模型线虫秀丽隐杆线虫天然微生物群的分离和表征

摘要

秀丽隐杆线虫 是生物学中的主要模式物种之一，但几乎所有的研究都是在没有其天然相关微生物的情况下进行的。这里描述的方法将有助于提高我们对相关微生物多样性的理解，作为未来 功能性秀丽隐杆线虫 研究的基础。

摘要

线虫秀 丽隐杆线虫 与自然界中各种各样的微生物相互作用。一般来说， 秀丽隐杆线虫 常见于腐烂的植物物质中，尤其是苹果或堆肥堆等腐烂的水果。它还与某些无脊椎动物宿主有关，如蛞蝓和木虱。这些栖息地富含微生物，这些微生物是 秀丽隐杆 线虫的食物，也可以持续地定植线虫肠道。迄今为止，原生 秀丽隐杆线虫 微生物群在栖息地和地理位置上的确切多样性和一致性尚不完全清楚。在这里，我们描述了一种从自然界中分离秀 丽隐杆线 虫并表征蠕虫微生物群的合适方法。线虫可以很容易地从堆肥材料、腐烂的苹果、蛞蝓中分离出来，或者通过将苹果放在堆肥堆上来吸引线虫。在北半球发现 秀丽隐杆线虫 的黄金时间是 9 月至 11 月。通过将底物浸入缓冲溶液中，可以将蠕虫从收集的底物材料中洗掉，然后收集线虫并将其转移到线虫生长培养基或PCR缓冲液上以进行后续分析。我们进一步说明了如何使用样品来分离和纯化蠕虫相关微生物，并处理蠕虫以进行微生物群落组成的16S核糖体RNA分析。总体而言，所描述的方法可能会激发对跨栖息地和地理位置的秀 丽隐杆 线虫微生物群特征的新研究，从而有助于全面了解线虫微生物群的多样性和稳定性，作为未来功能研究的基础。

引言

在自然界中，秀丽隐杆线虫常见于腐烂的植物物质中，尤其是苹果等腐烂的水果或堆肥堆^1。它还与某些无脊椎动物宿主有关，例如蛞蝓和木虱^2，3。这些栖息地富含微生物，它们不仅可以作为蠕虫的食物，还可以与蠕虫形成稳定的联系。关于天然伴生微生物多样性的信息仅在2016年发布4，^5，6。从那时起，这些和最近的一些研究表明，秀丽隐杆线虫与多种细菌和真菌有关，最常见的包括假单胞菌属、肠杆菌、赭石杆菌、欧文氏菌、Comamonas、葡萄糖酸杆菌和其他几种细菌⁶，^7，8。几种相关的细菌可以稳定地定植在蠕虫肠道中，尽管不是全部⁶，⁹，¹⁰，^11，12。它们可能对我们对秀丽隐杆线虫生物学的理解至关重要，因为它们可以提供营养，防止病原体和可能的其他压力源，并影响中心生活史特征，如繁殖率、发育或行为反应。

例如，假单胞菌属、赭石属以及肠杆菌或葡萄糖酸杆菌属的天然相关分离株可以以^{不同的方式保护}蠕虫免受病原体感染和杀戮5，^6，11，^13，14。Comamonas属的特定分离株影响线虫的饮食反应，发育，寿命和生育能力¹⁵，^16，17。普罗维登西亚细菌产生神经调节剂酪胺，从而调节宿主神经系统活动和由此产生的行为反应¹⁸。一组不同的天然相关细菌被证明会影响人口增长率，生育率和行为反应⁵，⁶，⁹，^11，19。

迄今为止，原生秀丽隐杆线虫微生物群在栖息地和地理位置上的确切多样性和一致性尚未完全了解，蠕虫与其环境中的微生物之间的进一步关联仍有待发现。之前的几项研究使用了从某些土壤环境、秀丽隐杆线虫天然栖息地或中生虫实验（即重建自然栖息地的实验室环境）中分离的细菌菌株，秀丽隐杆线虫实验室菌株⁴，^5，20。尽管这些研究对微生物对特定线虫性状（例如线虫代谢²¹）的影响有了新的见解，但这些相互作用与自然界秀丽隐杆线虫生物学的相关性尚不清楚。因此，本手稿描述了从自然界中直接分离秀丽隐杆线虫的方法，以及从单个蠕虫和蠕虫群中分离并随后表征天然相关微生物的方法。所描述的方法是以前用于分离和表征天然秀丽隐杆线虫及其天然微生物群^的程序的更新和改进版本2，^6，7。考虑到秀丽隐杆线虫广泛存在于全球分解植物物质中（特别是在腐烂的水果、温带地区和秋季）¹，²，22，23，^24，25，只要有兴趣与秀丽隐杆线虫相关，任何实验室都可以应用该协议 自然相关微生物的特征，因此具有更自然的相关背景。后者对于充分了解线虫的生物学至关重要，因为从其他宿主系统的多样性中得知，相关的微生物群可以影响不同的生活史特征²⁶，这一方面目前在几乎所有生命科学学科的众多秀丽隐杆线虫研究中在很大程度上被忽视。

研究方案

1. 缓冲液和培养基的制备

1. 通过将5.85gNaCl，1.123gK 2 HPO 4，5.926gKH 2 PO₄和1L去离子H₂O加入烧瓶中并在121°C高压灭菌20分钟来制备S缓冲液。
2. 通过添加含有 1.2% （w/v） 羟甲基纤维素（引起培养基粘度的物质）、5 mg/mL 胆固醇、1 mM MgSO₄、1 mM CaCl₂ 和 0.1% （v/v） 丙酮的 S 缓冲液来制备粘性培养基。高压灭菌并搅拌粘性介质，直到其完全均匀。
   注意:这可能需要数小时。此外，S缓冲液可以直接制备并添加到粘性介质中，而无需事先灭菌。
3. 通过将 3 g KH 2 PO 4、6 g NA 2 HPO₄·2 H 2 O、5 g NaCl 和 1 L 去离子 H₂O 加入 1 L 烧瓶来制备 M9 缓冲液。高压灭菌溶液，冷却后，加入1 mL的1 M MgSO₄（123.24 g MgSO₄·7H 2 O在500 mL去离子H₂O中，过滤灭菌）。
4. 通过将 5 mL Triton X-100 与 45 mL M9 缓冲液混合，制备 10% （v/v） Triton X-100 储备溶液。使用0.2μm过滤器对溶液进行过滤灭菌。
5. 高压灭菌后，将 2.5 mL 的 10% （v/v） Triton X-100 储备溶液加入 1 L M9 缓冲液中，用 Triton X-100 （M9-T） 制备 M9 缓冲液，以获得 0.025% （v/v） M9-T。
6. 通过在 50 mL 管中混合 15 mL 无菌 100% 甘油和 35 mL 无菌 S 缓冲液，在 S 缓冲液中制备 30% （v/v） 甘油。

2. 环境样品的制备（图1）

1. 收集堆肥或腐烂水果等环境样本，并将每个样本放入单独的塑料袋、管子或其他干净的容器中。
   注意:为了吸引线虫，可以在取样前几周将苹果放在堆肥上。
2. 将环境样品的碎片均匀地铺在空的无菌9厘米培养皿中。
   注意:具有较高衰变水平的样品更可能含有 秀丽隐杆线虫。 可选地，可以使用填充有无蛋白胨琼脂培养基（PFM）的培养皿来增加对比度。
3. 用大约 20 mL 无菌粘性培养基小心地覆盖样品。
   注意:线虫在1-2小时内漂浮到表面。粘性介质减慢蠕虫的运动速度，使其更容易采样。无菌M9缓冲液可以用作替代方案，但是，蠕虫的移动速度会更快。

图 1:从底物中分离线虫。 将底物样品放置在空的培养皿中，并用粘性介质覆盖以冲洗出线虫。线虫被转移到M9-T并反复洗涤以去除外部细菌。单个线虫可用于DNA分离，相关细菌的分离，或放置在琼脂平板上以培养蠕虫种群。用 BioRender.com 创建的图。 请点击此处查看此图的大图。

3. 线虫盲 肠 炎的分离（图1）

1. 使用解剖显微镜搜索线虫，按照Barrière和Félix²⁷在WormBook章节中关于分离秀丽隐杆线虫和相关线虫的指南。
   注意:雌雄同体/雌性 Caenorhabditis 具有浅棕色的肠道（在透射照明下）。此外，肠道细胞具有大的细胞核，可见为白点。相比之下，其他线虫物种通常具有深棕色的肠道，并且可能在色素强度上显示出前后不对称，并且通常没有可见的细胞核。雌雄同体/雌性成年 Caenorhabditis 的外阴位于动物的中间。这种外阴定位并不总是由其他线虫类群显示。线虫具有两个咽球，它们在足够的放大倍率和透射照明下都可见，并与许多其他 线 虫类群形成对比。 Caenorhabditis 线虫有一个尖的尾巴，而其他一些线虫有一个圆形的尾巴。
2. 使用 20-100 μL 移液管在解剖显微镜下以尽可能少的液体收集线虫。将收集的线虫直接转移到无菌3cm培养皿中的1-3mL无菌M9-T中，以洗涤蠕虫以去除未附着的微生物（步骤3.3），或者，将单个蠕虫转移到带有线虫生长培养基（NGM）的平板上以建立蠕虫种群（步骤3.4）。
3. 清洗线虫以去除线虫外部的微生物。
   注意:此协议富集肠道细菌，但不能完全消除粘附在蠕虫角质层上的细菌。
   1. 将线虫在M9-T中孵育10-15分钟。
   2. 将线虫在尽可能少的液体中移液到新的无菌 3 cm 培养皿中的 1-3 mL 新鲜 M9-T 中。
   3. 重复孵育并将线虫转移到新鲜的M9-T上两次。
      注意:可以对单个蠕虫或蠕虫群执行以下步骤。蠕虫现在可用于秀 丽隐杆线虫 和相关微生物的表征，以及细菌的分离（步骤4和5）。或者，可以将它们单独转移到NGM板上以建立蠕虫种群（步骤3.4）。
4. 要获得蠕虫种群，请将单个线虫移液到 NGM 平板上。
   注意:只有雌雄同体的线虫，如 秀丽隐杆线虫 或 C. briggsae ，才能从单个蠕虫中产生后代。然而，如果其他物种的单条蠕虫已经交配，它们仍然可能产生后代。
   1. 天然分离的线虫通常在肠道中含有细菌，它们会脱落到NGM平板上，这些细菌在那里生长并可作为 秀丽隐杆线虫的食物。不要添加单独的食物生物，如标准实验室食物有机体， 大肠杆菌 菌株OP50。
      注意:在盘子上饲养蠕虫会影响相关细菌群落的组成，但该成分仍可与天然 秀丽隐杆线虫 分离株^6，7的组成相当。
   2. 让线虫在适当的温度下增殖长达 10 天（例如，温带地区为 15-20 °C）。冷冻这些线虫（步骤3.5）或将它们用于秀 丽隐杆线虫 和相关微生物的表征以及微生物的分离（步骤4和5）。
5. 冷冻线虫以长期储存
   1. 将线虫留在盘子上，直到食物细菌消失，盘子上主要是小的幼虫阶段。在 1.5 mL 的 S 缓冲液中洗掉平板上的蠕虫。
   2. 将 500 μL 含蠕虫的 S 缓冲液与 500 μL 30% （v/v） 甘油在无菌 2 mL 管中的 S 缓冲液中彻底混合。立即将试管冷冻在-80°C以长期储存，否则甘油可能会伤害线虫。

4. 用于 秀丽隐杆线 虫和微生物分子鉴定的蠕虫的制备

1. 为了无偏差地鉴定线虫相关微生物，请准备一个 96 孔板，每孔包含三个无菌 1 mm 磁珠、19.5 μL PCR 缓冲液和 0.5 μL 蛋白酶 K （20 mg/mL）。将一个单独的、洗涤过的线虫移液到每个孔中，尽可能少地转移液体。
2. 也可以使用蠕虫种群。为此，用 M9 缓冲液从平板上洗涤蠕虫，并将 ~300 μL 含蠕虫的 M9 缓冲液转移到具有 10-15 个珠子的 2 mL 管中。
3. 使用磁珠均质器分解线虫（例如，在 30 Hz 下打珠 3 分钟）。短暂离心板或试管以使液体到达底部（例如，在室温 [RT] 下以 8000 x g 离心 10 秒）。
4. 秀丽隐杆线虫的鉴定
   1. 通过在PCR循环仪中在50°C下加热样品1小时，在95°C下加热15分钟来分离单个线虫的DNA。 使用任何选择的分离方法（使用商业试剂盒^7，9的不同分离方法的示例方案）分离蠕虫种群的DNA。将DNA冷冻在-20°C以长期储存。
   2. 为了鉴定秀丽隐杆线虫，请按照所选Taq供应商的说明，在PCR中使用DNA和引物对nlp30-F（表1，5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3'）和nlp30-R（表1，5'-TACTTTCCCATCCGTATC-3'）。
   3. 使用以下PCR条件:在95°C下初始变性步骤2分钟，然后在95°C下进行35个循环，持续45秒，55°C持续30秒，72°C持续1分钟，并在72°C下进行最后伸长步骤5分钟。 秀 丽隐杆线虫 产生154 bp PCR产物。
5. 使用分离的 DNA 通过 V3-V4 区域的 16S 扩增子测序 表征 线虫相关细菌。
   1. 使用所选的16S引物制备16S文库，并遵循文库制备试剂盒方案。一种选择是使用覆盖16S rRNA基因V3-V4区域的引物341F（表1，5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和806R（表1，5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'），从而产生可以用标准数据库分类的序列，具有良好的分辨率⁷。
      注意:在此步骤中，起始DNA的量至关重要。从单个蠕虫获得的DNA将比从蠕虫种群获得的DNA少得多。对于单个蠕虫，可能需要增加输入DNA的数量或增加PCR循环的数量⁷。
   2. 可以使用合适的测序试剂盒在测序平台上对文库进行测序。
      注意:在这里，MiSeq平台与合适的MiSeq试剂盒一起使用。试剂不断改进，应选择最新标准。

5. 线虫相关细菌的分离和培养（图2）

1. 为了分离细菌，准备一个 96 孔板，其中包含三个无菌 1 mm 磁珠，每孔 20 μL M9 缓冲液，并将单独的、洗涤过的线虫移液到每个孔中，转移尽可能少的液体。
   注意:或者，可以用 M9 缓冲液从平板上洗除蠕虫群，并且可以将 ~300 μL 含蠕虫的 M9 缓冲液转移到具有 10-15 个珠子的 2 mL 管中。在所有情况下，蠕虫应来自使用步骤4.1-4.4确定为 秀丽隐杆线虫 的培养物。
2. 使用磁珠均质器分解线虫（例如，在 30 Hz 下打珠 3 分钟）。短暂离心板或试管以使液体到达底部（例如，在室温下以8000 x g 10秒）。
   注意:这种方法的使用导致细菌分类群的分离类似于16S rDNA扩增子测序⁷揭示的细菌分类群，这表明所描述的珠子跳动使大多数细菌细胞完好无损。
3. 收集上清液，以 1:10 连续稀释，并将高达 100 μL 的琼脂平板接种到 9 cm 琼脂平板上。
   1. 为确保大多数细菌可以培养，请使用具有不同营养成分的各种替代培养基，包括稀释的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA，1:10稀释），麦康凯琼脂，Sabouraud葡萄糖琼脂，马铃薯葡萄糖琼脂或酵母蛋白胨葡萄糖琼脂。
4. 在采样位置的平均温度条件下孵育板（例如，温带位置的温度在15-20°C之间）24-48小时。
5. 使用标准的三条纹技术和无菌环获得纯细菌培养物（图2）。
   1. 使用无菌环或牙签从平板中挑选单个菌落，并将其划到含有与纯化相同的琼脂培养基的新琼脂平板上。确保只使用大约 1/3 的盘子。
   2. 要么使用新的无菌环，要么对可重复使用的环进行消毒，然后将其拖过第一条条纹，以在同一板的另一 1/3 上形成第二条条纹。
   3. 通过拖动无菌环穿过第二条条纹来重复此步骤。
   4. 在用于分离的相同生长条件下孵育板。这种技术必须导致单个菌落在第三条纹区域生长。
      注意:可能需要多次重复纯化步骤，因为天然分离物倾向于形成生物膜和/或聚集体。
6. 使用与上述相同的温度和生长时间在液体培养基（与琼脂培养基相同类型）中培养纯菌落（步骤5.4）
7. 通过将 300 μL 细菌培养物添加到 200 μL 86% （v/v） 甘油（在相应的生长培养基中，例如 TSB 中）并上下移液以适当混合来制备细菌原液。或者，通过将 50 μL 细菌培养物与 50 μL 7% （v/v） DMSO 混合来制备 DMSO 储备液。在-80°C冷冻以长期储存。
8. 使用完整的 16S 核糖体 RNA 基因测序表征细菌
   1. 使用合适的技术（例如，DNA提取试剂盒;根据经验，基于CTAB的提取方案效果很好）从纯液体培养物中提取细菌^DNA22）。
   2. 使用引物27F（表1，5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1495R（表1，5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3'）28和以下PCR条件扩增16S rRNA基因:95°C，2分钟，^22x（95°C，30秒;55°C，30秒;72°C，100秒），并在72°C下延长5分钟。
   3. 为了获得完整的序列，另外使用两个内部测序引物，例如701F（表1，5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3'）和785R（表1，5'-GGATTAGATACCCTGTGTCC-3'）⁶。

图2:单个细菌的物种鉴定和分离。 使用磁珠均质器分解单个线虫，并通过PCR或测序 分离 DNA以进行物种测定。或者，将破碎的线虫材料连续稀释并铺在生长培养基板上。将板孵育直到出现细菌菌落，并将单个菌落划到新平板上以获得纯培养物。纯培养物的单个菌落用于培养液体细菌培养物，以制备细菌储备物以在-80°C下长期储存。 用 BioRender.com 创建的图。 请点击此处查看此图的大图。

结果

线虫秀丽隐杆线虫经常出现在分解的水果中，例如苹果，以及堆肥样本。在德国北部，秀丽隐杆线虫以及同类物种（特别是C. remanei，但也包括C. briggsae）主要在9月至^11月2日发现。线虫最常见于分解植物物质，尤其是苹果或梨等腐烂的水果，以及堆肥，特别是显示出高分解等级的材料。水果和堆肥样品可以带入实验室（图3A，

讨论

线虫秀丽隐杆线虫是生物学研究中研究最深入的模式生物之一。它是由悉尼·布伦纳（Sydney Brenner）在1960年代引入的，最初是为了了解神经系统的发展和功能²⁹。从那时起，秀丽隐杆线虫已成为研究所有生物学科基本过程的强大模型，包括行为生物学、神经生物学、衰老、进化生物学、细胞生物学、发育生物学和免疫学。它的成功基于优势特性的独特组合，包括大约...

材料

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