זחלי דגי זברה כמודל להערכת רדיוסנסיטיזרים או מגינים פוטנציאליים

Summary

דג הזברה נוצל לאחרונה כמודל לאימות משנים פוטנציאליים של קרינה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים המפורטים לשימוש בעוברים של דגי זברה לניסויי סינון מבוססי קרינה וכמה גישות תצפיתיות להערכת ההשפעה של טיפולים וקרינה שונים.

Abstract

דגי זברה נמצאים בשימוש נרחב במספר סוגים של מחקר מכיוון שהם אחד המודלים המתוחזקים בקלות של בעלי חוליות ומציגים מספר תכונות של מערכת מודל ייחודית ונוחה. מכיוון שתאים בעלי שגשוג גבוה רגישים יותר לנזק לדנ"א הנגרם על ידי קרינה, עוברים של דגי זברה הם מודל in vivo בחזית במחקר הקרינה. בנוסף, מודל זה מקרין את השפעת הקרינה ותרופות שונות תוך זמן קצר, יחד עם אירועים ביולוגיים מרכזיים ותגובות נלוות. מספר מחקרי סרטן השתמשו בדגי זברה, ופרוטוקול זה מבוסס על שימוש במשנים קרינה בהקשר של הקרנות וסרטן. שיטה זו יכולה לשמש בקלות כדי לאמת את ההשפעות של תרופות שונות על עוברים מוקרנים ובקרה (שאינם מוקרנים), ובכך לזהות תרופות כתרופות רגישות רדיו או תרופות הגנה. למרות שמתודולוגיה זו משמשת ברוב ניסויי סינון התרופות, פרטי הניסוי והערכת הרעילות על רקע החשיפה לקרינת רנטגן מוגבלים או מטופלים רק בקצרה, מה שמקשה על ביצועו. פרוטוקול זה מטפל בבעיה זו ודן בהליך ובהערכת רעילות עם המחשה מפורטת. הנוהל מתאר גישה פשוטה לשימוש בעוברים של דגי זברה למחקרי קרינה ולבדיקת תרופות מבוססות קרינה עם אמינות ויכולת שחזור רבה.

Introduction

דג הזברה (Danio rerio) הוא מודל ידוע של בעלי חיים שנמצא בשימוש נרחב במחקר במהלך 3 העשורים האחרונים. זהו דג מים מתוקים קטן שקל לגדל ולגדל בתנאי מעבדה. דג הזברה נמצא בשימוש נרחב במחקרים התפתחותיים וטוקסיקולוגיים שונים 1,2,3,4,5,6,7,8. דג הזברה הוא בעל פריון גבוה ודור עוברי קצר; העוברים מתאימים למעקב אחר שלבי התפתחות שונים, הם שקופים מבחינה חזותית, והם מתאימים למגוון רחב של מניפולציות גנטיות ופלטפורמות סינון בתפוקה גבוהה 9,10,11,12,13,14. מלבד זאת, דג הזברה מספק טוטו והדמיה חיה שעבורה ניתן ללמוד בקלות את תהליך התפתחותו ועיוותים שונים בנוכחות חומרים או גורמים רעילים שונים באמצעות סטריאו או מיקרוסקופ פלואורסצנטי 7,15,16.

רדיותרפיה היא אחת הדרכים הטיפוליות העיקריות המשמשות לטיפול בסרטן 17,18,19,20,21,22,23,24. עם זאת, הקרנות סרטן דורשות רדיואקטיבים פוטנציאליים כדי להגן על תאים בריאים נורמליים מפני מוות תוך הריגת תאים ממאירים או לשמור על בריאות האדם במהלך טיפול הכולל קרינה באנרגיה גבוהה 25,26,27,28,29. לעומת זאת, רדיוסנסיטיזרים חזקים נחקרים גם כדי להגביר את יעילות הקרינה להרוג תאים ממאירים, במיוחד בטיפולים ממוקדים ומדויקים ^30,31,32,33. לכן, כדי לאמת רדיו-מגינים ורגישים חזקים, מודל המתאים לסינון תרופות בתפוקה גבוהה למחצה ומציג השפעות קרינה באופן מדיד מתבקש מאוד. מספר מודלים זמינים משמשים במחקרי קרינה ומעורבים בניסויי סינון תרופות. עם זאת, בעלי חוליות גבוהים יותר ואפילו מודל ה-in vivo הנפוץ ביותר, עכברים, אינם מתאימים לבדיקות סקר בקנה מידה גדול מכיוון שזה גוזל זמן, יקר ומאתגר לתכנן ניסויי סינון כאלה עם מודלים אלה. באופן דומה, מודלים של תרביות תאים אידיאליים עבור סוגים שונים של ניסויי סינון תרופות בתפוקה גבוהה^34,35. עם זאת, ניסויים המערבים תרביות תאים אינם תמיד פרגמטיים, ניתנים לשחזור או אמינים מכיוון שתאים בתרבית עשויים לשנות את התנהגותם באופן ניכר בהתאם לתנאי הגידול והקינטיקה שלהם. כמו כן, סוגים שונים של תאים מראים רגישות דיפרנציאלית לקרינה. יש לציין כי מערכות תרבית תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות אינן מייצגות את תרחיש האורגניזם כולו, ולכן, התוצאות המתקבלות עשויות שלא לשחזר את רמת הרדיוטוקסיות בפועל^36,37. בהקשר זה, דג הזברה מספק מספר יתרונות בהקרנה עבור radiosensitizers חדשים radioprotectors. קלות הטיפול, גודל המצמד הגדול, תוחלת החיים הקצרה, ההתפתחות העוברית המהירה, שקיפות העובר וגודל הגוף הקטן הופכים את דג הזברה למודל מתאים לבדיקת תרופות בקנה מידה גדול. בשל היתרונות הנ"ל, ניתן לחזור על ניסויים בקלות תוך זמן קצר, וניתן לצפות באפקט בקלות תחת מיקרוסקופ מנתח בלוחות מרובי בארות. לפיכך, דג הזברה צובר פופולריות במחקר סינון תרופות הכולל מחקרי קרינה^38,39.

הפוטנציאל של דגי זברה כמודל בונאפיד לסינון משנים של קרינה הוכח במחקרים שונים 40,41,42,43,44,45. ההשפעה הרדיו-מגינה של משנים פוטנציאליים של רדיו, כגון ננו-חלקיקים DF1, אמיפוסטין (WR-2721), חלבוני תיקון DNA KU80 ו-ATM, ותאי גזע המטופויטיים מושתלים, וההשפעות של רדיוסנסיטיזרים, כגון פלבופרידול ו-AG1478, במודל דגי הזברה דווחו 19,41,42,43,44,45,46 . באמצעות אותה מערכת, ההשפעה הרדיו-מגינה של DF-1 (ננו-חלקיק פולרן) הוערכה הן ברמה המערכתית והן ברמה הספציפית לאיברים, וגם השימוש בעוברים של דגי זברה לבדיקת רדיו-פרוטקטורים נחקר עוד יותר⁴⁷. לאחרונה דווח על דבש קלולוט כמגן רדיו בעוברים של דגי זברה ונמצא כי הוא מגביר את הישרדות העובר ומונע נזק ספציפי לאיברים, נזק לדנ"א התאי ואפופטוזיס⁴⁸.

באופן דומה, ההשפעות הרדיו-הגנתיות של פולימרים שנוצרו באמצעות תגובתו של האנטש נבדקו על עוברים של דגי זברה בסינון בתפוקה גבוהה, וההגנה ניתנה בעיקר על ידי הגנה על התאים מפני נזק לדנ"א⁴⁹. באחד המחקרים הקודמים, סטטין פלובסטטין ליפופילי נמצא כרדיוסנסיטיזר פוטנציאלי באמצעות מודל דג הזברה בגישה זו⁵⁰. באופן דומה, ננו-חלקיקי זהב נחשבים לרדיו-סנסיטיזר אידיאלי ושימשו במחקרים רבים^51,52.

ההתפתחות העוברית בדגי זברה כרוכה בפיצול ב-3 השעות הראשונות שבהן זיגוטה חד-תאית מתחלקת ליצירת 2 תאים, 4 תאים, 8 תאים, 16 תאים, 32 תאים ו-64 תאים שניתן לזהות בקלות באמצעות סטריאומיקרוסקופ. לאחר מכן, הוא מגיע לשלב הבלסטולה עם 128 תאים (2.25 שעות לאחר ההפריה, hpf), שבו התאים מכפילים את עצמם כל 15 דקות וממשיכים דרך השלבים הבאים: 256 תאים (2.5 hpf), 512 תאים (2.75 hpf), ומגיעים ל-1,000+ תאים תוך 3 שעות בלבד (איור 1). בשעה 4 הביצית מגיעה לשלב הכדור, ואחריו נוצרת צורת כיפה במסה העוברית 7,53,54. הגסטרולציה בדגי זברה מתחילה מ-5.25 כ"ס⁵⁴, שם היא מגיעה לשלב המגן. המגן מציין בבירור את תנועת ההתכנסות המהירה של התאים לצד אחד של טבעת הנבט (איור 1), והוא שלב בולט ומובהק של עוברים מתגבשים שניתן לזהות בקלות^53,54. אף על פי שחשיפה לקרינה לעוברים יכולה להיעשות בכל שלב של התפתחותם, חשיפה לקרינה במהלך גסטרולציה עשויה להיות בעלת שינויים מורפולוגיים ברורים יותר המאפשרים קריאה טובה יותר של רעילות הנגרמת על ידי קרינה⁵⁵; באופן דומה, מתן תרופות לעוברים יכול להתחיל כבר 2 HPF⁵⁴.

Protocol

המחקר הנוכחי נערך באישור מראש ובהתאם להנחיות הוועדה האתית המוסדית לבעלי חיים, המכון למדעי החיים, בובנסוואר. כל התחזוקה והרבייה של דגי הזברה נערכו במתקן לגידול דגי סביבה בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס, והעוברים נשמרו באינקובטור ביקוש חמצן ביולוגי (BOD) בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. כאן נעשה שימוש בזן AB של דגי הזברה, וההיערכות בוצעה על פי קימל ואחרים ⁵⁴. קרינת רנטגן ניתנה ב 6 HPF (שלב המגן), ופנוטיפים שונים נצפו עד 120 hpf.

1. מערך רבייה ואיסוף עוברים

1. הגדר את מיכלי הגידול (המורכבים מפוליקרבונט, קיבולת 1 ליטר, ראה טבלת חומרים). יוצקים את מי המערכת (pH, 6.8-7.5; מוליכות, 500 μS; וטמפרטורה, 28.5 מעלות צלזיוס) לתוך מכלי הרבייה המכסים כמעט 40% מנפחם. הניחו את המחיצה במיכל כדי ליצור שני תאים, אחד לנקבות והשני לזכרים.
2. ממיכלי ההורים, אספו בזהירות שתי נקבות בריאות וזכר בריא אחד בעזרת רשת, הכניסו אותם לחצאים המתאימים שלהם, ושמרו אותם בחושך למשך הלילה (מינימום 10 שעות) ב 28.5 מעלות צלזיוס.
3. למחרת בבוקר, הסירו את המחיצה ואפשרו לדגים להזדווג מבלי להפריע למכלי הרבייה.
   הערה: הנקבות יתחילו להשריץ, והביצים ייראו שוכבות על קרקעית המיכל תוך 10-15 דקות לאחר שהדגים יורשו להזדווג^56,57,58.
4. להחזיר את הדגים למכלים שלהם לאחר ההשרצה, לאסוף את העוברים ממיכל הרבייה באמצעות מסננת, לשטוף אותם כראוי עם מי המערכת, ולשמור את הביצים שנאספו בצלחת פטרי עם מדיה E-3 (4.94 mM של NaCl, 0.17 mM של KCl, 0.43 mM CaCl 2, 0.85 mM של מלחי MgCl₂, 1% w / v של כחול מתילן, ראו טבלת חומרים).
5. התבוננו בביציות תחת מיקרוסקופ נתיחה, הוציאו את העוברים הלא מופרים או המתים באמצעות פיפטת פסטר, ושמרו את לוחות פטרי המכילים ביציות מופרות בתווך E-3 בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס באינקובטור לצורך גדילתם ותחזוקתם התקינה.
   הערה: ניתן לזהות ביציות לא מופרות עם מראה לבן חלבי עם כוריון קרוש או עם תאים קרועים בתוך הכוריון. יחד עם ביציות לא מופרות, ביציות שאינן עוברות מחשוף וביציות עם עיוותים כמו אי סדרים במהלך המחשוף, למשל, אסימטריה, היווצרות שלפוחית, או פציעות של הכוריון, או שאינן מתפתחות באופן פעיל, יש להשליך כדי לשמור על העוברים שנאספו בריאים ולשמור על המדיה נקייה ^7,56.

2. מעקב אחר עוברים וברירה לניסויי קרינה

1. עקוב אחר העוברים הגדלים תחת המיקרוסקופ המנתח, זהה את השלב הנכון ^7,54, והסר עוברים מתים או לא בריאים. יש להקפיד על היערכות נאותה של העובר, שכן מנות הקרינה והתרופות יינתנו בשלב מסוים של גסטרולציה.
   הערה: בכל יום, בדוק את רמת ואיכות המדיה במנות התרבות. שנה את המדיה כל 24 שעות, יחד עם הסרת עוברים מתים. פיפטות פסטר מועדפות לשימוש לקטיף עוברים או לשינוי מדיה.
2. לפני תחילת הניסוי, בזהירות להפיץ את העוברים הבריאים בצלחות הניסוי בעזרת פיפטה פסטר. עבור כל קבוצת ניסוי, לקחת 15-20 עוברים.
   הערה: יש להניח בצלחת הניסוי רק עוברים בריאים משלבי ההתפתחות הרצויים. נניח שהטיפול התרופתי צריך להיעשות עם עוברים ב 6 hpf, ואז להתחיל לזרוע אותם בצלחות ניסיוניות לפחות 30-60 דקות קודם לכן.

3. טיפול תרופתי

1. הוסף תרופות בריכוז הרצוי לעוברים של דגי זברה. הכינו את המדיה E-3 המכילה את התרופה זמן רב מראש. ודא כי בתמיסת המלאי של התרופה אין תרופה בלתי מומסת לפני הכנת המדיה העובדת לטיפול בעוברים של דגי זברה.
2. לפני הוספת תרופה כלשהי למדיום לבדיקת קרינה, בדוק את ההשפעה ציטוטוקסית של התרופה עם דרגות הריכוזים של התרופה. עקוב אחר הנחיות ה- OECD כדי להעריך את LC 50 של התרופות תחת הערכה 59,60,61.
   הערה: היזהר בעת הזזת הצלחות והכלים בזמן ההקרנה או התצפית. ישנם סיכויים רבים שהלוחות יופרעו במהלך הטיפול הזה, מה שיגרום לתקשורת לדלוף החוצה מהבארות או לעוברים להישפך מהבארות שלהם, מה שעלול לזהם בארות סמוכות ולהרוס את הניסוי.

4. הקרנת רנטגן

1. בעת הגדרת ניסוי קרינה, כלול קבוצת בקרה/לא מוקרנת וקבוצת קרינה בלבד. באופן דומה, בעת ביצוע בדיקת סמים, יש לכלול קבוצה נוספת שבה התרופות יינתנו באותו ריכוז כמו אלה שניתנו בניסוי הסינון יחד עם קרינה.
   הערה: יש לתייג הן את המכסה והן את הבסיס של צלחות באר או כלי תרבית כדי שהמכסים לא ייתפסו שלא במקומם.
2. לפזר את העוברים בצלחת באר אם מגיני הקרינה יכולים לכסות ולהגן על הבארות הנוספות מפני קרינה בעוד הבארות האחרות חשופות למנת קרינה מסוימת; אחרת, השתמש בצלחות או דיסקים בודדים כדי לזרוע את העוברים בכל מנת קרינה.
3. הפעל את מכשיר הקרנת קרני הרנטגן (ראה טבלת חומרים), והתחל את אתחול המכשיר וחימום.
   הערה: ערך המקור למרחק נושא (SSD) חייב להיות 50 ס"מ; אפשר להשתמש שוב בכונני SSD שונים, מה שדורש סטנדרטיזציה.
4. הניחו את צלחת הניסוי מתחת למקרין בתוך המכונה במרכז, וודאו שהצלחת נמצאת ישירות מתחת למקור הרנטגן, ולאחר מכן קבעו את המינון (למשל, 5 GY) והתחילו את צילום הרנטגן.
   הערה: אטמו את הצלחות בסרט פרפין כדי למנוע שפיכה או זיהום לא רצוי במהלך הובלת הצלחות מהאינקובטור למקרין ובחזרה.
5. לאחר סיום ההקרנה, הוציאו את הלוחות, כבו את תוכנית המכונה, כבו את המכונה ובדקו את הצלחות תחת המיקרוסקופ מיד לאחר הקרינה. הסר את העוברים המתים והחזיר את הצלחות לאינקובטור ב 28.5 מעלות צלזיוס. רשום את מספר העוברים המתים לאחר הערכתם תחת המיקרוסקופ המנתח.
   הערה: יש להקרין את קבוצות העוברים השונות במנות קרינה ייעודיות ללא דיחוי רב בין קבוצות בודדות, שכן השפעת הקרינה עשויה להיות מושפעת באופן משמעותי מההבדל בשלב ההתפתחותי.
   אזהרה: בעת הפעלת מכונת הרנטגן, יש לנקוט באמצעי הגנה מתאימים.

5. איסוף, הדמיה וניתוח נתונים

1. לאסוף נתונים בפרקי זמן קבועים מראש, כגון כל 24 שעות לאחר מתן הקרינה. רשום את כל התצפיות האפשריות כגון הישרדות, יעילות בקיעה, שלב ההתפתחות, ספירת פעימות לב, עקמומיות הגוף והזנב, בצקת קרום הלב, הרחבת שק החלמון, מיקרוצפליה, התפתחות שלפוחית השתן, תנועתיות או פעילות כללית וכו '.^62,63,64.
2. כדי לצלם תמונות, בחרו עוברים מייצגים בשקופית נקייה, בדקו את העוברים מתחת למיקרוסקופ, כוונו אותם לכיוון מסוים ולחצו על תמונות. שנה את שמות קובצי התמונה בהתאם לקבוצה ולשעה.
   הערה: יש להשתמש באותה הגדלה ותאורה בעת לכידת תמונות בפרקי זמן שונים.

תוצאות

הפריסה הכוללת של הפרוטוקול מתוארת באיור 2. השפעת הקרינה והאפיון באופן תלוי מינון הוערכו בניתוחים הבאים.

הערכה של רעילות הנגרמת על ידי קרני רנטגן
באמצעות סטריאומיקרוסקופ הוערכו ואופיינו החריגות הבאות לאחר הטיפול התרופתי ו/או הקרינה. על ?...

Discussion

דגי זברה משמשים כמודלים בעלי ערך במחקרים רבים, כולל סוגים שונים של חקר הסרטן. מודל זה מספק פלטפורמה שימושית לבדיקת סמים בקנה מידה גדול^67,68. כמו כל שיטה אחרת להערכת רעילות, ההערכה הכמותית של השינויים הביולוגיים העיקריים בעת קרינה ו / או טיפול תרופתי היא החלק הח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL