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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der Zebrafisch wurde kürzlich als Modell zur Validierung potenzieller Strahlungsmodifikatoren genutzt. Das vorliegende Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Verwendung von Zebrafischembryonen für strahlenbasierte Screening-Experimente und einige Beobachtungsansätze, um die Wirkung verschiedener Behandlungen und Bestrahlungen zu bewerten.

Zusammenfassung

Zebrafische werden häufig in verschiedenen Arten der Forschung verwendet, da sie zu den am einfachsten zu wartenden Wirbeltiermodellen gehören und mehrere Merkmale eines einzigartigen und praktischen Modellsystems aufweisen. Da hochproliferative Zellen anfälliger für strahleninduzierte DNA-Schäden sind, sind Zebrafischembryonen ein vorderstes In-vivo-Modell in der Strahlenforschung. Darüber hinaus projiziert dieses Modell die Wirkung von Strahlung und verschiedenen Medikamenten innerhalb kurzer Zeit sowie wichtige biologische Ereignisse und damit verbundene Reaktionen. In mehreren Krebsstudien wurden Zebrafische verwendet, und dieses Protokoll basiert auf der Verwendung von Strahlungsmodifikatoren im Zusammenhang mit Strahlentherapie und Krebs. Diese Methode kann leicht verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Medikamente auf bestrahlte und kontrollierte (nicht bestrahlte) Embryonen zu validieren und so Medikamente als radiosensibilisierende oder schützende Medikamente zu identifizieren. Obwohl diese Methodik in den meisten Drogenscreening-Experimenten verwendet wird, werden die Details des Experiments und die Toxizitätsbewertung vor dem Hintergrund der Röntgenstrahlenbelastung nur begrenzt oder nur kurz behandelt, was die Durchführung erschwert. Dieses Protokoll befasst sich mit diesem Problem und erläutert das Verfahren und die Toxizitätsbewertung mit einer detaillierten Illustration. Das Verfahren beschreibt einen einfachen Ansatz zur Verwendung von Zebrafischembryonen für Strahlenstudien und strahlenbasiertes Wirkstoffscreening mit hoher Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit.

Einleitung

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein bekanntes Tiermodell, das in den letzten 3 Jahrzehnten in der Forschung weit verbreitet war. Es handelt sich um einen kleinen Süßwasserfisch, der unter Laborbedingungen leicht aufzuziehen und zu züchten ist. Der Zebrafisch wurde ausgiebig für verschiedene entwicklungstechnische und toxikologische Studien verwendet 1,2,3,4,5,6,7,8. Der Zebrafisch hat eine hohe Fruchtbarkeit und eine kurze Embryonalgeneration; Die Embryonen eignen sich für die Verfolgung verschiedener Entwicklungsstadien, sind visuell transparent und eignen sich für verschiedene Arten von genetischer Manipulation und Hochdurchsatz-Screening-Plattformen 9,10,11,12,13,14. Darüber hinaus liefert der Zebrafisch In-toto- und Live-Bildgebung, für die sein Entwicklungsprozess und verschiedene Missbildungen in Gegenwart verschiedener toxischer Substanzen oder Faktoren mit Hilfe von Stereo- oder Fluoreszenzmikroskopie leicht untersucht werdenkönnen 7,15,16.

Die Strahlentherapie ist eine der wichtigsten therapeutischen Methoden bei der Behandlung von Krebs 17,18,19,20,21,22,23,24. Die Strahlentherapie bei Krebs erfordert jedoch potenzielle Strahlenschützer, um normale gesunde Zellen vor dem Absterben zu schützen, während bösartige Zellen abgetötet werden, oder um die menschliche Gesundheit während einer Therapie mit hochenergetischer Strahlung zu schützen 25,26,27,28,29. Umgekehrt werden auch potente Radiosensibilisatoren untersucht, um die Effizienz der Bestrahlung zur Abtötung bösartiger Zellen zu erhöhen, insbesondere in zielgerichteten und präzisen Therapien30,31,32,33. Um potente Strahlenschützer und Sensibilisatoren zu validieren, wird daher ein Modell gesucht, das für das Semi-Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening geeignet ist und messbare Strahleneffekte aufweist. Mehrere verfügbare Modelle werden in Strahlenstudien verwendet und an Wirkstoff-Screening-Experimenten beteiligt. Höhere Wirbeltiere und selbst das am häufigsten verwendete In-vivo-Modell, Mäuse, sind jedoch für ein groß angelegtes Wirkstoff-Screening ungeeignet, da es zeitaufwändig, kostspielig und schwierig ist, solche Screening-Experimente mit diesen Modellen zu entwerfen. In ähnlicher Weise sind Zellkulturmodelle ideal für verschiedene Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-Experimente34,35. Experimente mit Zellkultur sind jedoch nicht immer pragmatisch, hochgradig reproduzierbar oder zuverlässig, da Zellen in Kultur ihr Verhalten je nach Wachstumsbedingungen und Kinetik deutlich ändern können. Außerdem zeigen verschiedene Zelltypen eine differentielle Strahlungssensibilisierung. Insbesondere stellen 2D- und 3D-Zellkultursysteme nicht das gesamte Organismenszenario dar, so dass die erzielten Ergebnisse möglicherweise nicht den tatsächlichen Grad der Radiotoxizität rekapitulieren36,37. In dieser Hinsicht bietet der Zebrafisch mehrere Vorteile beim Screening nach neuartigen Radiosensibilisatoren und Strahlenschutzmitteln. Die einfache Handhabung, die große Gelegegröße, die kurze Lebensdauer, die schnelle Embryonalentwicklung, die Transparenz des Embryos und die geringe Körpergröße machen den Zebrafisch zu einem geeigneten Modell für ein groß angelegtes Wirkstoffscreening. Aufgrund der oben genannten Vorteile können Experimente in kurzer Zeit problemlos wiederholt werden, und der Effekt kann leicht unter einem Präpariermikroskop in Multi-Well-Platten beobachtet werden. Daher gewinnt der Zebrafisch in der Drogenscreening-Forschung mit Strahlenstudien an Popularität38,39.

Das Potenzial des Zebrafisches als echtes Modell für das Screening von Strahlungsmodifikatoren wurde in verschiedenen Studien nachgewiesen 40,41,42,43,44,45. Die strahlenschützende Wirkung potenzieller Radiomodifikatoren wie Nanopartikel DF1, Amifostin (WR-2721), DNA-Reparaturproteine KU80 und ATM sowie transplantierte hämatopoetische Stammzellen sowie die Wirkungen von Radiosensibilisatoren wie Flavopiridol und AG1478 im Zebrafischmodell wurden berichtet 19,41,42,43,44,45,46 . Mit dem gleichen System wurde die strahlenprotektive Wirkung von DF-1 (Fulleren-Nanopartikel) sowohl auf systemischer als auch auf organspezifischer Ebene untersucht, und auch die Verwendung von Zebrafischembryonen für das Strahlenschutz-Screening wurde weiter untersucht47. Kürzlich wurde der Kelulut-Honig als Strahlenschutz in Zebrafischembryonen beschrieben und es wurde festgestellt, dass er das Überleben des Embryos erhöht und organspezifische Schäden, zelluläre DNA-Schäden und Apoptose verhindert48.

In ähnlicher Weise wurden die strahlenprotektiven Effekte von Polymeren, die durch die Hantzsch-Reaktion erzeugt wurden, an Zebrafischembryonen in einem Hochdurchsatz-Screening überprüft, wobei der Schutz hauptsächlich durch den Schutz der Zellen vor DNA-Schäden gewährleistet wurde49. In einer der vorangegangenen Studien wurde das lipophile Statin Fluvastatin als potenzieller Radiosensibilisator unter Verwendung des Zebrafischmodells mit diesem Ansatz gefunden50. In ähnlicher Weise gelten Goldnanopartikel als idealer Radiosensibilisator und wurden in vielen Studien verwendet51,52.

Die embryonale Entwicklung im Zebrafisch beinhaltet eine Spaltung in den ersten 3 Stunden, in denen sich eine einzellige Zygote teilt, um 2 Zellen, 4 Zellen, 8 Zellen, 16 Zellen, 32 Zellen und 64 Zellen zu bilden, die mit einem Stereomikroskop leicht identifiziert werden können. Dann erreicht es das Blastulastadium mit 128 Zellen (2,25 h nach der Befruchtung, hpf), in dem sich die Zellen alle 15 Minuten verdoppeln und die folgenden Stadien durchlaufen: 256 Zellen (2,5 hpf), 512 Zellen (2,75 hpf) und das Erreichen von 1.000+ Zellen in nur 3 h (Abbildung 1). Nach 4 Stunden erreicht die Eizelle das Kugelstadium, gefolgt von der Bildung einer Kuppelform in der embryonalen Masse 7,53,54. Die Gastrulation im Zebrafisch beginnt bei 5,25 hpf54 und erreicht dort das Schildstadium. Der Schild zeigt deutlich die schnelle Konvergenzbewegung der Zellen zu einer Seite des Keimrings an (Abbildung 1) und ist eine prominente und ausgeprägte Phase der gastrulierenden Embryonen, die leicht identifiziert werden kann53,54. Obwohl die Strahlenexposition von Embryonen in jedem Stadium ihrer Entwicklung erfolgen kann, könnte die Strahlenexposition während der Gastrulation deutlichere morphologische Veränderungen aufweisen, die eine bessere Ablesung strahleninduzierter Toxizitäten ermöglichen55; In ähnlicher Weise kann mit der Verabreichung von Medikamenten an Embryonen bereits im Alter von 2 HPF54 begonnen werden.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde mit vorheriger Genehmigung und gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar, durchgeführt. Die gesamte Pflege und Zucht von Zebrafischen wurde in einer Umgebungsfischzuchtanlage bei 28,5 °C durchgeführt, und die Embryonen wurden in einem Inkubator mit biologischem Sauerstoffbedarf (BSB) bei einer Temperatur von 28,5 °C gehalten. Hier wurde der Zebrafisch-AB-Stamm verwendet, und das Staging wurde nach Kimmel et al.54 durchgeführt. Die Röntgenstrahlung wurde bei 6 hpf (Schildstadium) verabreicht, und bis 120 hpf wurden verschiedene Phänotypen beobachtet.

1. Zuchtaufbau und Embryonenentnahme

  1. Stellen Sie die Zuchtbecken ein (aus Polycarbonat, Fassungsvermögen 1 l, siehe Materialtabelle). Gießen Sie Systemwasser (pH-Wert 6,8-7,5, Leitfähigkeit 500 μS und Temperatur 28,5 °C) in die Zuchtbecken, die fast 40 % des Volumens abdecken. Setze die Trennwand in den Tank, um zwei Kammern zu schaffen, eine für Weibchen und die andere für Männchen.
  2. Aus den Elternbecken werden zwei gesunde Weibchen und ein gesundes Männchen vorsichtig mit Hilfe eines Netzes entnommen, in ihre jeweiligen Hälften gelegt und über Nacht (mindestens 10 h) bei 28,5 °C im Dunkeln gehalten.
  3. Entfernen Sie am nächsten Morgen die Trennwand und lassen Sie die Fische sich paaren, ohne die Zuchtbecken zu stören.
    HINWEIS: Die Weibchen beginnen mit dem Laichen und die Eier werden innerhalb von 10-15 Minuten auf dem Boden des Aquariums liegen, nachdem die Fische sich paaren dürfen56,57,58.
  4. Die Fische nach dem Laichen in ihre Becken zurückbringen, die Embryonen mit einem Sieb aus dem Zuchtbecken entnehmen, sie ordnungsgemäß mit dem Systemwasser waschen und die gesammelten Eier in einer Petriplatte mit E-3-Medien aufbewahren (4,94 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,43 mM CaCl2, 0,85 mM MgCl2-Salze, 1 Gew.-% Methylenblau, siehe Materialtabelle).
  5. Beobachten Sie die Eizellen unter einem Präpariermikroskop, entfernen Sie die unbefruchteten oder toten Embryonen mit einer Pasteurpipette und bewahren Sie die Petriplatten mit den befruchteten Eizellen im E-3-Medium bei 28,5 °C in einem Inkubator auf, damit sie richtig wachsen und erhalten bleiben können.
    HINWEIS: Unbefruchtete Eizellen können mit einem milchig-weißen Aussehen mit einem koagulierten Chorion oder mit geplatzten Zellen im Chorion identifiziert werden. Neben unbefruchteten Eizellen müssen auch Eizellen, die nicht gespalten werden, und Eier mit Missbildungen wie Unregelmäßigkeiten während der Spaltung, z. B. Asymmetrie, Bläschenbildung, Verletzungen des Chorions, oder Eier, die sich nicht aktiv entwickeln, verworfen werden, um die gesammelten Embryonen gesund zu halten und das Medium sauber zu halten 7,56.

2. Überwachung der Embryonen und Selektion für Bestrahlungsexperimente

  1. Überwachen Sie die wachsenden Embryonen unter dem Präpariermikroskop, identifizieren Sie das richtige Stadium 7,54 und entfernen Sie alle toten oder ungesunden Embryonen. Stellen Sie ein angemessenes Embryo-Staging sicher, da die Strahlen- und Medikamentendosen in einem bestimmten Gastrulationsstadium verabreicht werden.
    HINWEIS: Kontrollieren Sie jeden Tag das Niveau und die Qualität der Medien in den Kulturschalen. Wechseln Sie das Medium alle 24 Stunden und entfernen Sie tote Embryonen. Pasteurpipetten werden bevorzugt für die Entnahme von Embryonen oder den Wechsel von Medien verwendet.
  2. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, verteilen Sie die gesunden Embryonen vorsichtig mit Hilfe einer Pasteurpipette auf den Versuchsplatten. Für jede Versuchsgruppe werden 15-20 Embryonen entnommen.
    HINWEIS: Geben Sie nur gesunde Embryonen der gewünschten Entwicklungsstadien in die Versuchsplatte. Nehmen wir an, die medikamentöse Behandlung muss mit Embryonen bei 6 hpf durchgeführt werden, dann beginnen Sie mindestens 30-60 Minuten früher mit der Aussaat in Versuchsplatten.

3. Medikamentöse Behandlung

  1. Fügen Sie den Zebrafischembryonen Medikamente der gewünschten Konzentration hinzu. Bereiten Sie die arzneimittelhaltigen E-3-Medien rechtzeitig vor. Stellen Sie sicher, dass die Stammlösung des Arzneimittels kein ungelöstes Arzneimittel enthält, bevor Sie das Arbeitsmedium für die Behandlung von Zebrafischembryonen vorbereiten.
  2. Bevor Sie ein Medikament zu einem Medium für das Strahlenscreening hinzufügen, überprüfen Sie die zytotoxische Wirkung des Arzneimittels mit den Konzentrationsgraden des Arzneimittels. Befolgen Sie die OECD-Richtlinien zur Bewertung der LC 50 der zu bewertenden Arzneimittel 59,60,61.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Teller und Schalen während der Bestrahlung oder Beobachtungszeit bewegen. Es besteht die Möglichkeit, dass die Platten während dieser Handhabung gestört werden, was dazu führt, dass die Medien aus den Vertiefungen austreten oder die Embryonen aus ihren jeweiligen Vertiefungen auslaufen, was möglicherweise nahe gelegene Bohrlöcher kontaminiert und das Experiment ruiniert.

4. Röntgenbestrahlung

  1. Schließen Sie bei der Einrichtung eines Strahlungsexperiments eine Kontroll-/Nicht-Bestrahlten- und eine Nur-Strahlungs-Gruppe ein. In ähnlicher Weise sollten Sie bei der Durchführung eines Drogenscreenings eine andere Gruppe einbeziehen, bei der die Medikamente mit der gleichen Konzentration verabreicht werden wie die im Screening-Experiment verabreichten zusammen mit Strahlung.
    HINWEIS: Beschriften Sie sowohl den Deckel als auch den Boden von Brunnentellern oder Kulturschalen, damit die Deckel nicht verlegt werden.
  2. Verteilen Sie die Embryonen in einer Well-Platte, wenn die Strahlenschilde die zusätzlichen Wells abdecken und vor Strahlung schützen können, während die anderen Wells einer bestimmten Strahlendosis ausgesetzt sind; Andernfalls werden einzelne Platten oder Scheiben verwendet, um die Embryonen pro Strahlendosis auszusäen.
  3. Schalten Sie das Röntgenbestrahlungsgerät ein (siehe Materialtabelle) und starten Sie die Initialisierung und das Aufwärmen des Geräts.
    HINWEIS: Der Wert für den Abstand zwischen Quelle und Motiv (SSD) muss 50 cm betragen. man kann wieder verschiedene SSDs verwenden, was eine Standardisierung erfordert.
  4. Legen Sie die Versuchsplatte unter den Bestrahlungsstrahler im Inneren des Geräts in der Mitte, achten Sie darauf, dass sich die Platte direkt unter der Röntgenquelle befindet, stellen Sie dann die Dosis ein (z. B. 5 GY) und starten Sie die Röntgenaufnahme.
    HINWEIS: Versiegeln Sie die Platten mit Paraffinfolie, um unerwünschtes Verschütten oder Verunreinigungen während des Transports der Platten vom Inkubator zum Bestrahlungskörper und zurück zu vermeiden.
  5. Nehmen Sie nach Beendigung der Bestrahlung die Platten heraus, fahren Sie das Maschinenprogramm herunter, schalten Sie das Gerät aus und überprüfen Sie die Platten unmittelbar nach der Bestrahlung unter dem Mikroskop. Entnehmen Sie die toten Embryonen und legen Sie die Platten bei 28,5 °C in den Inkubator zurück. Notieren Sie die Anzahl der toten Embryonen, nachdem Sie sie unter dem Präpariermikroskop untersucht haben.
    ANMERKUNG: Bestrahlen Sie die verschiedenen Gruppen von Embryonen mit bestimmten Strahlendosen ohne große Verzögerung zwischen den einzelnen Gruppen, da die Wirkung der Bestrahlung durch den Unterschied im Entwicklungsstadium erheblich beeinflusst werden kann.
    VORSICHT: Treffen Sie beim Betrieb des Röntgengeräts geeignete Schutzmaßnahmen.

5. Datenerfassung, -bildgebung und -analyse

  1. Sammeln Sie Daten in vorgegebenen Zeitintervallen, z. B. alle 24 Stunden nach der Verabreichung der Strahlung. Zeichnen Sie alle möglichen Beobachtungen auf, wie z. B. Überleben, Schlupfeffizienz, Entwicklungsstadium, Herzschlagzahl, Körper- und Schwanzkrümmung, Perikardödem, Ausdehnung des Dottersacks, Mikrozephalie, Entwicklung der Schwimmblase, allgemeine Motilität oder Aktivität usw.62,63,64.
  2. Um Bilder aufzunehmen, wählen Sie repräsentative Embryonen auf einem sauberen Objektträger aus, überprüfen Sie die Embryonen unter dem Mikroskop, richten Sie sie in eine bestimmte Richtung aus und klicken Sie auf die Bilder. Benennen Sie die Bilddateien entsprechend der Gruppe und der Zeit um.
    HINWEIS: Bei der Aufnahme von Bildern in unterschiedlichen Zeitintervallen muss die gleiche Vergrößerung und Beleuchtung verwendet werden.

Ergebnisse

Das Gesamtlayout des Protokolls ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Wirkung der Bestrahlung und die dosisabhängige Charakterisierung wurde mit den folgenden Analysen bewertet.

Bewertung von röntgeninduzierten Toxizitäten
Mit Hilfe eines Stereomikroskops wurden die folgenden Auffälligkeiten nach der medikamentösen Behandlung und/oder Bestrahlung beurteilt und charakterisiert. Gemäß den OECD-Richtlinien 61 wurden für die ...

Diskussion

Zebrafische werden als wertvolle Modelle in vielen Studien verwendet, darunter auch in verschiedenen Arten der Krebsforschung. Dieses Modell bietet eine nützliche Plattform für groß angelegte Drogenscreenings67,68. Wie bei jeder anderen Methode zur Bewertung der Toxizität ist die quantitative Bewertung der wichtigsten biologischen Veränderungen nach Bestrahlung und/oder medikamentöser Behandlung der wichtigste Teil dieses Protokolls. Bei dieser Art von Stud...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen erklärt.

Danksagungen

Das Labor von SS und das Labor von RKS werden durch Zuschüsse von DBT und SERB, Indien, finanziert. APM ist Empfänger des ICMR-Stipendiums der indischen Regierung. DP ist Stipendiat des CSIR-Stipendiums der indischen Regierung. Die Vereinten Nationen sind Empfänger des DST-Inspire-Stipendiums der indischen Regierung. Abbildung 2 wurde mit Biorender (https://biorender.com) erstellt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
6 Well platesCorningCLS3335Polystyrene
B.O.D IncubatorOswaldJRIC-10
Calcium ChlorideFisher Scientific10101-41-4
Dissecting MicroscopeZeissStemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTEPolycarbonate
Glass petriplatesBorosil3165A75Glass
GraphpadPrismGraphPad Software, Inc.Version 5.01
Kline concavity slidesHimediaGW092-1PKGlass
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM8266
Methylene blue hydrateSigma-Aldrich66720-100G
ParafilmTarsons380020Paraffin film
Pasteur pipettesHimediaPW1212-1X500NOPolyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTIPolycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTDPolycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTLPolycarbonate
Potassium ChlorideSigma-AldrichP5655
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653-5KG
Sodium hydroxide pelletSRL1949181
Stereo Microscope Leica M205FALeicaModel/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-RayPrecision X-RayX-RAD 225XL

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