从临床样本中自动分离和收集癌症相关物质

摘要

本文描述了自动化设备在轻松有效地从全血中分离和收集物质（如无细胞 DNA 和循环肿瘤细胞）的应用。

摘要

最近，液体活检已被用于诊断各种疾病，包括癌症。体液含有许多物质，包括来自正常组织的细胞、蛋白质和核酸，但其中一些物质也来自患病区域。体液中这些物质的调查和分析在各种疾病的诊断中起着举足轻重的作用。因此，准确分离所需物质非常重要，为此开发了几种技术。

我们开发了一种名为CD-PRIME的光盘实验室类型的设备和平台。该设备是自动化的，在样品污染和样品稳定性方面具有良好的结果。此外，它具有采集良率好、操作时间短、重现性高等优点。此外，根据要安装的椎间盘类型，可以分离含有游离DNA的血浆，循环肿瘤细胞，外周血单核细胞或血沉棕黄层。因此，体液中存在的各种材料的采集可以用于各种下游应用，包括组学研究。

引言

早期准确地发现包括癌症在内的各种疾病是建立治疗策略的最重要因素¹，²，^3，4。特别是，癌症的早期发现^{与患者生存}机会的增加密切相关5，⁶，^7，8。最近，液体活检已成为早期发现癌症的焦点。实体瘤经历血管生成并将各种物质释放到血液中。特别是，在^{癌症患者的血液中}发现了循环DNA（ctDNA），循环RNA（ctRNA），蛋白质，外泌体等囊泡和循环肿瘤细胞（CTC）2^，9。尽管这些物质的含量存在差异，但它们不仅在早期阶段而且在后期阶段都一致观察到6^，10。然而，这些个体差异非常高;例如，含有ctDNA的无细胞DNA（cfDNA）的量小于1，000ng，来自^{癌症患者的}10 mL全血中的CTC数量小于100 11，^12，13。许多研究已经使用这些含量较少的物质（即cfDNA，ctDNA和CTC）来表征癌症。为了获得准确的结果，准确分离少量高纯度^13，14的物质非常重要。通常使用传统的离心方法，但根据用户的技能，它们难以处理且纯度低。自CTCs被发现以来，已经开发了几种分离技术，例如离心或密度级分离，免疫珠和微流体方法。自发现CTC以来，已经开发了几种遏制技术。然而，当需要从用于分离细胞的各种芯片和膜中分离细胞时，这些技术通常受到限制¹⁵。此外，标记方法需要FACS等设备，并且由于标记污染，下游过程存在限制。

最近，液体活检的使用有所增加，并且正在进行各种研究以早期发现癌症。虽然这种方法很简单，但在下游分析中仍然存在困难，各种研究都在试图克服这些困难^16，17。此外，包括医院在内的许多场所都需要自动化、可重复和高纯度、易于使用的方法。在这里，我们开发了一种光盘实验室，用于在液体活检后自动分离血液样本中的物质。这些设备基于离心、微流体和孔径细胞捕获的原理。有三种类型的椎间盘:LBx-1 可以获取血浆和血沉棕黄层，而 LBx-2 可以从体积小于 10 mL 的全血中获取血浆和 PBMC;FAST-auto还可以使用可从光盘上去除的膜来获取CTC。每次运行最多可使用四个光盘。最重要的是，这种装置和方法的优点是它可以使用少量血液从同一样本中获得多种癌症衍生物质。这意味着患者的血液只需要抽一次。此外，它还具有排除由于血液采样时间差异而导致的错误的优点。该平台易于使用，可为液体活检和下游应用提供准确的结果。在此协议中，介绍了设备和墨盒的使用。

研究方案

所有全血样本均取自肺癌患者。Clinomics的研究和分析由癌症基因组学研究所进行，政府的IRB研究批准由牙山医学中心机构审查委员会（IRB NO. 2021-0802）领导，IRB编号在Clinomics注册用于研究。

1. 样品制备

1. 将 9 mL 全血收集到 EDTA 或 cfDNA 稳定的采血管中。
2. 通过上下翻转试管约 10 次来充分混合。
3. 将样品储存在室温（RT;用于短期储存）或4°C（用于长期储存）。不要冷冻和解冻。

2. 设备准备

1. 按下电源开关打开仪器。
   注意: 触摸板上出现加载屏幕，仪器已初始化。在初始化过程中，双手远离仪器。仪器初始化完成后，将出现墨盒选择屏幕。
2. 选择要使用的采样模式。按箭头更改样本数。

3. 设备操作和样品采集

1. 装载 LBx-1 墨盒
   1. 在仪器的触摸屏面板上选择墨盒类型。通过按箭头按钮更改样本数。
   2. 打开仪器的门，按照墨盒支架上的编号顺序插入所有要使用的墨盒。确保正确插入墨盒和墨盒支架。如果墨盒插入不正确，可能会对仪器造成相当大的损坏。
   3. 对于总共四个墨盒，请将虚拟墨盒放在墨盒支架的空白处。
   4. 使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。
   5. 关上门，然后按触摸板屏幕上的 RUN 按钮。仪器关闭滤芯上的阀门，大约需要 30 秒。
   6. 按照消息打开门，卸下支撑轮，然后从阀式磁带盒支架上卸下阀门关闭的滤芯。
   7. 将墨盒放在桌子上，准备注射全血样本。使用血清移液器最多吸取 10 mL 的全血样品。
      注意:处理血液的危险。在处理血液样本和试剂的整个过程中，穿上实验室外套和实验室手套非常重要。实验室工作人员应彻底研究所提供的MSDS。
   8. 将移液器吸头深深插入墨盒的样品入口，然后缓慢注入全血样品。
      注意 当使用大于或等于 9 mL 的全血样本时，无需添加磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。当使用少于 9 mL 的全血样本时，添加 PBS 以使总体积达到 9 mL。例如，当使用 7.2 mL 全血时，请将 1.8 mL PBS 添加到样品入口中。血清移液器或移液器吸头可用于注射全血和PBS。当使用少于 8 mL 的全血样本时，即使添加 1 mL PBS 也可能无法恢复血沉棕黄层。对于 gDNA 制备，使用 200 μL 全血，在此步骤之前分离。
   9. 按墨盒支架上的编号顺序插入要使用的墨盒。使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。关上门，然后按 "确定" 按钮。
      注意:血浆和血沉棕黄层自动与全血分离，大约需要30分钟。
      注意操作过程中的危险。在高速旋转操作期间打开门或触摸仪器可能会导致严重伤害。由于转子的不对称负载，也存在受伤的风险。如果仪器在辅助细胞富集或专家模式下启动时出现异常振动和噪音，则墨盒放置可能不对称。立即按电源键停止并正确安装墨盒。
   10. 在屏幕上查找带有警报声音的消息，该消息在血浆和血沉棕黄层的分离完成后出现。
   11. 通过打开门或按停止按钮 停止 警报。打开门，取出墨盒，然后将其放在桌子上。
   12. 使用 1 mL 移液器吸头从血浆出口回收 3 mL 血浆。使用 1 mL 移液器吸头从血沉棕黄层出口回收 3 mL 的血沉棕黄层。
2. 装载 LBx-2 墨盒
   1. 在仪器的触摸屏面板上选择墨盒名称。通过按箭头按钮更改样本数。
   2. 打开门，按墨盒支架上的编号顺序插入要使用的墨盒。
   3. 对于总共四个墨盒，请将虚拟墨盒放在墨盒支架的空白处。
   4. 使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。确保将墨盒正确插入墨盒支架。如果墨盒插入不正确，可能会对仪器造成相当大的损坏。
   5. 关上门，然后按触摸板屏幕上的 RUN 按钮。仪器关闭滤芯上的阀门，大约需要 30 秒。
   6. 按照消息打开门，卸下支撑轮，然后从墨盒支架上取下阀门关闭的墨盒并将其放在桌子上。
   7. 将墨盒放在桌子上，准备注入密度梯度溶液和全血样品。根据全血样品的体积检查要注射的密度梯度溶液和PBS的体积（补充表1）。
   8. 使用血清移液器移液密度梯度溶液。将移液器吸头深深插入墨盒的入口，然后缓慢注入密度梯度溶液。
   9. 注入密度梯度溶液后，使用血清移液器移取全血样品。将移液器吸头深深插入墨盒的样品入口，然后缓慢注入全血样品。
      注意:当使用少于9 mL的全血样本时，请参阅此表添加PBS（补充表1）。
   10. 根据墨盒支架上的编号按顺序插入要使用的墨盒。使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。关上门，然后按 "确定" 按钮。
   11. 血浆和PBMC自动从全血中分离，大约需要30分钟。查找等离子体和PBMC分离完成后出现的警报声消息。
   12. 通过打开门或按停止按钮 停止 警报。打开门，取出墨盒，然后将其放在桌子上。
   13. 使用 1 mL 移液器吸头从血浆出口回收 3 mL 血浆。使用 1 mL 移液器吸头从 PBMC 出口回收 3 mL PBMC。
3. 装载快速自动墨盒
   1. 在仪器的触摸屏面板上选择墨盒。通过按箭头按钮更改样本数。
   2. 打开门，按墨盒支架上的编号顺序插入要使用的墨盒。对于总共四个墨盒，请将虚拟墨盒放在墨盒支架的空白处。
   3. 使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。
   4. 关上门，然后按触摸板屏幕上的 RUN 按钮。仪器关闭滤芯上的阀门，大约需要 30 秒。
   5. 按照消息打开门，卸下支撑轮，然后从阀式磁带盒支架上卸下阀门关闭的滤芯。
   6. 将墨盒放在桌子上，准备注射PBS溶液和全血样本。使用血清移液器移取 6 mL PBS 溶液。将移液器吸头深深插入小柱的PBS入口，然后缓慢注入6 mL的PBS溶液。
   7. 注射PBS溶液后，使用血清移液器移取从LBx-2获得的3 mL全血或PBMC样品，先前用1%BSA冲洗以防止残留物粘连。将移液器吸头深深插入墨盒的样品入口，然后缓慢注入全血样品。
   8. 按墨盒支架上的编号顺序插入要使用的墨盒。使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。关上门，然后按 "确定" 按钮。
   9. CTC自动从全血中富集，大约需要15分钟。查找在 CTC 富集完成时伴随警报声显示的消息。通过打开门或按停止按钮 停止 警报。
   10. 打开门，取出墨盒，然后将其放在桌子上。将背板去除器 （BPR） 插入墨盒正面的四个孔中。用双手拇指按压深蓝色的机翼，然后按压浅蓝色的机身，直到它发出咔嗒声。
   11. 提起墨盒主体，小心地将其卸下。使用镊子非常轻柔地捡起边缘的滤膜。请确保使用滤膜的外缘（1毫米宽的边缘部分）捏住滤膜。
   12. 小心地将滤膜（富集的CTC驻留在其上）放入1.5 mL管中以进行核酸制备。如有必要，使用 1 mL 移液器吸头将过滤后的血液回收到出血口。

4. 系统的维护

1. 准备仪器的清洁和消毒
   1. 使用乙醇和干燥的组织每周清洁仪器和附件的所有可接近表面一次，并在污染时立即清洁。
   2. 定期使用酒精（乙醇和异丙醇）或酒精类消毒剂清洁转鼓和转子轴。
2. 清洁和消毒仪器
   注:有关计算机上的一般故障排除和其他说明，请参阅 补充表 2。
   1. 使用主电源开关关闭仪器。断开电源插头与电源的连接。
   2. 打开门，使用湿布和推荐的清洁剂清洁和消毒仪器的所有可接触表面，包括电源线。
   3. 检查转子轴是否损坏。检查仪器是否腐蚀和损坏。
   4. 仅当仪器内外完全干燥时，才将仪器连接到电源。
3. 断开主电源插头并卸下保险丝座。保险丝座位于电源插座上方。用容器中的备用保险丝更换用过的保险丝。

结果

该技术的目标是轻松自动地从全血中分离出癌症相关物质。特别是，任何人都可以在所有合适的研究和分析领域使用这种技术。在液体活检中，在单个血液样本中同时且可重复地分离多种物质具有重要意义。LBx-1 和 LBx-2 椎间盘用于从全血中分离血浆和血沉棕黄层或 PBMC。 图1 显示了通过应用该器件分离的材料。首先，使用LBx-1从10mL血液中获得血浆，或使用LBx-2获得PBMC。其次?...

讨论

cfDNA和CTC的数量和浓度取决于癌症的个体，分期和类型。这也取决于患者²，⁴，⁵，^10，20的状况。特别是在癌症的早期或癌前阶段，癌症相关物质的浓度非常低，因此很有可能无法检测到。然而，早期发现对患者生存和治疗策略的建立具有非常积极的影响。由于cfDNA和CTC在血液...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157