マイクロCTを用いた骨折治癒の評価

要約

マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)は、前臨床試験で骨構造を評価するのに役立つ非破壊イメージングツールですが、骨治癒カルスを分析するためのμCT手順についてはコンセンサスがありません。この研究は、骨折治癒のモニタリングを可能にする段階的なμCTプロトコルを提供します。

要約

マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)は、トランスレーショナルサイエンス研究における骨折治癒中の骨および新たに形成された骨の3次元(3D)形態を特徴付けるための最も一般的なイメージングモダリティです。げっ歯類の長骨折治癒の研究には、通常、二次治癒と石灰化カルスの形成が含まれます。形成されたカルスの形状および新たに形成された骨の密度は、時点および治療の間で実質的に異なり得る。無傷の皮質骨および骨梁のパラメータを定量化するための標準的な方法論が広く使用されており、市販のソフトウェアに組み込まれているのに対し、治癒カルスを分析するための手順についてはコンセンサスが欠如している。この研究の目的は、治癒カルスの骨体積分率とカルスミネラル密度を定量化する標準化されたプロトコルを説明することです。このプロトコルでは、イメージング中のサンプルアライメント、対象ボリュームのサイズ、カルスを定義するために輪郭を描くスライスの数など、イメージングおよび分析中に考慮すべきさまざまなパラメーターが記述されています。

概要

マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)イメージングは、前臨床骨研究で広く使用されており、骨の微細構造を評価するための非侵襲的で高解像度の画像を提供しています^1,2,3,4,5。μCTには、回転するサンプルから、または回転するX線源と検出器を使用して取得された多数のX線画像が含まれます。アルゴリズムは、画像スライスのスタックの形式で3D体積データを再構築するために使用されます。臨床CTは人間の骨の3Dイメージングのゴールドスタンダードであり、μCTは実験動物の骨治癒効率を評価するために一般的に使用される技術です¹、^2、3、⁴、^6、7。石灰化した骨はX線に対するコントラストが優れていますが、軟部組織は造影剤を使用しない限りコントラストが比較的低くなります。骨折治癒の評価において、μCTは、石灰化カルスの3D構造と密度に関する詳細情報を提供する画像を生成します。in vivo μCTスキャンは、骨折治癒の縦断的、時間経過的評価にも使用できます。

μCTを用いた無傷の皮質骨および骨梁骨の定量化は、一般的に十分に確立され、標準化されています⁸。前臨床試験では、^{骨折治癒を分析する}ためにさまざまな定量化方法論を使用していますが9,10,11、^カルス定量のためのμCT画像解析の詳細なプロトコルはまだ公開されていません。したがって、この研究の目的は、マイクロCTイメージングと骨治癒カルスの解析のための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供することです。

プロトコル

以下のプロトコルは、安楽死させたマウスから採取した長骨治癒カルスを特徴付けるために開発されました。ただし、ほとんどのステップはラットに適用でき、骨折した骨の in vivo スキャンにも使用できます。このプロトコルは、特定のμCTシステムと特定の画像処理、分析、および視覚化ソフトウェア( 材料表を参照)を記述していますが、方法論は一般的に他のスキャナーやソフトウェアに適用できます。このプロトコルは、ペンシルベニア州立大学医学部の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。本試験で用いたマウスは、16週齢の雄性C57BL/6Jマウス(平均体重31.45±3.2g)であった。

1.組織の採取と保存

注:適切なマウス骨折モデルを使用してください。この研究では、^12,13に記載されている標準プロトコルに従って、中骨幹開放脛骨骨折モデルを使用しました。

1. 骨折モデル実験の最後に、ケタミンまたはキシラジン(それぞれ500 mg / kgまたは50 mg / kg)の腹腔内注射を投与することにより、マウスを安楽死させます。
2. はさみを使用して、骨折部位を乱すことなく、大腿骨中央部から脛骨関節まで骨折した骨を採取します。骨の周囲の筋肉を取り除き、骨と直接接触している軟組織のみを残して、後続の処理ステップで骨折部位を支えます。マイクロモスキートストレート止血鉗子を使用して髄内ピンを取り外します。
3. サンプルをホルマリン(4°C)または生理食塩水(-20°C)で保存します。 保存ビヒクルの選択は、μCTの下流で意図する用途によって異なります。この研究では、サンプルを-20°Cの生理食塩水中で保存しました。

2. マイクロCTスキャン

1. サンプル調製
   1. 複数のサンプルを同時にスキャンするには、最大6つのサンプルをカスタム開発の3Dプリントスキャンフィクスチャ(図1A、B)などに入れます。同時スキャンにより、スキャン時間とコストが削減されます。この研究で使用されたカスタマイズされたフィクスチャには、長骨サンプルを保持するための6つのスロットと、ハイドロキシアパタイト(HA)ファントム用の中央穴が含まれています(図1A、B;材料表)。
      注:HAファントムは、μCTユニット(通常はハウンズフィールド)をHA密度(mgHA / ccm)に変換するステップ4.2(以下を参照)の標準として機能します。
   2. 準備した固定具を、視野の直径(FOV; 図1C)。この研究では、21.5mmの視野に合わせるために20mmの注射器を使用しました。
   3. スキャンプロセス中にサンプルが乾燥するのを防ぐために、シリンジまたはカノニカルチューブにステップ1.3で使用した防腐剤を充填します(この研究では生理食塩水を使用しました)。
2. スキャニング
   1. スキャンする前に、μCT マシンが次のように校正されていることを確認します:μCT FOVの中心線にHAファントムを配置し、ファントムをスキャンし、HAの密度を測定します。測定された密度がメーカーが提供する密度と一致していることを確認してください。
   2. サンプルフィクスチャの中心線をμCT FOVのおおよその中心線に合わせます。これにより、サンプルがFOV内にあり、それらの長軸の向きが結果の画像の軸方向とほぼ一致することが保証されます。
      注:この標準化された配向は、後で分析手順が対象の体積内で考慮される組織の量などの変動を起こしにくくするのに役立ちます。
   3. μCTシステムのスキャンパラメータを設定します(材料表)。この研究で使用されたパラメータは、10.5 μm(等方性ボクセルサイズ)、55 kVp(エネルギー/強度)、145 μA(電流)、および300 ms(積分時間)です。マウスの小柱のおおよその厚さ(20〜60 μm^{)に基づいて}ボクセルサイズを決定します8。スキャンをさまざまなビューで視覚的に検査して、すべてのカルスサンプルの全体積をカバーしていることを確認します。

図1:カスタマイズされたスキャンフィクスチャの構造 。 (A)6つのサンプルスロットを示すスキャンフィクスチャ(上)とHAファントム(下)の画像。(B)専用スロットに配置された長骨サンプル(上)とHAファントム(下)を示す画像。(C)20mmシリンジに入れたスキャンフィクスチャを示す画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3.画像セグメンテーション

注意: RAW画像は自動的に画像シーケンスデータに再構築されます。

1. 画像変換:再構成した画像シーケンスデータを画像処理ソフトウェアを用いてDICOM画像シーケンスに変換します( 材料表参照)。DICOM画像シーケンスをソフトウェア( 材料表を参照)にインポートして、画像処理、解析、および視覚化を行います(図2A)。
2. 画像のトリミング:一度に1つのサンプルで、各画像スタックをトリミングし、サンプル全体がトリミングされたボリュームに含まれていることを確認します(図2B)。トリミングした画像を次のように保存します:画面の左上にある[ ファイル ]タブをクリックし、[ プロジェクトの保存]を選択して、画面に表示されるオプションから [プロジェクトサイズの最小 化]を選択します。ファイルは商用ソフトウェア形式で保存されます。
3. 画像のノイズ除去:次のように、フィルタリング方法を使用してノイズレベルを低減し、ぼやけを回避します。
   1. [ ファイル ] タブをクリックし、[ オープンデータ] を使用して処理する画像を選択します。開いた画像は、画面の左上隅にあるプロジェクトビューウィンドウに表示されます。
   2. 右クリックして[ 画像処理 ]、[ フィルターサンドボックス]の順に選択します。[ 作成] をクリックします。
   3. [プロパティ] ウィンドウ (画面の左下隅) で次の手順を実行します。 プレビューの種類として [データ ] を選択します。[フィルター]の横にあるドロップダウンメニューからフィルタータイプを選択します。解釈のために 3D を選択します。カーネルタイプの横にあるドロップダウンメニューから[ 分離可能 ]を選択します。標準偏差とカーネルサイズ係数に使用する値を、それぞれの横にある使用可能な空のボックスに入力します。[出力]の横にあるドロップダウンメニューから [入力と同じ ]を選択します。[ 適用] をクリックします。
      注:フィルタータイプ(使用可能なオプションは、両側、ボックス、ガウス、中央値、再帰指数、描写、異方性拡散、非局所平均、アンシャープマスキング、FFTフィルター)とパラメーターの選択は、スキャン画像のノイズレベルとボクセルサイズによって異なります。ガウスフィルタの場合、カーネルサイズ係数には3 x 3 x 3と5 x 5 x 5が一般的に使用される値であり、標準偏差⁸には0.5-2.0が一般的に使用されます。本研究では、ガウスフィルタを適用し、カーネルサイズ係数と標準偏差にそれぞれ5 x 5 x 5と0.8を使用しました。
4. 画像の再配置
   メモ: これはオプションの手順です。スキャンプロセス中にイメージングシステムの座標軸に対する長骨サンプルのミスアライメントが発生した場合、デジタルアライメント法を適用してミスアライメントを修正できます(図2C)。
   1. 次のように、サンプルの 3D レンダリング イメージを作成します。プロジェクトビューウィンドウで、フィルタリングされ、トリミングされた画像(手順3.3で作成)を選択します。右クリックして[ ディスプレイ ]を選択し、ドロップダウンメニューから [ボリュームレンダリング ]を選択し、[ 作成]をクリックします。矢状面と正面面で3Dレンダリングされた画像を視覚的に確認します。
   2. レンダリングされたボリュームを手動で回転させて、縦軸の適切な位置合わせを取得します。次のように、回転した画像に変換を適用します:プロパティウィンドウで、変換エディタをクリックし、 変換エディタ-マニピュレータに移動して、ドロップダウンメニューから トランスフォーマー を選択します。これで、サンプルを回転させて再調整できます。再配置プロセスが完了したら、 変換エディタ をもう一度クリックして画像をロックします。
   3. フィルタリングされた画像(手順3.3で作成した)をリサンプリングして、次のように新しい横(軸方向)平面画像スライスを作成します。 プロジェクトビューウィンドウで、手順3.4.2の画像を選択します。右クリックして [ジオメトリ変換 ]を選択し、ドロップダウン メニューから [変換された画像を再サンプル ]を選択して、[ 作成]をクリックします。プロパティウィンドウで、[ データ ]に移動し、次の手順を実行します。 補間の場合は、ドロップダウンメニューから [標準 ]を選択します。モードの場合は、[ 拡張] を選択します。保存するには、[ ボクセル サイズ] を選択します。[パディング値] で、[使用可能な空白] ボックスに「ゼロ」と入力します。次に、[ 適用] をクリックします。
5. 対象ボリューム (VOI) の定義
   1. 横方向の画像スライスを調べて、骨折カルスの中心面を特定します。カルスの近位端と遠位端に基づいてVOIを定義します。カルスの端を定義するのが難しい場合は、カルスの中心面から離れた標準化された距離に基づいてVOIを定義します(図2D)。
      注:骨のリモデリングに先行する治癒段階では、新しく形成された織骨の小柱構造が元の骨の皮質構造とは異なるため、石灰化カルスのエッジを定義するのは簡単です。しかし、リモデリング段階が続くと、新しく形成された骨は徐々に皮質構造を獲得します。したがって、カルスのエッジを定義することはますます困難になります。

図2:画像のセグメンテーション 。 (A)1回のスキャンで6つのサンプルを示す画像。 (B)個々のサンプルを分離するための画像のトリミング。(C)ずれた縦軸(黄色の点線)を補正するデジタルアライメント。(D)VOIとカルス中心面の定義。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 画像解析

1. カルスと皮質骨のセグメンテーション
   1. 次のように、自動トレースおよびトレースエッジオプション(図3A)を備えたセグメンテーションなげなわツールを使用して、カルスの外側の境界を半自動的に輪郭にします。
      1. 変換された画像の再組み立て(ステップ3.4.3)に続いて、画面上から2番目のタブ行にある [セグメンテーション ]タブをクリックします。セグメンテーションエディタウィンドウで、画像の横にあるドロップダウンメニューから変換された画像(手順3.4.3で作成)を選択します。
      2. [マテリアル]ウィンドウで、[ 追加]をダブルクリックします。これにより、マテリアル 3 とマテリアル 4 という名前の 2 つのタブが表示されます。右クリックして、マテリアル3の名前をカルスに、マテリアル4の名前を皮質ボーンに変更します。
      3. 選択ウィンドウで、なげなわアイコンをクリックします。表示されるオプションから、2D モードの場合は [フリーハンド] を選択し、[3D モード] の場合は [内側] を選択し、オプションの場合は [自動トレース] と [エッジのトレース] の両方を選択します。なげなわを使用して、関心のある領域をマークします。
   2. VOI全体でサンプリングされたスライスを使用して、この輪郭形成手順を繰り返します(図3B)。輪郭のあるスライスは、間隔を空けることができます(たとえば、20スライスで区切ります)。
      注:複雑なカルス構造を持つ領域では、輪郭のあるスライス間の間隔を狭めて、より多くのフラグメントをキャプチャすることを検討できます(図3A、B)。
   3. 次のように、輪郭のあるカルスの輪郭を補間して、完全なカルスラベルを作成します(図3C、D)。 [マテリアル]ウィンドウで、カルスファイル(手順4.1.1.2で作成)を選択し、画面上部の[ 選択 ]タブをクリックして、ドロップダウンメニューから[ 補間 ]を選択します。[選択] ウィンドウで、 プラス記号をクリックします。
   4. 手順 4.1.1.2 で作成した 皮質ボーン ファイルを開きます。ステップ4.1.1および4.1.2でカルスについて概説したように、髄腔を含む皮質骨をセグメント化します。(図4A、B)。輪郭のある骨膜皮質を補間して、ステップ4.1.3でカルスについて概説した皮質骨ラベルを作成します(図4C、D)。
   5. カルスの輪郭体積と平均グレー値を次のように計算します:画面の一番上の行にある[ セグメンテーション ]タブをクリックし、ドロップダウンメニューから [材料統計 ]を選択します。これにより、すべての計算値を含むテーブルが生成されます。皮質骨とカルスの値(皮質骨を差し引いた後)は別々に提供されます。テーブルが生成されたら、[ ワークスペースにエクスポート] をクリックしてデータを保存します。
2. グレースケール単位の骨塩密度への変換
   1. 画像全体から4.5 mm HAファントム(図2B)の3D画像を切り抜き、[ セグメンテーション]をクリックします。HA ファントムの樹脂には、5 つの小さな HA シリンダが含まれています(図 1A)。密度が最も高い HA シリンダの場合、最初と最後のスライスを目視検査で定義します。
   2. 次のように、ブラシツール(図5A)を使用して、最初と最後のスライス(エッジを避けて)に2つの円を描画します。 右クリックして、マテリアル 3、マテリアル 4、マテリアル 5、マテリアル 6 の名前をそれぞれファントム 1、ファントム 2、ファントム 3、ファントム 4 に変更します。 Phantom1を選択し、[選択]ウィンドウのブラシアイコンをクリックし、スライダーを使用して、ファントムのサイズに基づいてブラシサイズ(円形トレース)を調整します(円のサイズはファントムのサイズよりも小さくする必要があります)。
   3. 2つの円の間に補間を適用して、次のように各HAシリンダのボリュームを作成します(図5B)。 [マテリアル]ウィンドウで[ Phantom1]を選択し、画面の一番上の行にある [選択 ]タブをクリックして、ドロップダウン メニューから[補間]を選択します。[選択] ウィンドウで、 プラス記号をクリックします。
   4. 残りの 3 つの HA シリンダで、2 番目に高い HA 密度から開始し、2 番目に低い HA 密度で終了して、セグメンテーション プロセスを繰り返します(図 5B)。HA 密度が最も低いシリンダは、セグメント化が困難な場合が多いため、除外できます。
   5. 生成された 3D ラベルを使用して、分析された 4 つの HA シリンダの平均グレー値を計算します。スプレッドシート( 材料表を参照)などを使用して、ファントムメーカーから提供された平均グレー値と対応する骨塩密度(BMD)値をプロットします。線形回帰を使用して、BMDとグレー値の間の相関式を生成します。
3. 石灰化カルスのセグメンテーションとBMDの計算
   1. ステップ4.2.5で生成された相関式と、石灰化カルスと非石灰化カルスを区別する選択された閾値に基づいて、対応するグレー値閾値を決定する。したがって、閾値より大きいグレー値を持つカルス領域に石灰化カルスとしてラベルを付け、残りを石灰化されていないものとしてラベル付けします(図6A、B)。この研究では、石灰化カルスの閾値として250 mgHA / ccmを使用しました^14,15。
   2. カルスと石灰化カルスの総量を計算します。これらの値に基づいて、骨体積分率(総カルス体積= BV / TVに正規化された石灰化カルス体積)を計算します。総カルスの測定平均グレー値を使用して、4.2.5で生成された相関式を使用してカルスのBMDを計算します。
      注:研究の目的と分析に使用されるソフトウェアに基づいて、SMI(構造モデルインデックス)、小柱の厚さ、異方性の程度などの他のパラメータを計算できます。

図3:カルスの外側境界のセグメンテーション。 (A)カルスの外側境界の輪郭(赤線)。(B)VOI全体でサンプリングされたスライス(赤いスライス)の輪郭。(C)補間によって作成された3Dカルスラベル(赤いボリューム)。(D)Cで示したカルス標識の断面(皮質骨を含む)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:皮質骨のセグメンテーション。 (A)皮質の骨膜表面の輪郭(緑色の線)。(B)VOI全体でサンプリングされたスライス(緑色のスライス)の輪郭。(C)皮質骨(髄腔を含む;緑)とカルス(赤)の3Dラベルは、骨膜皮質とカルスの補間ラベルから作成されました。(D)カルス(赤)と皮質骨(髄内腔を含む;緑)の断面。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:グレースケールユニットのBMDへの変換 。 (A)最初と最後のスライス(赤い円)のHAシリンダーの輪郭。(B)3D補間されたHAシリンダー(左)と断面図(右)。ブラウン:最高のHA密度。青:2番目に高いHA密度。バイオレット:3番目に高いHA密度。緑:4番目に高いHA密度。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:石灰化カルスのセグメンテーション 。 (A)石灰化カルス(≥250 mgHA/ccm)を青色、残りのカルス(<250 mgHA/ccm)を赤色、元の骨に対応する空間を緑色で示しています。(B)各単離ラベルの3Dビュー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

骨折治癒中の骨形成をモニターするために、成体の雄C75BL / 6Jマウスに中骨幹開放脛骨骨折が誘発されました。骨折は、二次治癒の確立されたモデルである髄内釘を使用して安定化されました¹³。カルス組織は、骨折後¹²日目の14、21、および28日目に採取した。これらの時点は、癒しのさまざまな段階を表しています。二次骨治癒中の軟骨内骨形成は、線維?...

ディスカッション

この研究の目的は、骨および骨折治癒研究においてしばしば基本となる3D石灰化カルス構造の正確な定量化を目的としたμCT分析の詳細なプロトコルを説明することです。このプロトコルは、画像の視覚化、セグメンテーション/ラベリング、および単純なものから複雑なものまでの測定を容易にする汎用の最先端の3D画像解析ソフトウェアプラットフォームを利用しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Fisher chemical	SF100-20	Used for bone tissue fixation
Avizo	Thermo Scientific		Image processing and analysis software
Hydroxyapatite phantom	Micro-CT HA D4.5, QRM	QRM-70128
Image Processing Language	Scanco		Used to convert raw images to DICOM images
Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps	Medline		Used to remove the intramedullary pin
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
Scanco mCT system (vivaCT 40)	Scanco		Used for µCT imaging