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Resumo

O peixe-zebra tem sido recentemente explorado como um modelo para validar potenciais modificadores de radiação. O presente protocolo descreve as etapas detalhadas para o uso de embriões de zebrafish para experimentos de triagem baseados em radiação e algumas abordagens observacionais para avaliar o efeito de diferentes tratamentos e radiação.

Resumo

Os peixes-zebra são amplamente utilizados em vários tipos de pesquisa porque são um dos modelos de vertebrados de fácil manutenção e exibem várias características de um sistema modelo único e conveniente. Como as células altamente proliferativas são mais suscetíveis a danos no DNA induzidos por radiação, os embriões de peixe-zebra são um modelo in vivo de linha de frente na pesquisa de radiação. Além disso, esse modelo projeta o efeito da radiação e de diferentes fármacos em um curto espaço de tempo, juntamente com os principais eventos biológicos e respostas associadas. Vários estudos sobre câncer têm utilizado peixe-zebra, e este protocolo é baseado no uso de modificadores de radiação no contexto da radioterapia e do câncer. Este método pode ser facilmente utilizado para validar os efeitos de diferentes fármacos em embriões irradiados e controles (não irradiados), identificando fármacos como radiossensibilizadores ou protetores. Embora essa metodologia seja usada na maioria dos experimentos de triagem de drogas, os detalhes do experimento e a avaliação da toxicidade com o histórico de exposição à radiação de raios X são limitados ou abordados apenas brevemente, dificultando sua execução. Este protocolo aborda essa questão e discute o procedimento e a avaliação da toxicidade com uma ilustração detalhada. O procedimento descreve uma abordagem simples para o uso de embriões de peixe-zebra para estudos de radiação e triagem de drogas baseadas em radiação com muita confiabilidade e reprodutibilidade.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal bem conhecido que tem sido amplamente utilizado em pesquisas nas últimas 3 décadas. É um pequeno peixe de água doce que é fácil de criar e reproduzir em condições de laboratório. O zebrafish tem sido extensivamente utilizado para diversos estudos de desenvolvimento e toxicológicos 1,2,3,4,5,6,7,8. O zebrafish tem alta fecundidade e curta geração embrionária; Os embriões são adequados para rastrear diferentes estágios de desenvolvimento, são visualmente transparentes e são passíveis de variedades de manipulação genética e plataformas de triagem de alto rendimento 9,10,11,12,13,14. Além disso, o zebrafish fornece imagens in toto e ao vivo para as quais seu processo de desenvolvimento e diferentes deformidades na presença de várias substâncias ou fatores tóxicos podem ser facilmente estudados usando microscopia estéreo ou fluorescente 7,15,16.

A radioterapia é uma das principais modalidades terapêuticas utilizadas no tratamento do câncer 17,18,19,20,21,22,23,24. No entanto, a radioterapia do câncer exige potenciais radioprotetores para proteger as células normais saudáveis da morte enquanto matam células malignas ou salvaguardar a saúde humana durante a terapia envolvendo radiações de alta energia 25,26,27,28,29. Por outro lado, radiossensibilizadores potentes também estão sendo investigados para aumentar a eficiência da radiação em matar células malignas, especialmente em terapias direcionadas e de precisão30,31,32,33. Portanto, para validar radioprotetores e sensibilizadores potentes, um modelo adequado para triagem de drogas de nível semi-alto e exibindo efeitos de radiação de forma mensurável é altamente solicitado. Vários modelos disponíveis são usados em estudos de radiação e envolvidos em experimentos de triagem de drogas. No entanto, vertebrados superiores e até mesmo o modelo in vivo mais comumente usado, camundongos, são inadequados para triagem de drogas em larga escala porque é demorado, caro e desafiador projetar tais experimentos de triagem com esses modelos. Da mesma forma, modelos de cultura celular são ideais para variedades de experimentos de triagem de drogas de alto rendimento34,35. No entanto, experimentos envolvendo cultura celular nem sempre são pragmáticos, altamente reprodutíveis ou confiáveis, pois as células em cultura podem mudar marcadamente seu comportamento de acordo com as condições de crescimento e cinética. Além disso, variedades de tipos celulares apresentam sensibilização diferencial à radiação. Notadamente, os sistemas de cultura de células 2D e 3D não representam todo o cenário do organismo e, portanto, os resultados obtidos podem não recapitular o real nível de radiotoxicidade36,37. Nesse sentido, o zebrafish oferece diversas vantagens na triagem de novos radiossensibilizadores e radioprotetores. A facilidade de manuseio, o grande tamanho da ninhada, a curta vida útil, o rápido desenvolvimento embrionário, a transparência do embrião e o pequeno tamanho do corpo tornam o peixe-zebra um modelo adequado para triagem de drogas em larga escala. Devido às vantagens acima, os experimentos podem ser prontamente repetidos em um curto espaço de tempo, e o efeito pode ser observado facilmente sob um microscópio dissecante em placas de poços múltiplos. Assim, o peixe-zebra vem ganhando popularidade em pesquisas de triagem de drogas envolvendo estudos de radiação38,39.

O potencial do zebrafish como modelo de triagem de modificadores de radiação tem sido demonstrado em vários estudos 40,41,42,43,44,45. O efeito radioprotetor de potenciais modificadores de rádio, como a nanopartícula DF1, amifostina (WR-2721), proteínas de reparo de DNA KU80 e ATM, e células-tronco hematopoéticas transplantadas, e os efeitos de radiossensibilizadores, como flavopiridol e AG1478, no modelo de zebrafishtêm sido relatados 19,41,42,43,44,45,46 . Usando o mesmo sistema, o efeito radioprotetor da DF-1 (nanopartícula de fulereno) foi avaliado em nível sistêmico e órgão-específico, e também o uso de embriões de peixe-zebra para triagem de radioprotetores foi mais explorado47. Recentemente, o mel de Kelulut foi relatado como um radioprotetor em embriões de peixe-zebra e foi encontrado para aumentar a sobrevivência embrionária e prevenir danos órgão-específicos, danos ao DNA celular e apoptose48.

Da mesma forma, os efeitos radioprotetores dos polímeros gerados pela reação de Hantzsch foram verificados em embriões de peixe-zebra em uma triagem de alto rendimento, e a proteção foi conferida principalmente pela proteção das células contra danos ao DNA49. Em um dos estudos anteriores, a estatina lipofílica fluvastatina foi encontrada como um potencial radiossensibilizador usando o modelo zebrafish com esta abordagem50. Da mesma forma, as nanopartículas de ouro são consideradas um radiossensibilizador ideal e têm sido utilizadas em muitosestudos51,52.

O desenvolvimento embrionário em peixe-zebra envolve clivagem nas 3 h iniciais em que um zigoto unicelular se divide para formar 2 células, 4 células, 8 células, 16 células, 32 células e 64 células que são facilmente identificadas com um estereomicroscópio. Em seguida, atinge o estágio de blástula com 128 células (2,25 h pós-fecundação, hpf), onde as células dobram a cada 15 min e passam pelas seguintes etapas: 256 células (2,5 hpf), 512 células (2,75 hpf), e atingindo 1.000+ células em apenas 3 h (Figura 1). Às 4 h, o ovo atinge o estágio esférico, seguido da formação de uma forma de cúpula na massa embrionária 7,53,54. A gastrulação em peixe-zebra começa a partir de 5,25 hpf54, onde atinge o estágio de escudo. O escudo indica claramente o rápido movimento de convergência das células para um lado do anel germinativo (Figura 1) e é uma fase proeminente e distinta de embriões gastrulantes que pode ser facilmente identificada53,54. Embora a exposição à radiação em embriões possa ser feita em qualquer estágio de seu desenvolvimento, a exposição à radiação durante a gastrulação pode ter alterações morfológicas mais distintas, facilitando uma melhor leitura das toxicidades induzidas pela radiação55; Da mesma forma, a administração de fármacos em embriões pode ser iniciada já a partir de 2HPF54.

Protocolo

O presente estudo foi conduzido com aprovação prévia e seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Ética Animal do Instituto de Ciências da Vida de Bhubaneswar. Todas as manutenções e reproduções de zebrafish foram conduzidas em uma instalação de piscicultura ambiente a 28,5 °C, e os embriões foram mantidos em uma incubadora de demanda biológica de oxigênio (DBO) a uma temperatura de 28,5 °C. Neste caso, foi utilizada a linhagem AB do zebrafish, e o estadiamento foi realizado de acordo com Kimmel et al.54. A radiação de raios X foi administrada a 6 hpf (estágio de escudo), e diferentes fenótipos foram observados até 120 hpf.

1. Melhoramento genético e coleta de embriões

  1. Definir os tanques de reprodução (compostos de policarbonato, capacidade 1 L, ver Tabela de Materiais). Despeje água do sistema (pH, 6,8-7,5; condutividade, 500 μS; e temperatura, 28,5 °C) nos tanques de reprodução cobrindo quase 40% de seu volume. Coloque a divisória no tanque para criar duas câmaras, uma para fêmeas e outra para machos.
  2. Dos tanques parentais, colete cuidadosamente duas fêmeas saudáveis e um macho saudável com a ajuda de uma rede, coloque-os em suas respectivas metades e mantenha-os no escuro durante a noite (mínimo de 10 h) a 28,5 °C.
  3. Na manhã seguinte, remova o divisor e permita que os peixes acasalem sem perturbar os tanques de reprodução.
    NOTA: As fêmeas começarão a desovar e os ovos serão vistos deitados no fundo do tanque dentro de 10-15 minutos após os peixes acasalarem56,57,58.
  4. Devolver os peixes aos tanques após a desova, coletar os embriões do tanque de reprodução com filtro de filtro, lavá-los adequadamente com água do sistema e manter os ovos coletados em placa de Petri com meio E-3 (4,94 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,43 mM de CaCl 2, 0,85 mM de sais de MgCl2, 1% p/v de azul de metileno, ver Tabela de Materiais).
  5. Observar os ovos em microscópio dissecante, remover os embriões não fertilizados ou mortos com pipeta de Pasteur e manter as placas de Petri contendo ovos fertilizados em meio E-3 a 28,5 °C em incubadora para seu adequado crescimento e manutenção.
    NOTA: Os ovos não fertilizados podem ser identificados com uma aparência branca leitosa com um córion coagulado ou com células rompidas dentro do córion. Juntamente com os óvulos não fertilizados, ovos que não sofreram clivagem e ovos com deformidades como irregularidades durante a clivagem, por exemplo, assimetria, formação de vesículas ou lesões do córion, ou não se desenvolvendo ativamente, devem ser descartados para manter os embriões coletados saudáveis e limpos 7,56.

2. Monitoramento de embriões e seleção para experimentos de radiação

  1. Monitorar os embriões em crescimento sob o microscópio dissecante, identificar o estágio adequado 7,54 e remover os embriões mortos ou insalubres. Garantir o estadiamento embrionário adequado, pois as doses de radiação e drogas serão administradas em um estágio específico de gastrulação.
    OBS: Todos os dias, verifique o nível e a qualidade da mídia nos pratos de cultura. Troque o meio a cada 24 h, além de remover embriões mortos. As pipetas de Pasteur são preferidas para serem usadas para a colheita de embriões ou troca de meios.
  2. Antes de iniciar o experimento, distribua cuidadosamente os embriões saudáveis nas placas experimentais com a ajuda de uma pipeta de Pasteur. Para cada grupo experimental, tomar 15-20 embriões.
    OBS: Coloque na placa experimental apenas embriões sadios dos estágios de desenvolvimento desejados. Suponha que o tratamento medicamentoso tenha que ser feito com embriões a 6 hpf, em seguida, começar a semeá-los em placas experimentais pelo menos 30-60 minutos antes.

3. Tratamento medicamentoso

  1. Adicione drogas da concentração desejada aos embriões de peixe-zebra. Prepare o meio E-3 contendo o medicamento com bastante antecedência. Certifique-se de que a solução estoque da droga não tem nenhuma droga não dissolvida antes de preparar o meio de trabalho para tratar embriões de peixe-zebra.
  2. Antes de adicionar qualquer droga a um meio para triagem de radiação, verifique o efeito citotóxico da droga com os graus de concentrações da droga. Seguir as diretrizes da OCDE para avaliar a LC 50 dos medicamentos sob avaliação 59,60,61.
    NOTA: Tenha cuidado ao mover as placas e pratos durante o tempo de irradiação ou observação. Há muitas chances de que as placas sejam perturbadas durante esse manuseio, fazendo com que o meio vaze para fora dos poços ou os embriões vazem de seus respectivos poços, potencialmente contaminando poços próximos e arruinando o experimento.

4. Irradiação de raios X

  1. Ao montar um experimento de radiação, inclua um grupo controle/não irradiado e um grupo somente de radiação. Da mesma forma, ao realizar uma triagem de drogas, inclua outro grupo onde as drogas serão administradas com a mesma concentração que as administradas no experimento de triagem juntamente com a radiação.
    OBS: Rotule tanto a tampa quanto a base de pratos de poço ou pratos de cultura para que as tampas não fiquem extraviadas.
  2. Distribuir os embriões em uma placa de poço se os escudos de radiação puderem cobrir e proteger os poços extras da radiação enquanto os outros poços são expostos a uma dose de radiação específica; caso contrário, use placas ou discos individuais para semear os embriões por dose de radiação.
  3. Ligue a máquina irradiadora de raios X (consulte Tabela de Materiais) e inicie a inicialização e o aquecimento da máquina.
    NOTA: O valor da distância entre a origem e o assunto (SSD) deve ser de 50 cm; pode-se usar diferentes SSDs mais uma vez, o que requer padronização.
  4. Coloque a placa experimental sob o irradiador dentro da máquina no centro, garantindo que a placa esteja diretamente abaixo da fonte de raios X, e então ajuste a dose (por exemplo, 5 GY) e inicie o raio-X.
    OBS: Selar as placas com filme de parafina para evitar qualquer derramamento indesejado ou contaminação durante o transporte das placas da incubadora para o irradiador e vice-versa.
  5. Após a conclusão da irradiação, retire as placas, desligue o programa da máquina, desligue a máquina e verifique as placas sob o microscópio imediatamente após a radiação. Remover os embriões mortos e devolver as placas à incubadora a 28,5 °C. Registrar o número de embriões mortos após avaliá-los ao microscópio dissecante.
    NOTA: Irradiar os diferentes grupos de embriões com doses de radiação designadas sem muito atraso entre grupos individuais, pois o efeito da radiação pode ser significativamente afetado pela diferença no estágio de desenvolvimento.
    CUIDADO: Ao operar o aparelho de raios-X, tome as medidas de proteção adequadas.

5. Coleta, imagem e análise de dados

  1. Coletar dados em intervalos de tempo pré-determinados, como a cada 24 h após a radiação ser administrada. Registrar todas as observações possíveis, como sobrevivência, eficiência de eclosão, estágio de desenvolvimento, contagem de batimentos cardíacos, curvatura do corpo e da cauda, edema pericárdico, extensão do saco vitelino, microcefalia, desenvolvimento da bexiga natatória, motilidade ou atividade geral, etc.62,63,64.
  2. Para capturar imagens, escolha embriões representativos em uma lâmina limpa, verifique os embriões ao microscópio, oriente-os em uma direção específica e clique nas imagens. Renomeie os arquivos de imagem de acordo com o grupo e a hora.
    NOTA: A mesma ampliação e iluminação devem ser usadas durante a captura de imagens em intervalos de tempo diferentes.

Resultados

O layout geral do protocolo está representado na Figura 2. O efeito da radiação e a caracterização de forma dose-dependente foram avaliados com as seguintes análises.

Avaliação da toxicidade induzida por raios X
Com o uso de estereomicroscópio, as seguintes anormalidades foram avaliadas e caracterizadas após o tratamento medicamentoso e/ou radiação. De acordo com as diretrizes da OCDE 61, para avaliação da toxicid...

Discussão

Zebrafish são usados como modelos valiosos em muitos estudos, incluindo vários tipos de pesquisa de câncer. Esse modelo fornece uma plataforma útil para a triagem de drogas em larga escala67,68. Como qualquer outro método de avaliação de toxicidade, a avaliação quantitativa das principais alterações biológicas decorrentes da radiação e/ou tratamento medicamentoso é a parte mais crucial deste protocolo. Nesses tipos de estudos, a sobrevida não deve...

Divulgações

Os autores declararam não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

O laboratório da SS e o laboratório da RKS são financiados por subsídios da DBT e da SERB, Índia. A APM recebeu a bolsa ICMR, Governo da Índia. DP é um beneficiário da bolsa CSIR, Governo da Índia. A ONU recebeu a bolsa DST-Inspire, do Governo da Índia. A Figura 2 foi gerada usando Biorender (https://biorender.com).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
6 Well platesCorningCLS3335Polystyrene
B.O.D IncubatorOswaldJRIC-10
Calcium ChlorideFisher Scientific10101-41-4
Dissecting MicroscopeZeissStemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTEPolycarbonate
Glass petriplatesBorosil3165A75Glass
GraphpadPrismGraphPad Software, Inc.Version 5.01
Kline concavity slidesHimediaGW092-1PKGlass
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM8266
Methylene blue hydrateSigma-Aldrich66720-100G
ParafilmTarsons380020Paraffin film
Pasteur pipettesHimediaPW1212-1X500NOPolyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTIPolycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTDPolycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding TankTecniplastZB10BTLPolycarbonate
Potassium ChlorideSigma-AldrichP5655
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653-5KG
Sodium hydroxide pelletSRL1949181
Stereo Microscope Leica M205FALeicaModel/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-RayPrecision X-RayX-RAD 225XL

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