使用显微计算机断层扫描评估骨折愈合

摘要

显微计算机断层扫描（μCT）是一种无损成像工具，有助于评估临床前研究中的骨结构，但对用于分析骨愈合愈伤组织的μCT程序缺乏共识。本研究提供了一种循序渐进的μCT方案，可以监测骨折愈合。

摘要

显微计算机断层扫描 （μCT） 是转化科学研究中表征骨折愈合过程中骨骼和新形成骨骼三维 （3D） 形态的最常见成像方式。啮齿动物长骨折愈合的研究通常涉及二次愈合和矿化愈伤组织的形成。形成的愈伤组织的形状和新形成的骨的密度可能在时间点和治疗之间有很大差异。虽然量化完整皮质和小梁骨参数的标准方法被广泛使用并嵌入到市售软件中，但对分析愈合愈伤组织的程序缺乏共识。这项工作的目的是描述一种标准化方案，该方案定量愈合愈伤组织中的骨体积分数和愈伤组织矿物质密度。该协议描述了成像和分析过程中应考虑的不同参数，包括成像过程中的样品对齐、目标体积的大小以及轮廓化以定义愈伤组织的切片数量。

引言

显微计算机断层扫描（μCT）成像已广泛用于临床前骨骼研究，提供无创、高分辨率的图像来评估骨骼的微观结构1,2,3,4,5。μCT涉及大量X射线图像，这些图像来自旋转样品或使用旋转的X射线源和检测器获得。算法用于以图像切片堆栈的形式重建 3D 体积数据。临床CT是人体骨骼3D成像的金标准，μCT是评估实验动物骨愈合效率的常用技术1,2,3,4,6,7。矿化骨与X射线具有极好的对比度，而软组织的对比度相对较差，除非使用造影剂。在骨折愈合评估中，μCT生成的图像提供有关矿化愈伤组织3D结构和密度的详细信息。体内μCT扫描也可用于骨折愈合的纵向、时程评估。

使用μCT对完整皮质和小梁骨的定量通常是成熟和标准化的⁸。尽管临床前研究使用各种定量方法来分析^{骨折愈合9,10,11，}但用于愈伤组织定量的μCT图像分析的详细方案尚未发表。因此，本研究的目的是为骨愈合愈伤组织的μCT成像和分析提供详细的分步方案。

研究方案

开发以下协议以表征从安乐死小鼠收获的长骨愈合愈伤组织。然而，大多数步骤可以应用于大鼠，也可用于骨折骨的 体内 扫描。该协议描述了特定的μCT系统和特定的图像处理、分析和可视化软件（参见 材料表），但该方法通常适用于其他扫描仪和软件。该协议已获得宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。本研究中使用的小鼠是16周龄的雄性C57BL / 6J小鼠（平均体重31.45±3.2g）。

1. 组织采集和保存

注意:使用合适的鼠骨折模型。在这项研究中，根据^12,13中描述的标准方案使用骨干中开放性胫骨骨折模型。

1. 在骨折模型实验结束时，通过腹膜内注射氯胺酮或甲苯噻嗪（分别为500mg / kg或50mg / kg）对小鼠实施安乐死。
2. 使用剪刀，在不干扰骨折部位的情况下，将骨折的骨从股骨中部收集到胫距关节。在随后的处理步骤中，去除骨骼周围的肌肉，仅留下与骨骼直接接触的软组织，以支持骨折部位。使用微蚊直止血钳取出髓内针。
3. 将样品保存在4°C的福尔马林或-20°C的盐水中。 保存载体的选择取决于μCT下游的预期应用。在这项研究中，样品保存在-20°C的盐水中。

2. 微CT扫描

1. 样品制备
   1. 要同时扫描多个样品，请将多达六个样品放入定制开发的3D打印扫描夹具（图1 A，B）或类似夹具中。同时扫描可减少扫描时间和成本。本研究中使用的定制夹具包含六个用于固定长骨样品的插槽和一个用于羟基磷灰石 （HA） 模型的中心孔（图 1A，B;目录）。
      注意:HA模型将作为步骤4.2（见下文）中的标准，将μCT单位（通常是Hounsfield）转换为HA密度（mgHA / ccm）。
   2. 将准备好的夹具放在与视野直径相似的注射器或锥形管中（FOV; 图 1C）。在这项研究中，使用20毫米注射器来匹配21.5毫米的视野。
   3. 为防止样品在扫描过程中变干，请用步骤1.3中使用的防腐剂填充注射器或规范管（本研究使用盐水）。
2. 扫描
   1. 在扫描之前，确认μCT机器已按如下方式校准:将HA模型放置在μCT FOV的中心线，扫描模型并测量HA的密度。确保测量的密度与制造商提供的密度一致。
   2. 将样品夹具中心线与μCT FOV的近似中心线对齐。这确保了样品在FOV内，并且它们的长轴的方向与结果图像的轴向方向大致一致。
      注意:这种标准化的方向以后可以帮助使分析过程不易发生变化，例如在感兴趣的体积内考虑的组织数量。
   3. 设置μCT系统的扫描参数（材料表）。本研究中使用的参数为 10.5 μm（各向同性体素大小）、55 kVp（能量/强度）、145 μA（电流）和 300 ms（积分时间）。根据小鼠小梁的近似厚度（20-60μm^）确定体素大小8。在不同视图中目视检查扫描，以确保它覆盖所有愈伤组织样本的整个体积。

图1:定制扫描夹具的结构。 （A） 扫描夹具（顶部）的图像，显示六个样品插槽和 HA 模型（底部）。（B） 显示放置在专用插槽中的长骨样本（顶部）和 HA 模型（底部）的图像。（C） 显示放置在20毫米注射器中的扫描夹具的图像。 请点击此处查看此图的大图。

3. 图像分割

注意:原始图像会自动重建为图像序列数据。

1. 图像转换:使用图像处理软件将重建的图像序列数据转换为DICOM图像序列（见 材料表）。将DICOM图像序列导入软件（参见 材料表）以进行图像处理、分析和可视化（图2A）。
2. 图像裁剪:一次一个样本，裁剪每个图像堆栈，并确保整个样本包含在裁剪的体积中（图2B）。按如下方式保存裁剪后的图像:单击屏幕左上角的" 文件 "选项卡，选择" 保存项目"，然后从屏幕上显示的选项中选择 "最小化项目大小 "。该文件将被保存在商业软件格式。
3. 图像去噪:使用过滤方法降低噪点水平并避免模糊，如下所示。
   1. 单击 文件 选项卡，然后选择要使用 开放数据处理的图像。打开的图像将显示在屏幕左上角的项目视图窗口中。
   2. 右键单击以选择 图像处理 ，然后选择 过滤沙盒。单击 创建。
   3. 在"属性"窗口（位于屏幕的左下角）中执行以下操作:选择" 数据 "作为预览类型;从过滤器旁边的下拉菜单中选择过滤器类型;选择 3D 进行解释;从内核类型旁边的下拉菜单中选择 可分离 ;在每个值旁边的可用空框中填写要用于标准偏差和内核大小因子的值;从输出旁边的下拉菜单中选择 与输入相同 ;单击 应用。
      注意:滤波器类型的选择（可用选项包括双边、箱形、高斯、中位数、递归指数、描绘、各向异性扩散、非局部均值、非锐化掩蔽和 FFT 滤波器）和参数取决于扫描图像的噪声水平和体素大小。对于高斯滤波器，3 x 3 x 3 和 5 x 5 x 5 是内核大小因子的常用值，0.5-2.0 通常用于标准偏差⁸。本研究采用高斯滤波，核尺寸因子和标准差分别使用5 x 5 x 5和0.8。
4. 图像重新对齐
   注意:这是一个可选步骤。当长骨样品在扫描过程中相对于成像系统的坐标轴发生错位时，可以应用数字对准方法来纠正错位（图2C）。
   1. 创建示例的 3D 渲染图像，如下所示。在项目视图窗口中，选择经过筛选的裁剪图像（在步骤 3.3 中创建）。右键单击以选择 显示 然后 体积渲染 从下拉菜单中，然后单击 创建.目视检查矢状面和额平面中的 3D 渲染图像。
   2. 手动旋转渲染体积以在纵轴上获得良好的对齐方式。按如下方式对旋转的图像应用变换:在属性窗口中，单击变换编辑器，然后转到 变换编辑器操纵器并从下拉菜单中选择 变形器 。现在，样品可以旋转和重新对齐。重新对齐过程完成后，再次单击 变换编辑器 以锁定图像。
   3. 对过滤后的图像（在步骤 3.3 中创建）重新采样以创建新的横向（轴向）平面图像切片，如下所示:在项目视图窗口中，选择步骤 3.4.2 中的图像。右键单击以选择 几何 变换，然后从下拉菜单中选择 重新采样变换后的图像 ，然后单击 创建。在属性窗口中，转到 数据 并执行以下操作:对于插值，请从下拉菜单中选择 标准 ;对于模式，选择 扩展;对于保留，选择 体素大小;对于填充值，在可用空白框中输入零。然后单击 应用。
5. 定义感兴趣的数量 （VOI）
   1. 浏览横向图像切片并确定骨折愈伤组织的中心平面。根据愈伤组织的近端和远端定义 VOI。在愈伤组织末端难以定义的情况下，根据远离愈伤组织中心平面的标准化距离定义VOI（图2D）。
      注意:在骨重塑之前的愈合阶段，定义矿化愈伤组织的边缘很容易，因为新形成的编织骨的小梁结构与原始骨的皮质结构不同。然而，当随后的重塑阶段时，新形成的骨骼逐渐获得皮质结构;因此，定义愈伤组织边缘变得越来越具有挑战性。

图 2:图像分割 。 （A） 一次扫描中显示六个样本的图像。 （B） 图像裁剪以隔离单个样本。（C） 数字对齐以校正未对齐的纵轴（黄色虚线）。（D）VOI和愈伤组织中心平面的定义。 请点击此处查看此图的大图。

4. 图像分析

1. 骨痂和皮质骨的分割
   1. 使用带有自动描线和迹线边缘选项的分割套索工具（图 3A）半自动勾勒愈伤组织的外边界，如下所示:
      1. 重新组合转换后的图像（步骤 3.4.3），单击屏幕顶部第二个选项卡行中的" 分割 "选项卡。在分割编辑器窗口中，从图像旁边的下拉菜单中选择转换后的图像（在步骤 3.4.3 中创建）。
      2. 在"材料"窗口中，双击" 添加";这样，将显示名为"材料3"和"材料4"的两个选项卡。右键单击将材料 3 重命名为愈伤组织，将材料 4 重命名为皮质骨。
      3. 在选择窗口中，单击套索图标;从出现的选项中，为 2D 模式选择" 徒手" ，为 3D 模式选择" 内部 "，为选项选择" 自动描 摹"和 "描摹边 "。使用套索标记感兴趣的区域。
   2. 对整个VOI采样的切片重复此轮廓步骤（图3B）。轮廓切片可以间隔开（例如，由 20 个切片隔开）。
      注意:在愈伤组织结构复杂的区域中，用户可以考虑减小轮廓切片之间的间距以捕获更多片段（图3A，B）。
   3. 在轮廓愈伤组织轮廓上插值以创建完整的愈伤组织标签（图 3C，D），如下所示:在"材料"窗口中，选择愈伤组织文件（在步骤 4.1.1.2 中创建），单击屏幕顶部的"选择"选项卡，然后从下拉菜单中选择插值。在"选择"窗口中，单击加号。
   4. 打开在步骤 4.1.1.2 中创建的皮质骨文件。分割皮质骨，包括髓腔，如步骤 4.1.1 和 4.1.2 中针对愈伤组织概述的那样。（图4A，B）。插入轮廓的骨膜皮层以创建皮质骨标签，如步骤4.1.3中为愈伤组织概述的那样（图4C，D）。
   5. 按如下方式计算愈伤组织的轮廓体积和平均灰度值:单击屏幕顶行的 细分 选项卡，然后从下拉菜单中选择 材料统计 。这将生成一个包含所有计算值的表。皮质骨和愈伤组织（减去皮质骨后）的值单独提供。生成表后，单击 导出到工作区 以保存数据。
2. 灰度单位转换为骨密度
   1. 从整个图像中裁剪 4.5 mm HA 模型（图 2B）的 3D 图像，然后单击 分割。HA模型的树脂包含五个小HA圆柱体（图1A）。对于密度最高的 HA 圆柱体，通过目视检查定义第一个和最后一个切片。
   2. 使用画笔工具（图 5A）在第一个和最后一个切片（避开边缘）绘制两个圆，如下所示:在"材料"窗口中，单击 "添加 "四次。右键单击可将材料 3、材料 4、材料 5 和材料 6 分别重命名为虚拟 1、虚拟 2、虚拟 3 和虚拟 4。选择 Phantom1，单击"选择"窗口中的画笔图标，然后使用滑块根据模型的大小调整画笔大小（圆形描摹）的大小（圆圈的大小应小于虚拟的大小）。
   3. 在两个圆之间应用插值以为每个 HA 圆柱体创建一个体积（图 5B），如下所示:在材料窗口中，选择 Phantom1，单击屏幕顶行上的 选择 选项卡，然后从下拉菜单中选择插值。在"选择"窗口中，单击 加号。
   4. 对剩余的三个 HA 圆柱体重复分段过程，从第二高的 HA 密度开始，到第二低的 HA 密度结束（图 5B）。可以排除HA密度最低的圆柱体，因为它通常难以分段。
   5. 使用生成的 3D 标签计算四个分析的 HA 圆柱体的平均灰度值。使用电子表格（参见 材料表）或类似工具，绘制模型制造商提供的平均灰度值和相应的骨矿物质密度 （BMD） 值。使用线性回归生成 BMD 和灰度值之间的相关方程。
3. 矿化愈伤组织的分割和BMD的计算
   1. 根据步骤4.2.5中生成的相关方程和所选的区分矿化和非矿化愈伤组织阈值，确定相应的灰度值阈值。因此，将灰度值大于阈值的愈伤组织区域标记为矿化愈伤组织，并将其余区域标记为未矿化（图6A，B）。在这项研究中，250 mgHA/ccm用作矿化愈伤组织^14,15的阈值。
   2. 计算总愈伤组织和矿化愈伤组织体积。根据这些值，计算骨体积分数（矿化愈伤组织体积归一化为总愈伤组织体积 = BV/TV）。使用总愈伤组织测量的平均灰度值，使用4.2.5中生成的相关方程计算愈伤组织的BMD。
      注意:根据研究目标和用于分析的软件，可以计算其他参数，例如SMI（结构模型指数），小梁厚度和各向异性程度。

图 3:愈伤组织外部边界的分割。 （A） 愈伤组织外边界的轮廓（红线）。（B）在VOI上采样的切片（红色切片）的轮廓。（C） 通过插值（红色体积）创建的 3D 愈伤组织标签。（D）C所示愈伤组织标签的横截面（包括皮质骨）。请点击此处查看此图的大图。

图4:皮质骨的分割。 （A）皮层骨膜表面的轮廓（绿线）。（B）在VOI上采样的切片等高线（绿色切片）。（C）皮质骨（包含髓腔;绿色）和愈伤组织（红色）的3D标签，由骨膜皮层和愈伤组织的插值标签创建。（D）愈伤组织（红色）和皮质骨（包含髓内腔;绿色）的横截面。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:灰度单位到 BMD 的转换。 （A） 第一个和最后一个切片处的 HA 圆柱体轮廓（红色圆圈）。（B） 3D 插补 HA 圆柱体（左）和横截面（右）。棕色:最高 HA 密度;蓝色:第二高的HA密度;紫色:第三高的HA密度;绿色:第四高的 HA 密度。 请点击此处查看此图的大图。

图6:矿化愈伤组织的分割 。 （A）矿化愈伤组织（≥250 mgHA / ccm）显示为蓝色，其余的愈伤组织（<250 mgHA / ccm）显示为红色，与原始骨骼相对应的空间显示为绿色。（B） 每个独立标签的 3D 视图。 请点击此处查看此图的大图。

结果

为了监测骨折愈合过程中的骨形成，在成年雄性C75BL / 6J小鼠中诱导了骨干开放性胫骨骨折。使用髓内钉稳定骨折，这是一种既定的二次愈合模型¹³。在骨折后第14、21和28天收获愈伤组织¹²。这些时间点代表了愈合的不同阶段。继发性骨愈合期间的软骨内骨形成通过纤维软骨（软）愈伤组织的初始形成 进行 ，愈伤组织在后期矿化以减少骨折间隙处的微运动...

讨论

本研究的目的是描述μCT分析的详细方案，目的是准确量化3D矿化愈伤组织结构，这通常是骨和骨折愈合研究的基础。该协议利用通用的最先进的3D图像分析软件平台，该平台有助于图像可视化，分割/标记以及从简单到复杂的测量。

该方案中最耗时的任务是半自动分割愈伤组织，排除皮质骨和髓管。在以前的^{许多研究中，}该区域也被排除在外9,16,17,18。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Fisher chemical	SF100-20	Used for bone tissue fixation
Avizo	Thermo Scientific		Image processing and analysis software
Hydroxyapatite phantom	Micro-CT HA D4.5, QRM	QRM-70128
Image Processing Language	Scanco		Used to convert raw images to DICOM images
Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps	Medline		Used to remove the intramedullary pin
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
Scanco mCT system (vivaCT 40)	Scanco		Used for µCT imaging