새 (최소 10 시간) 어둠 속에 보관하십시오.
  3. 다음날 아침, 칸막이를 제거하고 번식 탱크를 방해하지 않고 물고기가 짝짓기를 할 수 있도록 하십시오.
    알림: 암컷은 산란을 시작하고 물고기가 짝짓기를 허용한 후 10-15분 이내에알이 수조 바닥에 누워 있는 것을 볼 수 있습니다 56,57,58.
  4. 산란 후 물고기를 수조로 되돌려 보내고, 여과기를 사용하여 번식 수조에서 배아를 수집하고, 시스템 물로 적절하게 세척하고, 수집 된 알을 E-3 배지 (4.94 mM의 NaCl, 0.17 mM의 KCl, 0.43 mM CaCl 2 , 0.85 mM의 MgCl2 염, 1 % w/v의 메틸렌 블루, 재료 표 참조).
  5. 해부 현미경으로 난자를 관찰하고, 파스퇴르 피펫을 사용하여 수정되지 않았거나 죽은 배아를 제거하고, E-3 배지에 수정란이 들어 있는 페트리 플레이트를 적절한 성장 및 유지를 위해 인큐베이터에서 28.5°C로 유지합니다.
    참고: 수정되지 않은 난자는 응고된 융모막 또는 융모막 내부의 파열된 세포가 있는 유백색으로 식별될 수 있습니다. 수정란과 함께 분열되지 않은 난자 및 분열 중 불규칙성과 같은 기형(예: 비대칭, 소포 형성 또는 융모막의 손상)이 있거나 활발하게 발달하지 않는 난자는 수집된 배아를 건강하게 유지하고 배지를 깨끗하게 유지하기 위해 폐기해야 합니다 7,56.

2. 방사선 실험을 위한 배아 모니터링 및 선택

  1. 해부 현미경으로 성장하는 배아를 모니터링하고, 적절한 단계 7,54를 식별하고, 죽거나 건강하지 않은 배아를 제거합니다. 방사선 및 약물 투여량이 특정 위축 단계에서 제공되므로 적절한 배아 병기를 보장합니다.
    알림: 매일 배양 접시에 있는 미디어의 수준과 품질을 확인하십시오. 죽은 배아를 제거하는 것과 함께 24시간마다 배지를 교체하십시오. 파스퇴르 피펫은 배아를 따거나 배지를 교체하는 데 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 실험을 시작하기 전에 파스퇴르 피펫을 사용하여 건강한 배아를 실험 플레이트에 조심스럽게 분배하십시오. 각 실험 그룹에 대해 15-20개의 배아를 채취합니다.
    알림: 원하는 발달 단계의 건강한 배아만 실험판에 놓습니다. 약물 치료가 6hpf의 배아로 수행되어야 한다고 가정한 다음 최소 30-60분 전에 실험 플레이트에 파종하기 시작합니다.

3. 약물 치료

  1. 제브라피시 배아에 원하는 농도의 약물을 추가합니다. 약물 함유 E-3 배지를 미리 준비하십시오. 제브라피시 배아 처리를 위한 작업 배지를 준비하기 전에 약물의 원액에 용해되지 않은 약물이 없는지 확인하십시오.
  2. 방사선 스크리닝을 위해 배지에 약물을 첨가하기 전에 약물의 농도 등급으로 약물의 세포 독성 효과를 확인하십시오. OECD 가이드라인에 따라 평가 대상 의약품의 LC 50을 평가한다 59,60,61.
    알림: 조사 또는 관찰 시간 동안 접시와 접시를 이동할 때 주의하십시오. 이 취급 중에 플레이트가 교란되어 배지가 우물 밖으로 누출되거나 배아가 각각의 우물 밖으로 쏟아져 나와 잠재적으로 근처의 우물을 오염시키고 실험을 망칠 가능성이 있습니다.

4. 엑스레이 조사

  1. 방사선 실험을 설정하는 동안 대조군/비방사선 및 방사선 전용 그룹을 포함합니다. 마찬가지로, 약물 스크리닝을 수행하는 동안 방사선과 함께 스크리닝 실험에서 투여된 것과 동일한 농도의 약물을 투여할 다른 그룹을 포함하십시오.
    알림: 뚜껑이 잘못 배치되지 않도록 웰 플레이트 또는 배양 접시의 뚜껑과 바닥에 라벨을 붙입니다.
  2. 방사선 차폐막이 여분의 웰을 덮고 방사선으로부터 보호할 수 있는 반면 다른 웰은 특정 방사선량에 노출될 수 있는 경우 배아를 웰 플레이트에 분배합니다. 그렇지 않으면 개별 플레이트 또는 디스크를 사용하여 방사선량당 배아를 파종합니다.
  3. X선 조사기를 켜고( 재료 표 참조) 기계 초기화 및 예열을 시작합니다.
    알림: 소스와 피사체 간 거리(SSD) 값은 50cm여야 합니다. 표준화가 필요한 다른 SSD를 다시 사용할 수 있습니다.
  4. 실험용 플레이트를 기계 내부의 조사기 아래에 놓고 플레이트가 X선 소스 바로 아래에 있는지 확인한 다음 선량(예: 5GY)을 설정하고 X선을 시작합니다.
    알림: 인큐베이터에서 조사기로 플레이트를 운송하는 동안 원치 않는 유출이나 오염을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오.
  5. 방사선 조사가 완료되면 플레이트를 꺼내고 기계 프로그램을 종료하고 기계의 전원을 끄고 방사선 직후 현미경으로 플레이트를 확인하십시오. 죽은 배아를 제거하고 플레이트를 28.5°C의 인큐베이터로 되돌립니다. 해부 현미경으로 평가한 후 죽은 배아의 수를 기록합니다.
    참고: 방사선의 영향은 발달 단계의 차이에 의해 크게 영향을 받을 수 있으므로 개별 그룹 간에 많은 지연 없이 지정된 방사선량으로 다른 그룹의 배아를 조사합니다.
    주의 : X-ray 기계를 작동하는 동안 적절한 보호 조치를 취하십시오.

5. 데이터 수집, 이미징 및 분석

  1. 방사선이 투여된 후 24시간마다와 같이 미리 결정된 시간 간격으로 데이터를 수집합니다. 생존율, 부화 효율, 발달 단계, 심장 박동 수, 몸과 꼬리 곡률, 심낭 부종, 난황낭의 확장, 소두증, 수영 방광 발달, 일반적인 운동성 또는 활동 등과 같은 가능한 모든 관찰을 기록합니다.62,63,64.
  2. 이미지를 캡처하려면 깨끗한 슬라이드에서 대표 배아를 선택하고 현미경으로 배아를 확인하고 특정 방향으로 방향을 지정한 다음 이미지를 클릭합니다. 그룹 및 시간에 따라 이미지 파일의 이름을 바꿉니다.
    참고: 다른 시간 간격으로 사진을 촬영하는 동안 동일한 배율과 조명을 사용해야 합니다.

결과

프로토콜의 전체 레이아웃은 그림 2에 나와 있습니다. 방사선의 영향 및 선량에 따른 특성화는 다음과 같은 분석을 통해 평가되었습니다.

X선 유도 독성 평가
실체현미경을 사용하여 약물 처리 및/또는 방사선 치료 후 다음과 같은 이상을 평가하고 특성화했습니다. OECD 가이드라인 61에 따르면, 어류의 독성 평가를 위해 배아?...

토론

제브라피시는 여러 유형의 암 연구를 포함한 많은 연구에서 귀중한 모델로 사용됩니다. 이 모델은 대규모 약물 스크리닝(67,68)을 위한 유용한 플랫폼을 제공한다. 다른 독성 평가 방법과 마찬가지로 방사선 및/또는 약물 처리 시 주요 생물학적 변화에 대한 정량적 평가는 이 프로토콜의 가장 중요한 부분입니다. 이러한 종류의 연구에서 생존이 독성을 ?...

공개

저자들은 상충되는 이해관계가 없다고 선언했다.

감사의 말

SS의 연구실과 RKS의 연구실은 DBT와 인도의 SERB로부터 보조금을 지원받고 있습니다. APM은 인도 정부의 ICMR 펠로우십 수혜자입니다. DP는 인도 정부의 CSIR 펠로우십 수혜자입니다. UN은 인도 정부의 DST-Inspire 펠로우십 수혜자입니다. 그림 2 는 Biorender(https://biorender.com)를 사용하여 생성되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
6 Well platesCorningCLS3335Polystyrene
B.O.D IncubatorOswaldJRIC-10
Calcium ChlorideFisher Scientific10101-41-4
Dissecting MicroscopeZeissStemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTEPolycarbonate
Glass petriplatesBorosil3165A75Glass
GraphpadPrismGraphPad Software, Inc.Version 5.01
Kline concavity slidesHimediaGW092-1PKGlass
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM8266
Methylene blue hydrateSigma-Aldrich66720-100G
ParafilmTarsons380020Paraffin film
Pasteur pipettesHimediaPW1212-1X500NOPolyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTIPolycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTDPolycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTLPolycarbonate
Potassium ChlorideSigma-AldrichP5655
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653-5KG
Sodium hydroxide pelletSRL1949181
Stereo Microscope Leica M205FALeicaModel/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-RayPrecision X-RayX-RAD 225XL

참고문헌

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